HypaCas9 en Cas9-HF1 vertonen trage waargenomen splitsingssnelheden

We beginnen onze kinetische analyses met het meten van de enzyme active site concentratie voor elk van de Cas9 varianten23,24,25. Het meten van de hoeveelheid product gevormd in een titratie van enzym met toenemende concentraties van DNA bleek actieve site concentraties van 31 nM, 26 nM, 23 nM voor SpCas9, HypaCas9, en Cas9-HF1, respectievelijk, voor enzym monsters met een 100 nM nominale concentratie op basis van absorptie bij 280 nm (Supplementary Fig. 1a-d). We hebben ook gemeten de actieve site concentraties van SpCas9 en HiFiCas925 van Integrated DNA Technologies (IDT) en waargenomen vergelijkbare concentraties van actieve enzym (Supplementary Fig. 1e-f). Het is belangrijk op te merken dat in elk geval de concentratie van DNA die nodig is om het signaal te verzadigen was gelijk aan de concentratie van het gevormde product, die de bezorgdheid wegneemt dat een deel van het enzym zou kunnen binden DNA, maar niet reageren. Alle verdere experimenten werden opgezet met behulp van de concentratie van actieve enzym bepaald in de actieve site titration.

Om de kinetiek van on- of off-target DNA-substraten van SpCas9 te vergelijken met de gemanipuleerde varianten, onderzochten we eerst het tijdsverloop van doelstreng (HNH) splitsing voor elk enzym (Fig. 1 en supplementaire Fig. 2). De gegevens werden met een enkelvoudige of dubbel-exponentiële functie met behulp van Eq. (1) of Eq. (2), respectievelijk.

waarin Y de concentratie van het splitsingsproduct voorstelt, A1 de amplitude, en λ1 de waargenomen vervalsnelheid (eigenwaarde)17.

waar Y de concentratie van het splitsingsproduct voorstelt, A1 de amplitude en λ1 de waargenomen snelheid voor de eerste fase. A2 staat voor de amplitude en λ2 staat voor de waargenomen snelheid voor de tweede fase.

Vergelijking van de waargenomen splitsing verval snelheden van on-en off-target substraten door SpCas9 blijkt dat de 3 bp PAM-distale mismatch vertraagt het enzym 13-voudig (van 1 s-1 tot 0,076 s-1). Beide high-fidelity Cas9 varianten drastisch verminderen van de waargenomen decay rate voor splitsing van on-target DNA substraten 21 tot 35-voudig in vergelijking met SpCas9 (0.028 s-1 voor HypaCas9 en 0.047 s-1 voor Cas9-HF1 vs 1 s-1 voor SpCas9). Bovendien verminderen HypaCas9 en Cas9-HF1 de afnamesnelheden van off-target DNA-splitsing 8- tot 290-voudig (snelheden van 0,0033 s-1 en 0,00016 s-1, respectievelijk) ten opzichte van hun respectieve snelheden met on-target DNA. Deze gegevens tonen dramatische veranderingen aan in de waargenomen snelheden van splitsing door de gemanipuleerde varianten met on- en off-target DNA. Deze metingen alleen definiëren echter geen veranderingen in specificiteit, die een functie is van de kinetische verdeling van DNA-splitsing versus dissociatie, die alle stappen omvat die leiden tot de eerste onomkeerbare stap in de route17, inclusief omkeerbare DNA-binding, R-lus-vorming, docking van het HNH-domein, en DNA-splitsing.

DNA afwikkeling is grotendeels ongewijzigd met de Cas9 varianten

Aangezien ons eerdere werk R-lusvorming als snelheidslimiterende voor on-target splitsing identificeerde en anderen vervolgens suggereerden dat R-lusvorming en terugspoelsnelheden de enzymspecificiteit voor SpCas9 en Cas9-HF116 kunnen dicteren, hebben we getest of HypaCas9 vergelijkbare kinetiek zou vertonen. Om direct de snelheid van R-lus vorming voor alle enzymen te meten, gebruikten we een stop-flow assay gebaseerd op het meten van fluorescentie van tCo bij -16 nt, een fluorescerend tricyclisch cytosine analoog dat wordt gedoofd door stapeling van basen in dsDNA, zodat het openen van de duplex resulteert in een grote toename van fluorescentie. Onze controle-experimenten met behulp van zowel onze tCo-en 2-AP gelabelde base analoge substraten op posities -16, -9, en -1 nt, respectievelijk (Supplementary Fig. 3), tonen aan dat geen van de analogen de waargenomen vervalsnelheid voor DNA-splitsing beïnvloeden. De chemische structuren van tCo en 2AP zijn veel minder volumineus dan grotere Cy3 en Cy5 labels en minder waarschijnlijk interfereren met enzym kinetiek (Supplementary Fig. 4). In aanwezigheid van Mg2 +, SpCas9, HypaCas9, en Cas9-HF1 afwikkelen de on-target DNA-substraat met bijna identieke verval snelheden (~ 2 s-1) (Fig. 2). Verrassend genoeg was de afnamesnelheid van R-lus vorming voor off-target DNA substraten voor alle Cas9 varianten ook grotendeels ongewijzigd (tussen 0,85 s-1 en 2,59 s-1). Daarom is het afwikkelen van DNA niet snelheidsbeperkend en niet gecorreleerd met de waargenomen splitsingssnelheden voor de high-fidelity varianten, in tegenstelling tot SpCas9.

R-lusvormingssnelheden werden gemeten door de fluorescentietoename vanaf tCo (positie -16 in de niet-doelstreng) te volgen als functie van de tijd na het mengen van enzym (28 nM) met DNA (10 nM) in aanwezigheid van 10 mM Mg2+. De gegevens werden aangepast aan een dubbele exponentiële functie om de getoonde vervalsnelheden te verkrijgen. a, b SpCas9 (28 nM) met on-target (a) en off-target (b) DNA, c, d HypaCas9 met on-target (c) en off-target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 met on-target (e) en off-target (f) DNA.

Gezien de locatie van de tCo bij -16 nt, is het waarschijnlijk dat onze metingen een stap laat in het afwikkelproces weerspiegelde. Ter vergelijking hebben we gemeten het verval snelheid voor R-lus vorming met tCo gelabeld op een positie direct proximaal van de PAM (positie -1 nt). Na snel mengen Cas9-RNA met de on-target DNA-substraat, zagen we een duidelijke toename in fluorescentie als het DNA afwikkelt de tCo base-analoog. We pasten de gegevens aan een dubbele exponentiële om de belangrijkste vervalsnelheid van 10 s-1 te bepalen (Fig. 3a-f). Intrigerend is dat deze resultaten aangeven dat wanneer een PAM-locatie eenmaal door het enzym is bezet, de initiële afwikkeling van het DNA sneller verloopt dan waargenomen bij -16 nt. Deze gegevens suggereren dat de netto waargenomen afwikkelingssnelheid bij -16 nt een functie kan zijn van meerdere snelle afwikkelingsstappen die tot volledige afwikkeling leiden. Omdat er echter geen vertraging in de kinetiek is waargenomen, lijkt het erop dat de snellere, eerdere gedeeltelijke afwikkelingsstappen leiden tot een uiteindelijke snelheidslimiterende stap van volledige afwikkeling, gemeten bij de -16 nt positie. Hoewel verdere studies nodig zijn om de effecten van mismatches in eerdere stadia van afwikkeling te onderzoeken, geeft onze huidige meting de beste schatting van de netto snelheid van R-lus vorming. De met dit label gemeten afnamesnelheid voor R-lus-vorming is niet te onderscheiden voor zowel SpCas9 als de high-fidelity varianten op alle geteste substraten, dus de snelheden voor DNA-afwikkeling lijken onveranderd te zijn door de gemanipuleerde Cas9-enzymen.

R-lusvormingssnelheden werden gemeten door de fluorescentietoename vanaf tCo (positie -1 in de niet-doelstreng) te volgen als functie van de tijd na het mengen van enzym (28 nM) met DNA (10 nM) in aanwezigheid van 10 mM Mg2+. De gegevens werden aangepast aan een dubbele exponentiële functie om de getoonde vervalsnelheden te verkrijgen. a, b SpCas9 (28 nm) met on-target (a) en off-target (b) DNA, c, d HypaCas9 met on-target (c) en off-target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 met on-target (e) en off-target (f) DNA. g Schets van de HNH-domein herschikking. h De FRETSpCas9 gelabeld met Cy3 en Cy5 paar op C867 en C355, respectievelijk, werd gebruikt om de HNH domein beweging te meten tijdens splitsing van on-target substraten.

Om de snelheid van R-lus vorming correleren met stappen die betrokken zijn bij HNH-domain docking op de doelstreng, hebben we gemeten het enzym conformatieverandering met behulp van stop-flow analyse op een Cas9 die was gelabeld met Cy3 en Cy5 zoals eerder beschreven18. Kort gezegd, een Cysteine-light versie van Cas9 was gelabeld met Cy3 bij aminozuur 355 en Cy5 bij aminozuur 867. De FRET-efficiëntie neemt toe wanneer het HNH-domein herschikt tot de katalytisch actieve toestand (Fig. 3g). Na het snel mengen van de FRET-paar gelabelde Cas9 met een perfect gematchte on-target DNA, zagen we een toename van de FRET-efficiëntie, wat aangeeft dat het HNH-domein werd herschikken tot een katalytisch actieve toestand. We hebben gemeten het verval snelheid voor HNH docking tot ~ 2,5 s-1 (Fig. 3h), die vergelijkbaar is met enkele molecuul FRET metingen. Verrassend genoeg zijn de waargenomen snelheden van R-lus vorming (1,5 s-1) en HNH domein docking zeer vergelijkbaar, wat aangeeft dat deze stappen kinetisch met elkaar verbonden kunnen zijn. De iets snellere waargenomen vervalsnelheid voor HNH-domein beweging kan te wijten zijn aan de omgekeerde reactie als het domein beweging komt tot evenwicht na of samenvalt met R-loop formatie.

De vervalsnelheden van DNA afwikkeling zijn ook gemeten met behulp van enkele molecuul methoden met behulp van een FRET-paar gelabeld DNA, Cy3 en Cy5 werden gelabeld op positie -6 nt van de doelstreng en -16 nt op de niet-doelstreng, respectievelijk16. Daarom hebben we ook getest de FRET-gepaarde DNA-substraten in een poging om de FRET signaal correleren met de waargenomen tarieven van DNA splitsing. Eerst testten we het substraat eerder gebruikt in single molecuul studies zonder de Cy3 / Cy5 labels 16, die een twee-nucleotide verschil met ons substraat heeft, in het bijzonder een T substitutie op posities -16 en -18. De vervalsnelheid van de doelstreng (HNH) splitsing is vergelijkbaar met die van ons substraat (0,7 s-1 vs 1 s-1, Supplementary Fig. 5a), zodat sequentie context op deze positie heeft geen significante invloed. We testten ook splitsing met Cy3/Cy5 gelabeld DNA met deze andere sequentie, en het toonde een vergelijkbare afnamesnelheid als onze sequentie (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, Aanvullende Figs. 5b en 6a). Later onderzochten we het tijdsverloop van de doelstreng (HNH) splitsing van de Cy3 / Cy5 gelabeld DNA met onze sequentie voor elk enzym (Supplementary Fig. 6). Met SpCas9, de reactie van de Cy3 / Cy5 gelabeld DNA volgt een enkele exponentiële met een duidelijk verminderde afnamesnelheid (0,06 s-1 vs 1 s-1) met een ~ 17-voudige daling van de waargenomen afnamesnelheid voor DNA splitsing in vergelijking met ongelabeld substraat. De gemanipuleerde HypaCas9 en Cas9-HF1 vertoonde ook verminderde DNA splitsing tarieven van 0,0046 s-1 en 0,0016 s-1, respectievelijk, die 5,9-voudige en 28.75-voudige langzamer dan ongelabelde substraten gemeten onder identieke omstandigheden. Het is duidelijk dat interferentie door de Cy3/Cy5 labels het effect van de high-fidelity varianten op de DNA splitsing tarieven verandert. Alles bij elkaar had het labelen van het DNA met volumineuze Cy3- en Cy5-labels een dramatisch effect op het enzym. Om deze redenen werden geen verdere studies uitgevoerd met behulp van de FRET-paar gelabeld DNA.

Cas9 specificiteit wordt beheerst door kinetische partitionering

Omdat enzymspecificiteit een functie is van alle stappen die leiden tot de eerste grotendeels onomkeerbare stap, moeten alle gebeurtenissen voorafgaand aan DNA-splitsing worden overwogen17. Om de intrinsieke splitsingssnelheid te meten, omzeilden we de normaal snelheidslimiterende R-lus vorming stap door preïncubatie SpCas9 met off-target DNA in afwezigheid van Mg2 + om binding en conformatieveranderingen te komen tot een evenwicht om een SpCas9.DNA complex te vormen. Vervolgens hebben we de chemische reactie geïnitieerd door de toevoeging van 10 mM Mg2 +. In onze vorige studies, R-loop vorming was snelheid-limiterende met SpCas9 reageren met on-doel DNA, en de intrinsieke splitsing verval sneller was wanneer gemeten met behulp van de preïncubatie protocol. Hier, met off-target DNA, werden de tarieven van HNH en RuvC splitsing gemeten tot 0,12 s-1 en 0,14 s-1, respectievelijk (Supplementary Fig. 7c, d, en Supplementary Fig. 8), die veel langzamer dan de tarieven van R-loop vorming. Intrigerend is dat deze resultaten aantonen dat de snelheidslimiterende stap in de enzymatische route van SpCas9 met een off-target DNA-splitsing is, aangezien de vervalsnelheid voor R-loop vorming die we gemeten hebben 0,85 s-1 was (Fig. 2b). Deze gegevens geven aan dat discriminatie, althans gedeeltelijk, is gebaseerd op een verandering in de identiteit van de snelheidslimiterende stap bij het vergelijken van on- en off-target DNA.

We herhaalden deze experimenten met HypaCas9 en Cas9-HF1 met on- of off-target DNA. Deze resultaten definiëren waargenomen tarieven voor HNH splitsing van 0,035 s-1 en 0,0023 s-1 voor HypaCas9 met on- en off-target substraten, respectievelijk (Supplementary Fig. 7g, k). Waargenomen splitsing tarieven van Cas9-HF1 voor on-en off-target substraten werden gemeten als 0,038 s-1 en 0,00014 s-1, respectievelijk (Supplementary Fig. 7o, q). Deze waargenomen splitsing snelheden zijn iets sneller dan die gemeten met de gelijktijdige toevoeging van DNA en Mg2 +, wat erop wijst dat sommige andere stap dan R-loop vorming maar voorafgaand aan DNA splitsing kan vertragen de waargenomen vervalsnelheid. Niettemin tonen deze resultaten aan dat de waargenomen splitsingssnelheden voor on-target DNA ~100-voudig verlaagd zijn voor zowel HypaCas9 als Cas9-HF1 ten opzichte van SpCas9. Voor off-target DNA zijn de waargenomen splitsingspercentages 50- of 860-voudig voor HypaCas9 of Cas9-HF1, respectievelijk, ten opzichte van SpCas9.

Discriminatie wordt niet alleen bepaald door de relatieve snelheid van DNA-splitsing. In plaats daarvan, omdat R-loop vorming snel is, discriminatie is een functie van de kinetische verdeling tussen de tarieven van DNA-vrijgave versus splitsing 17,26,27. Om de kinetische verdeling te kwantificeren, incubeerden we enzym en gelabeld DNA in afwezigheid van Mg2+, waardoor R-lusvorming tot een evenwicht kan komen, maar katalyse wordt verhinderd15. Vervolgens voegden we Mg2 + om de reactie te starten in aanwezigheid van een grote overmaat van identieke, ongelabelde on-target DNA om te dienen als een val. Vergelijking tussen parallelle experimenten uitgevoerd in de aanwezigheid en afwezigheid van de DNA-val geeft een schatting voor de fractionele kinetische verdeling voor dissociatie versus splitsing van gebonden DNA (Fig. 4a). Zodra SpCas9 was gebonden aan on-doel DNA, werd het snel gesplitst, en de DNA-val had weinig effect (Fig. 4b). In tegenstelling, 33% van de off-target DNA losgekoppeld van het enzym, terwijl ~ 67% van het DNA was gebonden aan splitsing (Fig. 4c en Supplementary Fig. 9a). Deze resultaten tonen aan dat SpCas9 discrimineert tegen de PAM-distale mismatched DNA door het verminderen van de snelheid van splitsing, waardoor de fractie van DNA dat wordt vrijgegeven in plaats van gesplitst. Het effect is echter klein, zodat de dissociatiesnelheid langzamer lijkt te zijn dan de splitsingssnelheid.

a Schematische weergave van het DNA-val-experiment. b, c SpCas9-splitsing van on-target (van Gong et al.15) (b) of off-target (c) DNA. d, e HypaCas9 splitsing van on-target (d) of off-target (e) DNA. f, g Cas9-HF1 splitsing van on-target (f) of off-target (g) DNA. Enzym (28 nM) en gelabeld DNA (10 nM) werden geïncubeerd in afwezigheid van Mg2+ en de reactie werd op gang gebracht door toevoeging van Mg2+ in aanwezigheid of afwezigheid van een overmaat ongelabelde DNA-val. A- en A◦ vertegenwoordigen de amplitude met (gevulde cirkels) en zonder val (open cirkels), respectievelijk. Het percentage geeft de fractie van de pre-gebonden DNA zich naar voren te gaan voor splitsing ten opzichte van de reactie in de afwezigheid van trap.

Volgende, onderzochten we de kinetische partitionering voor HypaCas9 en Cas9-HF1 gebonden aan on-target DNA (Fig. 4d, f, Supplementary Fig. 9b, d). Onze resultaten met HypaCas9 en Cas9-HF1 tonen aan dat ~75% en ~92% van het on-target DNA werd gekliefd in aanwezigheid van de val, respectievelijk. Het percentage gesplitst is kleiner dan voor wild-type SpCas9 omdat de waargenomen intrinsieke splitsing verval snelheid voor on-target DNA door HypaCas9 (0,035 s-1) en Cas9-HF1 (0,038 s-1) was 100-voudig langzamer dan met SpCas9 (4,3 s-1). Deze langzamere splitsingssnelheid geeft tijd voor een kleine fractie (8 tot 25%) van het on-target DNA om te dissociëren voordat het wordt gekliefd.

Kinetische partitionering ten gunste van dissociatie werd versterkt wanneer HypaCas9 en Cas9-HF1 reageren met off-target DNA, omdat de splitsingssnelheden verder werden verlaagd tot 0,0023 s-1 en 0,00014 s-1, respectievelijk (Fig. 4e, g, Supplementary Fig. 9c, e). Deze tarieven zijn 50- tot 860-voudig trager, respectievelijk, in vergelijking met SpCas9 op een off-target substraat. Dienovereenkomstig was slechts ~24% en ~10% van het gebonden off-target DNA gecommitteerd om naar voren te gaan voor splitsing door HypaCas9 en Cas9-HF1, respectievelijk, in aanwezigheid van val DNA. Tezamen tonen deze resultaten aan dat de gemanipuleerde high-fidelity varianten een verbeterde specificiteit tegen het PAM-distale mismatched DNA verkregen door een duidelijk verminderde snelheid van splitsing, die de kinetische partitionering verandert ten gunste van vrijgave in plaats van splitsing van het gebonden substraat voor zowel on- als off-target DNA, maar het effect is groter voor off-target DNA. Berekening van de schijnbare dissociatiesnelheidsconstanten met behulp van Eq. (3) toont aan dat de high-fidelity varianten de schijnbare snelheid van DNA-afgifte niet verhogen (supplementaire tabel 1).

Verder wordt de toegenomen discriminatie volledig toegeschreven aan dalingen in de schijnbare snelheidsconstante voor splitsing.

In onze beschrijvingen van de kinetiek van Cas9 enzymen tot nu toe, de waargenomen verval snelheden van reacties werden geschat op basis van het passen van gegevens aan exponentiële functies, die eigenwaarden die meestal complexe functies van meerdere snelheidsconstanten 17 opleveren. Om volledig inzicht in de kinetiek en het mechanisme, werden alle experimenten voor elk enzym en DNA-substraat passen globaal op basis van numerieke integratie van de snelheid vergelijkingen met behulp van een enkel verenigd model (Fig. 5 en aanvullende Figs. 10-14). Globale data fitting toont aan dat onze minimale model (Fig. 5f, inzet) rekeningen voor onze gegevens en elk van de snelheidsconstanten is goed gedefinieerd op basis van vertrouwen contour analyse testen van de mate waarin elke parameter wordt beperkt door de gegevens (Fig. 6) 17,28. Merk in het bijzonder op dat ons model de bifasische sporen in sommige experimenten verklaart zonder een beroep te hoeven doen op heterogeniteit, en het geeft intrinsieke snelheidsconstanten voor elke stap in de route, inclusief R-lus vorming en HNH en RuvC splitsingsevents. Hoewel het waarschijnlijk is dat bijkomende, onopgeloste structurele herschikkingen vereist kunnen zijn voor de uitlijning van katalytische residuen voor DNA-splitsing, zijn deze nog niet opgelost als kinetisch verschillende gebeurtenissen. Het huidige model vertegenwoordigt een minimale route die nodig en voldoende is om alle beschikbare gegevens te verklaren, en kan gemakkelijk worden uitgebreid als nieuwe informatie beschikbaar komt om extra stappen in de route te definiëren.

a DNA en Mg2+ geïnitieerde splitsing door het HNH-domein. b DNA en Mg2+ geïnitieerde splitsing door het RuvC-domein. c R-lusvormingssnelheid. d Mg2+ geïnitieerde splitsing door het HNH-domein. e Mg2+ geïnitieerde splitsing door het RuvC-domein. f Effect van DNA-val op kinetische partitionering van Cas9-splitsing. Alle curven werden berekend op basis van de globale fit van de gegevens volgens het kinetische model (inzet), met snelheidsconstanten weergegeven in tabel 1. Fout schattingen werden gebaseerd op het vertrouwen contour analyse, zoals getoond in Fig. 6. E is Cas9.gRNA, D is doel-DNA, ED is Cas9.gRNA.DNA, EDH is R-lusvorming met koppeling van de doelstreng aan HNH, EDHR en EDP1R zijn R-lusvorming met koppeling van de niet-doelstreng aan RuvC, EDHP2 is RuvC-splitsing van de niet-doelstreng, EDP1 is HNH-splitsing van de doelstreng, EDP1P2 is splitsing van beide strengen, Dtrap is overtollig ongelabeld, perfect-matched DNA. EDtrap is Cas9.gRNA.DNAtrap.

Vertrouwbaarheidscontouren worden getoond voor het passen van gegevens in Fig. 5. De genummerde snelheidsconstanten zijn gedefinieerd in ons kinetisch model (Fig. 5f, inzet). De χ2 drempel (stippellijn) werd ingesteld op 0,99 om boven- en ondergrenzen voor elke snelheidsconstante te definiëren, zoals beschreven17,32. Omdat de contouren waren symmetrisch met parameters goed beperkt, rapporteren wij ± foutgrenzen in tabel 1. Voor deze analyse werd een χ2-drempel berekend met behulp van een F-verdeling en werd gebruikt om de onder- en bovengrenzen voor elke parameter te definiëren.

Om de specificiteit van een enzym te begrijpen, moeten de snelheidsconstanten worden geïnterpreteerd in de context van alle kinetisch relevante stappen, zoals geïllustreerd in het vrije-energieprofiel (berekend met Eq. (4) uit de snelheidsconstanten in tabel 1).

De transmissiecoëfficiënt A = 0,001

Omdat globale datafitting de snelheidsconstanten voor elke relevante stap oplevert (Fig. 5 en 6), kunnen we een bonafide vrije-energieprofiel construeren (Fig. 7b, en supplementaire Figs. 10-14). De vrije energie profielen die SpCas9, HypaCas9, en Cas9-HF1 vergelijken laten een verandering zien in de snelheid-limiterende en specificiteit-bepalende stappen. Enzym-specificiteit wordt gedefinieerd door kcat/Km en wordt gegeven door de hoogste algemene barrière ten opzichte van de begintoestand, terwijl de maximale snelheid, kcat, wordt gedefinieerd door de hoogste lokale barrière ten opzichte van de voorgaande toestand, afgezwakt door eventuele voorafgaande snel-evenwichtsstappen. Omdat de snelheidsconstanten voor R-lus vorming niet significant veranderen met verschillende substraten en enzym varianten, wordt specificiteit grotendeels bepaald door de kinetische partitionering van de Cas9 R-lus, EDH toestand in ons kinetisch model (Fig. 5f, inzet), om ofwel vooruit te gaan wat resulteert in onomkeerbare splitsing versus vrijgave via re-annealing van het DNA en uitwerpen uit het enzym. De hogere totale barrières voor splitsing die bij de varianten met hoge getrouwheid worden waargenomen, verhogen de kinetische verdelingswaarschijnlijkheid ten gunste van dissociatie van het DNA (fig. 6c).

a Cartoonweergave van de reactieroute van Cas9-enzymen. b Vrije-energieprofielen voor SpCas9-splitsing van een on-target (grijze lijn) van Gong et al.15 en off-target (rode lijn), respectievelijk; HypaCas9 splitsing van een off-target (blauwe lijn); en Cas9-HF1 splitsing van een off-target (zwarte lijn). Elk profiel werd berekend met behulp van de overgangstoestand theorie met behulp van snelheid en evenwichtsconstanten die werden afgeleid uit globaal passen elke set van experimenten (tabel 1). Merk op dat de hogere barrières voor DNA-splitsing ten opzichte van de lagere barrière voor de voorafgaande omgekeerde reactie de waarschijnlijkheid van DNA-vrijgave verhogen. c Samenvattend staafdiagram voor k2, k3, en kinetische partitionering (P).