Onderzochte schimmels
Escovopsioides isolaten werden verkregen uit schimmeltuinen van verschillende bladsnijder en niet-bladsnijder miersoorten verzameld in eerdere studies . Deze collectie omvat 20 isolaten verkregen uit Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi en Trachymyrmex tucumanus, naast de typesoort van E. nivea verkregen uit Acromyrmex subterraneus subterraneus (tabel 3). Ook werd een extra isolaat verkregen uit een kolonie van de niet-bladsnijmier Apterostigma megacephala, gevonden in Parauapebas, Pará, Brazilië (Tabel 3). Alle isolaten vertoonden de beschreven morfologische kenmerken van het genus Escovopsioides: hyaliene kolonies op PDA, eind- en intercalaire blaasjes met lagenvormige fialiden, hyaliene conidia in lange ketens, aleuroconidia en chlamydospore-achtige structuren.
De isolaten worden als conidiasuspensies bewaard bij – 80 °C (in glycerol 10%) en in gedestilleerd water bij 10 °C in de collectie van het Laboratory of Fungal Ecology and Systematics (LESF), Rio Claro, São Paulo State, Brazilië. Alle isolaten werden nieuw leven ingeblazen uit voorraden door het inoculeren van bewaarde conidia op PDA-medium en gedurende 7 dagen bij 25 °C in het donker geïncubeerd. Alle onderzochte isolaten werden verkregen als monosporische culturen.
Moleculaire karakterisering van Escovopsioides
Genomisch DNA werd geëxtraheerd met de CTAB methode uit culturen gekweekt op mout agar 2% (MA2%) gedurende 5 dagen, in het donker. De genen die coderen voor tef1 (primers: EF6-20F en EF6A-1000R), LSU (primers: CLA-F en CLA-R) en ITS (primers: ITS5 en ITS4) werden voor alle isolaten geamplificeerd. Voor tef1 werd 1 μl verdund genomisch DNA (1:100) gebruikt als sjabloon voor amplificatie met illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) onder de volgende omstandigheden: een initiële denaturatiestap bij 94 °C gedurende 2 min, gevolgd door 15 cycli bij 94 °C gedurende 30 s en een initiële annealingtemperatuur bij 65 °C die met 1 °C afneemt per touch-down cyclus en een laatste extensie bij 72 °C gedurende 1 min. Een tweede PCR-stap werd uitgevoerd: 94 °C gedurende 30 s, gevolgd door 35 cycli bij 94 °C gedurende 30 s, 48 °C gedurende 30 s en een laatste extensiestap bij 72 °C gedurende 1 min. Voor ITS werden 2 μl van het verdunde genomische DNA (1:100) gebruikt als sjabloon voor PCR, volgens de voorwaarden beschreven in Schoch et al. : 94 °C gedurende 3 min, gevolgd door 35 cycli bij 94 °C gedurende 1 min, 55 °C gedurende 1 min en een laatste extensiestap bij 72 °C gedurende 2 min. Voor LSU werd 2 μl verdund genomisch DNA (1:100) gebruikt voor PCR, volgens de voorwaarden beschreven in Augustin et al. : 95 °C gedurende 2 min, 40 cycli van 30 s bij 95 °C, 60 s bij 62 °C, 90 s bij 72 °C en 5 min extensie bij 72 °C. PCR-producten werden gekleurd met GelRed™ (Biotium) en gevisualiseerd onder UV na elektroforese in 1% agarosegel.
Ampliconen werden gezuiverd met de Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) volgens het protocol van de fabrikant. De monsters werden geanalyseerd in NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) en 20 ng DNA werd gesequeneerd met BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Vanwege het hoge GC-gehalte in de ITS-regio van Escovopsioides werd 5% DMSO aan de sequencingreacties toegevoegd. Forward en reverse sequenties werden gegenereerd in ABI 3500 (Life Technologies) en geassembleerd tot contigs in BioEdit v.7.1.3 . De in deze studie gegenereerde sequenties werden gedeponeerd bij de NCBI-GenBank (Additional file 1: Table S1).
Phylogenetische analyse
Naast de in deze studie gegenereerde sequenties werden de sequenties van de typesoort (E. nivea) samen met die van zes beschreven Escovopsis-soorten en acht schimmels die behoren tot de Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma en Lecanicillium) opgehaald uit de NCBI-GenBank. De volledige dataset die in deze studie werd gebruikt, omvatte dus sequenties van 37 schimmels (Additional file 1: Table S1).
Voor de fylogenetische analyse werden de sequenties uitgelijnd in MAFFT . Sequenties van tef1, ITS en LSU werden samengevoegd in Winclada v.1.00.08. Bayesiaanse inferentie werd gebruikt als reconstructiealgoritme. Het nucleotide-substitutiemodel GTR + G en GTR + I + G werd geselecteerd voor tef1 en ITS/LSU, respectievelijk, met gebruikmaking van AIC in jModeltest2 met een betrouwbaarheidsinterval van 95%. Aldus werden gepartitioneerde onafhankelijke analyses van de dataset uitgevoerd in MrBayes, elk met drie verhitte ketens en één koude keten. MCMC-bemonstering in elke analyse vond plaats tot één miljoen generaties. Convergentie van verwarmde en koude ketens trad op wanneer de standaardafwijking van de splitsingsfrequenties kleiner was dan 0,01; daarna werden de eerste 25% van de generaties als burn-in verwijderd.
Dual-culture experimenten
We voerden in vitro tests uit om het antagonistische potentieel van Escovopsioides ten opzichte van de door bladsnijdermieren gekweekte schimmel te verifiëren. We selecteerden 13 van de 21 Escovopsioides-isolaten (Tabel 3), op basis van de volgende criteria: i) enig polymorfisme gevonden in het tef1-gen; ii) verschillende geassocieerde miersoorten; iii) geografische locatie (d.w.z. verschillende steden en verzamellocaties). Twee van de geselecteerde isolaten (LESF 596 en LESF 599) werden reeds geëvalueerd op hun interacties met de schimmelcultivar in de studie van Varanda-Haifig et al. We hebben deze test echter herhaald om te vergelijken met bijkomende Escovopsioides isolaten.
De schimmel Leucoagaricus gongylophorus FF2006 gekweekt door de miersoort Atta sexdens rubropilosa werd gebruikt in de experimenten met dubbele kweek. Deze stam wordt in stand gehouden op agar slants door opeenvolgende transfers om de 24 dagen bij 25 °C. De productie van gongylidia door deze stam wordt bij elke overhevelingscyclus gecontroleerd. Deze schimmel werd gekweekt op PDA-medium en gedurende 14 dagen bij 25 °C geïncubeerd, in het donker. Na deze periode werden myceliumfragmenten (met een diameter van 8 mm) op een afstand van 1,5 cm van de rand overgebracht op nieuwe petrischaaltjes (90 × 15 mm) die eveneens PDA bevatten. Deze platen werden gedurende 14 dagen in het donker bij 25 °C geïncubeerd. Vervolgens werden myceliumfragmenten (8 mm in diameter) van Escovopsioides, eerder geïncubeerd op PDA, geïnoculeerd op een afstand van 3 cm van de mutualistische schimmel. Om de effecten van Escovopsioides op de myceliumgroei van de schimmelcultivar te vergelijken met de effecten veroorzaakt door andere schimmels, gebruikten we één Escovopsis sp. isolaat (LESF 19) uit de schimmeltuinen van Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brazilië). Dit isolaat werd verkregen door kleine stukjes van de fungustuinen te inoculeren op PDA aangevuld met chlooramfenicol. Controleplaten werden geënt met dezelfde mutualistische schimmel, maar er werden geen Escovopsioides of Escovopsis geënt. Alle platen werden gedurende 14 dagen geïncubeerd bij 25 °C, in het donker. Elke combinatie van Escovopsioides, Escovopsis en de mutualistische schimmel werd uitgevoerd op tien platen. Experimentele en controle platen werden gescand met intervallen van 0, 2, 3, 5, 7, 10 dagen op een HP Deskjet F2050 scanner. De beelden werden gebruikt om de oppervlakte van de koloniegroei (cm2) van de mutualistische schimmel te meten in ImageJ v. 1.38 .
De myceliale groeigebieden van L. gongylophorus in de dual-cultuur experimenten werden geanalyseerd met behulp van twee-weg gemengde ANOVA, met schimmelisolaten (Escovopsioides en Escovopsis) versus de controle als de between-subjects variabele, en tijd (dagen) als de within-subjects variabele, waardoor de repetead metingen van de tijd in de behandelingen in aanmerking worden genomen. De gegevens werden gecontroleerd op normaliteit en homogeniteit van varianties, met respectievelijk de Shapiro-Wilk en Levene test. Omdat deze criteria niet werden nageleefd, werden de gegevens zo nodig getransformeerd tot de log of de vierkantswortel. Meervoudige vergelijkingen met verschillende filamenteuze schimmels werden uitgevoerd met behulp van t-test met Bonferroni correctie.
Voor de vergelijking tussen isolaten werd de myceliale groeiruimte van L. gongylophorus in contact met Escovopsioides isolaten gedeeld door de gemiddelde oppervlakte van zijn controle op dag 10. De gegevens werden gecontroleerd op normaliteit en homogeniteit van varianties. Er werd een eenzijdige ANOVA uitgevoerd met de oppervlakte verkregen op dag 10 tussen alle geteste schimmels, waarbij vergelijkingen tussen de verschillende behandelingen werden uitgevoerd met de post-hoc Tukey-HSD test. Statistische analyses werden uitgevoerd in R v. 2.12.1 .
Bioassays op fungustuinfragmenten in afwezigheid van werkers
Leucoagaricus gongylophorus wordt gekweekt in attine mierenkolonies in fungustuinen. Om te bepalen of Escovopsioides zich kan ontwikkelen op de zwamtuin zonder de mogelijke beschermende effecten van de werksters, voerden we bioassays uit met fragmenten van dit substraat vrij van mieren. Schimmeltuinfragmenten werden verkregen uit een volwassen en gezonde A. sexdens rubropilosa kolonie die wordt onderhouden in het Centrum voor de studie van sociale insecten (UNESP, Rio Claro). Schimmelfragmenten van 2 cm3, ontdaan van mieren en broed, zijn in steriele petrischaaltjes geplaatst met vochtig katoen aan de randen (volgens Elizondo-Wallace et al. ). Voordat de experimenten werden uitgevoerd, werden de platen gedurende 1 dag bij 25 °C gehouden om te zoeken naar mieren die mogelijk in de fragmenten waren achtergebleven.
We bereidden een 10 ml suspensie van 0,05% Tween 80 met myceliummassa en conidia van elk van de 12 Escovopsioides (isolaat LESF 591 werd in dit experiment niet gebruikt) en één Escovopsis-isolaat die in de experimenten met dubbele kweek werden gebruikt. Deze suspensie werd twee- tot driemaal gefiltreerd volgens de methode van Newmeyer om de conidia te scheiden van de in de suspensie aanwezige hyphaalfragmenten. Vervolgens werd de suspensie verdund tot 105 à 2,105 conidia ml-1, bepaald in een Neubauer-kamer. Aliquots van 100 μl conidiasuspensie werden met een micropipet op het oppervlak van het tuinfragment geïnoculeerd. Dezelfde hoeveelheid steriele 0,05% Tween 80-oplossing werd toegevoegd op het tuinoppervlak in de negatieve controle. Petrischaaltjes met schimmeltuintjes werden tot 10 dagen bij 25 °C bewaard, waarbij voor elke behandeling vijf schaaltjes werden gebruikt en voor elke controle vijf schaaltjes. De mogelijke ontwikkeling van hyphae van de geïnoculeerde schimmels werd dagelijks geobserveerd met een stereomicroscoop (EZ4, Leica). Escovopsioides conidiatie op de schimmeltuinen werd geobserveerd door mycelium fragmenten te nemen die op de tuinen groeiden en gemonteerd in water en geobserveerd onder de microscoop (DM500, Leica).
Groei- en conidiatiegegevens op de schimmeltuinen werden gescoord als: geen groei (score 0), groei enkel waargenomen op de stereomicroscoop (score 1), macroscopische groei (score 2) en conidiatie (score 3) over 10 dagen monitoring (Additional file 1: Figuur S1). We namen conidiatie alleen waar na macroscopische groei van de schimmel op de schimmeltuinen. De totale som van de scores van vijf petrischalen op elke dag werd verkregen en omgezet in termen van percentage van het maximaal mogelijke totaal voor directe vergelijkingen.
Effecten van Escovopsioides op tuinen met werkers
Aanwezige werkers spelen een belangrijke rol in de kolonieverdediging tegen pathogenen en ongewenste microben in de fungustuinen . Daarom hebben we experimenten uitgevoerd om de invloed van werkers in schimmeltuinen geënt met conidia van dezelfde schimmels gebruikt in de bioassays op schimmeltuinen in de afwezigheid van werkers (12 Escovopsioides isolaten en 1 Escovopsis isolaat) te controleren.
Bioassays met koninginnen-rechtse mierenkolonies zijn een uitdaging als gevolg van het grote aantal kolonies dat dit soort experiment zou vereisen. Daarom voerden we bioassays uit met tuinkolonies met werksters om de effecten van de schimmelisolaten in vivo te beoordelen. Hoewel deze experimentele opzet niet representatief is voor wat zich in natuurlijke kolonies afspeelt, leverde ze toch indicatieve informatie op over de verdedigende werking van werksters tegen de geteste schimmels. Deze bioassay werd aangepast volgens de methode van Elizondo-Wallace et al. Om uitdroging van de schimmeltuintjes te voorkomen, werden plastic bakjes gebruikt met een klein laagje gips op de bodem. Ongeveer 20 cm3 schimmeltuin van dezelfde kolonie die bij het vorige experiment werd gebruikt, werd in de plastic bakjes gedaan. De proefopstelling omvatte in totaal 84 containers, zodat de behandelingen met conidia van de 13 schimmels en de controle elk zes containers hadden. We selecteerden werkmieren met een cephalische kapsel diameter tussen 1.0 en 1.6 mm, en 50 van deze werksters werden in elke container geplaatst. Werksters met minder dan 1,0 mm werden niet geteld, en werksters met meer dan 1,6 mm werden uitgesloten. Deze procedure werd gevolgd om homogeniteit tussen de zes containers van elke behandeling en tussen de behandelingen mogelijk te maken, omdat werksters in het interval tussen 1,0 en 1,6 mm een significante schoonmaakactiviteit hebben. Het binnenoppervlak van de container werd gecoat met Teflon® om te voorkomen dat de mieren ontsnappen.
De containers werden gedurende 3 dagen geïncubeerd bij 25 °C om de schimmeltuinen te stabiliseren. Conidiasuspensies werden verkregen zoals hierboven beschreven. In totaal werd 1 ml conidiasuspensie met een sproeier op het oppervlak van de fungustuinen gespoten. Schimmeltuinen in de negatieve controle werden besproeid met slechts 1 mL steriele 0,05% Tween 80 oplossing.
De experimenten werden gecontroleerd na 0, 5 en 10 dagen van inoculatie om de gezondheid van de schimmeltuinen te controleren. Deze parameter was gebaseerd op een scoresysteem, waarbij gezonde tuinen score 0 kregen, gedeeltelijk aangetaste tuinen score 1 en volledig aangetaste (“besmette”) tuinen score 2. De mierenverwijdering van stukjes schimmeltuin en toewijzing aan de vuilnisbelten was het belangrijkste teken van verslechtering van de tuinen dat we onderzochten (zie Additional file 1: Figuur S2). De scores verkregen uit de zes containers van elk experiment, op de 3 observatiedagen, werden vergeleken met behulp van Friedman test.
Om de aanwezigheid van de Escovopsioides isolaten op de schimmeltuinen op dagen 0, 5 en 10 na de behandeling te verifiëren, werden fragmenten uit de tuinen verwijderd en geënt op MA2% aangevuld met 150 μg mL- 1 chloramphenicol. De platen werden gedurende 7 dagen in het donker bij 25 °C geïncubeerd. Vijf platen met één tuinfragment werden gebruikt voor elk van de zes containers van elke behandeling, in totaal 30 platen per behandeling. Fragmenten met positieve groei werden geteld en de langetermijnaanwezigheid van de geïnoculeerde schimmels in de schimmeltuinen werd getest met Fisher’s Exact test. In deze analyse vergeleken we het aandeel van de met schimmelconidia (Escovopsioides en Escovopsis) geïnfecteerde fragmenten versus de controle zonder enige conidia op elke dag van het experiment. We vergeleken ook de verschillende behandelingen met geïnoculeerde schimmels onderling op elke dag van het experiment.