- Abstract
- 1. Inleiding
- 2. Principe van Microlens Immunoassay
- 3. Structuur en functies van een microlens immunoassay-instrument
- 3.1. Parallel Light Irradiation System
- 3.2. High-Resolution Autofocus Imaging System
- 3.3. Automatisch Intelligent Beeldherkennings- en Analysesysteem
- 3.4. Temperatuurregelsysteem
- 3.5. Microlens Test Plate
- 4. Toepassing van het Immune Microsphere Imaging System
- 4.1. Meting van Antigeen-Antilichaam Reactie
- 4.2. Meting van klinische monsters
- 5. Feasibility of the Immune Microsphere Imaging for Antigen and Antibody Detection
- 6. Conclusies
- Conflicts of Interest
- Bijdragen van auteurs
- Acknowledgments
Abstract
Detectie en analyse van antigeen-antilichaam reactie is een van de meest kritische detectietechnieken op het gebied van geneeskunde, biologie, milieuwetenschap, en voedselveiligheid. Traditionele en klassieke methoden voor het opsporen van antigeen en antilichaam stuiten op veel problemen, zoals tijdrovend, hoge kosten, en lage nauwkeurigheid. Een nieuwe immuun microsfeer beeldvormingstechniek door de microlens wordt gebruikt om de veranderingen van brekingsindex te testen voor en na antigeen-antilichaam reactie. Het kan snel kwalitatieve en kwantitatieve bepaling voor antigeen-antilichaam reactie zonder enige etikettering, premodificatie, post-wassen, en dure enzymen. Hier bespreken wij het principe en de voordelen, de structuur van een microlens immunoassay instrument, en het potentieel in het meten van klinische monsters. Het is veelbelovend om te worden ontwikkeld voor toepassing op de diagnose van klinische ziekten.
1. Inleiding
Gemeenschappelijke technieken die tegenwoordig beschikbaar zijn voor antigeen- en antilichaamdetectie omvatten enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), oppervlakteplasmonresonantie (SPR), radioimmunoassay (RIA), colloïdaal goud immuunchromatografische assay (GICT), indirecte immunofluorescentie assay (IFA), chemiluminescentie immuunassay (CLIA), en particle-enhanced turbidimetric immunoassay (PETIA). ELISA combineert de versterking van de enzym-gekatalyseerde reactie en de specifieke reactie van het antigeen en het antilichaam met hoge nauwkeurigheid en lage kosten, maar de procedures zijn gecompliceerd met strenge conditionele controle . SPR werd in de jaren negentig ontwikkeld om de interactie tussen biomoleculen en andere moleculen te detecteren; het vereist geen etikettering en kan snel resultaat opleveren, maar de apparatuur is duur en vereist een groot monstervolume. RIA heeft de kenmerken van hoge gevoeligheid, betrouwbaarheid en vereist weinig monstervolume. Het wordt wijd gebruikt in de opsporing van proteïne, enzym, en andere molecules, maar de radionuclide is schadelijk voor gezondheid en verandert ook biologische activiteiten van steekproeven, die tot experimentele fout leiden. Als een nieuw type immunoassaytechniek en een van de meest gebruikte methoden voor het opsporen van antigenen en antilichamen, is GICT gemakkelijk, eenvoudig en snel met lage kosten, maar de steekproefgrootte is beperkt met lage gevoeligheid . CLIA, IFA en PETIA worden ook veel gebruikt voor het opsporen van antigeen en antilichaam. Hun gemeenschappelijke voordelen zijn zeer nauwkeurig, stabiel, gemakkelijk, en snel, maar met hoge kosten en groot monstervolume.
Een immuun microlens imaging techniek om de verandering van brekingsindex te testen kan de beperkingen van de bovenstaande methoden doorbreken. Het is snel, gevoelig, en eenvoudig met niet-vervuiling en lage kosten voor het opsporen en naar verwachting op grote schaal worden toegepast op de primaire medische instellingen . Deze techniek bestaat uit parallelle lichtbestraling, hoge-resolutie camera, intelligente analyse software, autofocus, en temperatuurregeling systemen met een multiwell microlens monster test plaat en kan multipass detectie van antigeen en antilichaam te bereiken. De hoge-resolutie camera systeem kan voldoen aan de eisen van microlens beeldvorming, en het gebruik van temperatuur controller, autofocus, en automatische intelligente analyse systemen kunnen sterk verminderen fouten in experimenten voor een nauwkeurige meting.
2. Principe van Microlens Immunoassay
Microlens is een cilindrische lens met een uiteinde van sferische oppervlak en het andere uiteinde is een vlak oppervlak. Het heeft een sterk versterkingseffect en verbetert beduidend de beeldvormingscapaciteit van traditionele optische microscoop. Wanneer een microlens met een straal van en een brekingsindex (RI) van wordt ondergedompeld in een oplossing van () en verlicht door vlak licht, als gevolg van het effect van breking, het beeld is een ronde met een donkere ring aan de rand . Het verband tussen de straal van de heldere vlek in het beeld en andere parameters zoals , , en de cilinderhoogte van de microlens wordt als volgt weergegeven :waarbij de invalshoek van het licht op de bolvormige top van de microlens is en . Op basis van deze formule kunnen de ogenblikkelijke veranderingen van het medium worden bepaald door de straal van de heldere vlek in de beeldvorming en de straal van de microlens te meten. Aangezien de optische breking met de snelheid van licht plaatsvindt, kan om het even welke onmiddellijke variatie RI in het omringende middel van een microlens onmiddellijk een verandering in de straal van de centrale lichte vlek veroorzaken. Daarom kan de methode onmiddellijke RI/concentratieverandering met een hoge-snelheidscamera voor de beeldvorming controleren (figuur 1).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3. Structuur en functies van een microlens immunoassay-instrument
Zoals getoond in Figuur 2, vormen een parallelle lichtbron, hoge-resolutie beeldvorming, automatische intelligente analyse, autofocus en temperatuurcontrolesystemen, en een multiwell microlens testplaat een microsfeer immunoassay-instrument. Wanneer de parallelle lichtbron parallel licht naar de microlens uitzendt, verkrijgt het autofocus-beeldvormingssysteem met hoge resolutie in milliseconden een beeld in focus. Vervolgens wordt de beeldvorming van de immuunmicrosfeer geanalyseerd door het intelligente analysesoftwaresysteem om waarden van en alsmede de concentratie van antigeen/antilichaam af te leiden. De functie van het temperatuurregelsysteem is het instellen van verschillende temperaturen die vereist zijn voor verschillende antigeen-antilichaamreacties. Het gehele proces neemt niet meer dan 2 minuten in beslag.
3.1. Parallel Light Irradiation System
LED als bron van parallel licht produceert een cilindrisch parallel verlichtingsgebied, dat vergelijkbaar is met een originele condensator met voordelen van lage kosten, lange levensduur, perfecte lichtgevende prestaties, en kleine schaal. Zoals getoond in Figuur 3, kan het daadwerkelijke parallelle licht worden ontvangen toe te schrijven aan de breking van lens. In het bestralingsgebied van de LED kan de lens de richting en de verdeling van het licht veranderen door de relevante lens zo te configureren dat het eigenlijke parallelle licht wordt verkregen (figuur 3).
3.2. High-Resolution Autofocus Imaging System
Dit systeem bestaat uit een digitale camera met hoge snelheid en een autofocussysteem. Op dit moment heeft de beeldsnelheid van sommige commerciële digitale camera’s de 10.000 beelden per seconde overschreden. Daarom kan het hoge-resolutiebeeldvormingssysteem het toezicht in real time op dynamische veranderingen van RI in de oplossing bereiken. Een hoge-pixel CCD camera speelt een belangrijke rol bij het verkrijgen van een hoge-resolutie microlens beeldvorming. De kernen van het autofocussysteem bestaan uit beeldidentificatie, beeldverwerking, en controledelen. De door het camerasysteem verzamelde beelden worden geanalyseerd, en de evaluatie van de helderheid wordt weergegeven. Volgens deze evaluatie, wordt het systeem automatisch naar een geschikt gebied of een geschikte richting gedreven tot de resolutie van de verworven beelden aan de vooraf ingestelde eis voldoet.
3.3. Automatisch Intelligent Beeldherkennings- en Analysesysteem
Het automatische intelligente analysesysteem voert hoofdzakelijk beeldherkenning en gegevensanalyse op de microlensbeeldvorming uit om de onmiddellijke variatie van in zijn beeld te controleren en daardoor de brekingsindexverandering van de steekproefoplossing tijdens het antigeen-antilichaamreactieproces af te leiden. De nauwkeurigheid hangt nauw samen met de beeldkwaliteit, en parameters zoals pixel, pixelgrootte en resolutie hebben een directe invloed op de meting van de RI . Als de CCD digitale camera met ≥10 miljoen pixel en kleine pixelgrootte die minder dan 3 nm bereikt en een microlens met straal van 600 μm worden geëxploiteerd, wordt de brekingsindexverandering bepaald door veranderingen van de verhouding van de centrumheldere vlek en de verhouding van de buitenringstraal zodat de gemeten brekingsindexverandering 10-6 kan bereiken .
3.4. Temperatuurregelsysteem
Het temperatuurregelsysteem is een transparant gehard glasbord met een dunne film van indiumtinoxide en gecontroleerd door een hoge nauwkeurigheid van een PID (proportioneel-integraal-afgeleide) temperatuurregelaar. Het laat de temperatuur van het monster in de multiwell microlens testplaat toe om snel een vastgestelde waarde in 2 min te bereiken en binnen veranderingswaaier van 0.1°C te worden gehandhaafd voor het maken van antigeen-antilichaam reactie efficiënt .
3.5. Microlens Test Plate
Een multiwell microlens plaat is speciaal ontworpen voor een microlens immunoassay instrument. De plaat is gemaakt van polymethylmethacrylaat (PMMA) materiaal en wordt over het algemeen geprepareerd als 2 of 16 trapeziumvormige wells om aan verschillende detectie-eisen te voldoen. In elke well bevindt zich aan de onderzijde een microlens met een straal van enkele honderden microns. Toepassing van de microlensplaat biedt een objectieve voorwaarde voor meerkanaalsdetectie. Aangezien de diameter van de onderkant van de well slechts ongeveer 2 mm bedraagt, zijn verscheidene microliters monsteroplossing voldoende om de microlens te laten verdrinken voor antigeen-antilichaamdetectie.
4. Toepassing van het Immune Microsphere Imaging System
4.1. Meting van Antigeen-Antilichaam Reactie
Huang en zijn collega’s detecteerden verschillende types van antigeen-antilichaam reacties en ontdekten hun regelmatige kenmerken. Ten eerste veranderde de brekingsindex met de reactietijd in het proces van antigeen (Ag)-antilichaam (Ab) reactie. Ten tweede waren er drie fasen in de variatie van RI met de reactietijd, waaronder snel toenemende, relatief stabiele, en langzaam afnemende perioden. De eerste fase hield verband met de combinatie van Ag en Ab, zodat de RI plotseling toenam met de snelle combinatie van Ag en Ab om complexen te vormen. Het maximum van RI is in de tweede fase. Ten derde had de concentratie van Ag of Ab een grote invloed op de RI. Dus, door het verkrijgen van de RI verandering als een functie van de Ag of Ab concentratie, kan hun inhoud in geteste monsters worden berekend door fitting curve. Ten vierde zouden verschillende antilichamen, zoals capture Ab en probing Ab, ook de variatie van RI beïnvloeden. Door deze techniek te gebruiken om antigeen-antilichaamreacties te meten met verschillende Ag-Ab systemen, kunnen de relaties tussen de verandering van de brekingsindex en de concentraties van verschillende types van antigeen-antilichaamoplossingen (interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, placenta alkalische fosfatase (PAP) Ag-Ab, kallikreïne 6 (KLK6) Ag-Ab, humaan choriongonadotrofine (HCG) Ag-Ab, cardiaal troponine (cTnI) Ag-Ab, vetzuurbindende proteïnen (FABP) Ag-Ab, en C-reactief proteïne (CRP) Ag-Ab oplossingen) konden worden verkregen (figuur 4). Aangezien we weten dat de associatie en dissociatie van het antigeen-antilichaamcomplex een dynamisch proces is, kan op basis van de curve van RI vs. tijd en berekening van de afgeleide van met de tijd, kan men ook informatie verkrijgen over de associatie- en dissociatiesnelheidsconstanten en (figuur 4(a)) en andere thermodynamische parameters met behulp van de volgende vergelijking:
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4.2. Meting van klinische monsters
De immuun microsfeer beeldvormingstechniek werd verder gebruikt om klinische monsters te testen. 36 klinische monsters werden gedetecteerd door deze voor concentraties van CRP Ag. De relatieve standaardafwijking is ongeveer 2-10% in vergelijking met immunochromatografie, en de correlatiecoëfficiënt tussen de resultaten verkregen door de twee manieren bereikt zo hoog als 0,989 (figuur 5). Het is bekend dat klinisch hemolyzed serummonsters een grote invloed kunnen hebben op de nauwkeurigheid van de resultaten die met de traditionele methoden worden verkregen. Daarentegen zijn de beelden van de microlens in hemolyzed monsters nog steeds duidelijk door deze techniek. De relatieve fouten tussen de gedetecteerde antigeenwaarden in de monsters met hemolyse en die zonder hemolyse zijn slechts ongeveer 2%, wat wijst op de geringere invloed van de hemolyzed serummonsters op de nauwkeurigheid van de resultaten .
5. Feasibility of the Immune Microsphere Imaging for Antigen and Antibody Detection
De meeste antigenen zijn eiwitten, terwijl enkele polysacchariden, nucleïnezuren en andere stoffen zijn, en alle antilichamen zijn eiwitten. Aangezien het eiwit een grote hoeveelheid amido en carboxyl bevat, zorgen deze polaire groepen ervoor dat de colloïdale deeltjes een elektrische lading produceren als gevolg van de elektrostatische werking, en de deeltjes met dezelfde lading werden elkaar afgestoten. Tegelijkertijd reageren de polaire groepen die sterk hydrofiel zijn met watermoleculen en vormen een hydratatielaag om een hydrofiele colloïde te produceren, ervoor zorgend dat het eiwit niet agglomereert om een neerslag te vormen, zodat de colloïdale deeltjes gelijkmatig in een oplossing worden verspreid.
Wanneer antigeen met antilichaam wordt gecombineerd, vermindert of verdwijnt de elektrische lading van colloïdale deeltjes, en de hydratatielaag verdwijnt ook of wordt dun. Het eiwit verandert van hydrofiel in hydrofoob colloïde. In het milieu van elektrolyt, agglomereren de colloïdale deeltjes verder om de antigeen-antilichaam complexen te vormen die door de ogen kunnen worden gerealiseerd . De brekingsindexen van de hydrofiele en hydrofobe colloïden zijn opmerkelijk verschillend. Daarom kan deze techniek dynamische veranderingen van de brekingsindex volgen om te beoordelen of er antigeen- en antilichaamreacties in een oplossing optreden. Er kan een standaardkromme worden opgesteld volgens een verband tussen de antigeen- en antilichaamconcentratie en hun reactietijd. Het complex wordt groter naarmate de antigeen-antilichaamreactie vordert, en de verandering van de brekingsindex wordt ook duidelijker. Met behulp van de standaard curve, is het gemakkelijk om de concentratie van het gedetecteerde antilichaam of antigen.
Het werd aangetoond dat een antilichaam dat complementair is aan epitopen van verschillende antigenen inderdaad zou induceren soortgelijke RI toename in Ag-Ab reactie met de microlens imaging immunoassay. Zoals getoond in Figuren 4(b) en 4(c), werden antigeen metingen uitgevoerd met capture Ab en probing Ab of monoklonaal Ab en polyklonaal Ab voor een bepaald antigeen. Uit de curven blijkt dat er geen significant verschil is tussen de twee soorten antilichamen in het opwekken van verandering tijdens de Ag-Ab reactie, wat aangeeft dat de microlens imaging immunoassay verschillende soorten antilichamen kan gebruiken, hetzij capture of probing Ab en monoklonaal of polyklonaal Ab voor detectie. Niettemin wordt de voorkeur gegeven aan monoklonaal Ab voor immunoassay met microlens voor beeldvorming, omdat dit niet alleen een grotere induceert in reactie door zijn hogere affiniteit met antigeen, maar ook de mogelijkheid van kruisreactie vals-positief vermindert, zodat antigenen bij lagere concentraties kunnen worden gedetecteerd. Over het geheel genomen is kruisreactie bij deze techniek theoretisch onvermijdelijk, net als bij andere middelen die bij immunoassays worden gebruikt. Met andere woorden, de specificiteit van de beeldvorming met immuunmicroscopen hangt volledig af van die van geselecteerde antilichamen tegen het doelantigeen. Daarom is het zeer belangrijk om uit te screenen geschikte antilichamen en het optimaliseren van de Ag-Ab reactie system.
6. Conclusies
Deze immuun microlens imaging techniek kan snel en nauwkeurig meten van de RI van verschillende monsters en real-time veranderingen van de RI te controleren in het proces van antigeen en antilichaam reactie. Het RI verandert met veranderingen van de concentratie van het Ag of Ab. Aldus, volgens de RI verandering als functie van de Ag of Ab concentratie, kan de inhoud van steekproeven kwalitatief en kwantitatief worden berekend zonder enige etikettering, voormodificatie, post-wassing, en dure enzymen. Vergeleken met conventionele detectiemethoden zijn de voordelen van deze methode: nauwkeurig, betrouwbaar, snel (binnen enkele minuten klaar) en eenvoudig zonder vervuiling. Bovendien, de detectiegrens is zo laag als pg / ml, die slechts enkele pl genoeg om detectie uit te voeren en het is ook geschikt voor hemolyzed klinische monsters die moeilijk te worden gedetecteerd met traditionele methoden. Bovendien is de methode niet opdringerig voor de monsters. Het parallelle licht bestralingssysteem, hoge-resolutie camera systeem, automatische intelligente analyse systeem, autofocus systeem, temperatuur controle systeem, en microlens poreuze detectie bord componeren de microsfeer immunoassay instrument. Het is klein en gemakkelijk mee te nemen.
Het is bekend dat de antigeen-antilichaam reactie sterk wordt beïnvloed door de eigen concentratie, temperatuur, pH, en elektrolytoplossing. Om deze reden worden deze factoren in aanmerking genomen in het microlens beeldvormingssysteem om de gegevens stabiel te houden door hun veranderingen in evenwicht te brengen. Dit systeem kan bijvoorbeeld worden geoptimaliseerd door geschikte materialen te kiezen voor een testplaat die een antigeen-antilichaam-reactieplaats biedt en door de plaat hydrofiel te maken om hydrofobe interferentie te voorkomen. De opsporingsnauwkeurigheid kan verder worden verbeterd door de antigeen-antilichaamverhouding aan te passen, de juiste verdunner te screenen, ze te modificeren met metaalionen, enzovoort.
De opsporing van antigeen en antilichaam is relatief belangrijk op het gebied van biomedisch onderzoek, klinische diagnose, geneesmiddelenanalyse, voedselveiligheid, en milieubewaking. Met de bezorgdheid van mensen over milieugezondheid, voedselveiligheid en gezondheidszorg, is het ontwikkelen van een gevoelig instrument met lage kosten, hoge nauwkeurigheid, kleine afmetingen, draagbaarheid en eenvoudige bediening een dringende sociale behoefte geworden. Dus, dit immuun microlens imaging techniek is veelbelovend om breed te worden toegepast op verschillende gebieden en geschikt om vooral worden gepopulariseerd op de gemeenschap en het platteland.
Conflicts of Interest
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Bijdragen van auteurs
Jiahui Liang en Xiaotian Ye hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk.
Acknowledgments
We zijn de Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (subsidienummer: 201604020146) en de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers: 81172824 en 30971465) dankbaar voor hun financiële steun.