De Limulus Amebocyte Lysate-test (LAL) is een methode voor de detectie en kwantificering van bacteriële endotoxinen die op grote schaal wordt gebruikt door de farmaceutische en biotechnologische industrie. Het biochemische principe van de test is gebaseerd op de stollingsreactie van de hemolymfe van de Limulus polyphemus, algemeen bekend als de Atlantische Hoefijzerkrab, in aanwezigheid van antigenen met een microbieel oppervlak, zoals Lipopolysacchariden of bacteriële endotoxinen.

De firma “Wako Chemicals” behoort tot de firma’s die LAL-reagentia op internationaal niveau vervaardigen, dankzij de unieke formule van een LAL-reagens dat specifiek is voor bacteriële endotoxinen zonder de interferentie van betaglucanen in de monsters, dankzij de toevoeging van carboximethylated Curdlan (CMC) dat met LAL is gecoliophyleerd. Onder het merk PYROSTAR™ produceert en verkoopt deze distributeur van onderzoeksreagentia LAL-reagentia en accessoires die voldoen aan alle normen, voorschriften en kwaliteitsnormen die door de FDA uit de VS zijn vastgesteld.

We gaan het nu hebben over de verschillende reagentia en accessoires waarmee Wako bijdraagt aan de studie van bacteriële endotoxinen:

Ten eerste hebben we de Limulus PS Simple Test kit, die de detectie en kwantificering van endotoxinen mogelijk maakt zonder de interferentie van andere coëxistente stoffen met het gebruik van een affiniteit adsorptiemiddel voor endotoxinen genaamd Pyrosep™. Met deze methode kunnen we de endotoxine meten in een lipofiel monster op voorwaarde dat het kan worden opgelost in ethanol, zoals liposoloplosbare vitaminen, oliën en vetten, albuminen, enz. die normaal niet kunnen worden gemeten met een conventionele Limulus-test. Bovendien wordt geen LAL-reagens verspild omdat het afzonderlijk in flacons van de eenvoudige test wordt aangebracht en in de exact voor de meting vereiste hoeveelheid kan worden gebruikt.

De PYROSTAR™ ES-F-reeks is een unieke formulering die carboximethylated Curdlan (CMC) bevat dat met LAL is gecoliophyleerd met als doel de interferentie met β-glucanen te verwijderen. De door Wako ontwikkelde ES-buffer bevat hoge CMC-concentraties, waardoor het een endotoxine-specifiek LAL-reagens wordt. Dit reagens is ontworpen om zowel te worden gebruikt voor de kwalitatieve detectie van endotoxinen via de gel-clotmethode als voor de kwantitatieve detectie via de kinetische turbidimetrische methoden (KTA). Een fotometrisch instrument, de Toxinometer®, ontwikkeld door Wako Pure Chemical Industries, Ltd. wordt gebruikt om de snelheid van de troebelheidsverandering te meten. De kits PYROSTAR™ ES-F zijn verkrijgbaar met en zonder de Standard Control Endotoxin (SCE): een gevriesdroogd reagens geraffineerd uit E.coli en gebruikt om de gevoeligheid van het LAL-reagens te bevestigen, de producttestmethoden te valideren en inhibitiecontroles voor te bereiden.

Ter ondersteuning van deze reagentia ontwikkelt Wako ook een Endotoxine-extractieoplossing waarmee endotoxinen kunnen worden geëxtraheerd van oppervlakken waar ze niet met water of zout kunnen worden geëxtraheerd. Het gebruik ervan wordt aanbevolen bij endotoxinemonsters op apparatuur en toestellen die in contact kunnen komen met vloeistoffen die bloed of eiwitten bevatten.

Toxinometer® ET-6000 is een geautomatiseerde kinetische incubatielezer die 3 testmethoden kan omvatten: gel-clot, KTA en KCA (kinetische chromogene test). Deze apparatuur maakt het mogelijk gel-clot en KTA resultaten van hetzelfde monster te verkrijgen. Het meet gelijktijdig tot 16 monsters met een contaminatierisico dat veel lager is dan bij de microtiterplaat en stelt ons in staat de standaardcurven te archiveren. Toximaster® QC7 is de software die alle functies biedt voor gegevensverwerking en rapportvoorbereiding voor de LAL-test met de Toxinometer® ET-6000.

Tussen de accessoires uit Wako’s LAL-catalogi zien we bovendien reageerbuizen met en zonder aluminium deksels. Deze buisjes zijn geproduceerd vrij van endotoxinen, gemaakt van borosilicaatglas en ontworpen voor de gel-clot methode. De glasdikte kan specifiek worden gekalibreerd op de Toxinometer voor een stabiele lichtintensiteit en transmissie.

Een ander LAL-reagens dat door Wako op de markt wordt gebracht, is de KY Color Limulus-kit. Dit reagens is ontworpen voor de KCA-methode en kan zowel in de kinetische lezer als in een microplaatlezer worden gebruikt. Het omvat een multi-test kit en een eenvoudige test kit, elk ontworpen voor een colorimetrische analyse op basis van tijd, met behulp van een synthetisch substraat dat een gele kleur genereert en dat specifiek de endotoxine kan detecteren met een hoge gevoeligheid.

Bibliografie:

1) Iwanaga, S. Biochemical principle of Limulus test for detecting bacterial endotoxins. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, December (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Uittreksel 44 (1994), 21e jaarlijkse bijeenkomst van de Society for Antibacterial and Antifungal Agents.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discrimination between endotoxin and (1-3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate. Chem Pahrm Bull (Tokio), 38(9). 2523. (1990).

LAL PRODUCT LINE

LAL Reagent Kit	LAL Accessories