Eenvoudige onevenwichtige translocaties en inversies (klassen A en C): mechanismen van oorsprong

Het eenvoudige resultaat van deze studie is dat in 20 van de 37 van de novo onevenwichtige translocaties, de verdubbeling een maternale oorsprong heeft (Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2). Aangezien het onderzoek naar de ouderlijke oorsprong in zes gevallen niet informatief of niet mogelijk was (gevallen 7, 14, 23, 24, 33, en 35), vertegenwoordigen de de novo onevenwichtige translocaties waarbij de verdubbelde regio van maternale oorsprong is 64,5% (20/31) van de volledig informatieve gevallen. De combinatie van deze gegevens met de bevinding dat in acht van deze gevallen (gevallen 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28, en 32) drie allelen (Fig. 1, Online Resource 1: Table S2), twee maternale en een vaderlijke, ten minste in een deel van de duplicatie regio aanwezig waren, is het opkomende scenario dat in niet minder dan 25% (8 van 31), de primaire oorzaak voor het optreden van de novo onevenwichtige translocaties een maternale meiotische niet-disjunctie is, gevolgd door een gedeeltelijke trisomie redding van de supernumeraire maternale chromosoom (Fig. 1a). De meest waarschijnlijke verklaring voor de aanwezigheid van drie allelen binnen de gedupliceerde regio, twee maternale en één paternale, zou een niet-disjunctie bij de maternale meiose I (mat-MI) zijn (Fig. 1A.I). Als alternatief moet een meiotische recombinatie proximaal aan of op het translocatie breekpunt voorafgegaan zijn aan een niet-disjunctie in maternale meiose II (mat-MII). Daarentegen kunnen in de 12 gevallen (4-6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34, en 37) met hetzelfde maternale gedupliceerde haplotype andere mechanismen niet worden uitgesloten (Fig. 1b), hoewel ze ook het gevolg kunnen zijn van ofwel mat-MI niet-disjunctie (Fig. 1A.I), na een telomerische crossing-over, volgens het preferentiële voorkomen van telomerische cross-overs aangetoond voor sommige niet-gedisjoineerde chromosomen (Oliver et al. 2014) of een maternale MII (mat-MII) niet-disjunctie (Fig. 1A.II), zoals gerapporteerd in een aantal gevallen van trisomie redding (herzien in Chantot-Bastaraud et al. 2017).

Het is bekend dat anafase achterblijven van het boventallige chromosoom, gevolgd door zijn trapping binnen een micronucleus, aan de basis ligt van veel chromothripsis gebeurtenissen (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). Bijgevolg wordt in een dochtercel het boventallige chromosoom geëlimineerd, terwijl in de andere de verbrijzeling van het micronucleaire genomische materiaal, gevolgd door de re-embedding van alle of sommige fragmenten binnen de hoofdkern kan resulteren in een massale reorganisatie van het oorspronkelijke chromosoom dat ofwel de meeste van zijn materiaal handhaaft, hoewel gereorganiseerd in een nieuwe volgorde, of enkele van zijn porties verliest (Fig. 1a), welke delen van het oorspronkelijke chromosoom verloren gaan en welke behouden blijven zou kunnen afhangen van stochastische gebeurtenissen, van de geneigdheid van de gebroken uiteinden om met elkaar of met andere delen van het genoom te integreren, en/of van de daaropvolgende selectie van cellen die kunnen overleven en zich vermenigvuldigen in de aanwezigheid van minimale segmentale onevenwichtigheden. In theorie kunnen centrische fragmenten als supernumeraire markerchromosomen behouden blijven door hun circularisatie met vorming van ringchromosomen, waardoor de afwezigheid van telomere sequentie aan beide uiteinden wordt opgeheven. Het behoud van boventallige interstitiële acentrische fragmenten vereist ook de vorming van een neocentromeer of, als alternatief, de invanging van het fragment door een ander chromosoom met de vorming van een de novo insertionele translocatie. Inderdaad, Kato et al. (Kato et al. 2017) rapporteerden onlangs een geval van de novo interstitiële translocatie afgeleid door chromothripsis van een supernumerair chromosoom aanwezig in een trisomische zygote. Ten slotte vereist het behoud van supernumeraire fragmenten uitgerust met een telomeer aan één uiteinde ofwel een telomeervangst, bijv. een getransloceerd supernumerair markerchromosoom zoals gerapporteerd in Vetro et al. (2012) (gevallen 2 en 3) of de vangst door een ander chromosoom, het ontvangende chromosoom, dat zijn distale gedeelte verliest en zo een 46-chromosoomcel vormt met een onevenwichtige de novo translocatie, zoals hier beschreven. Inderdaad, geval 6 met de verdubbeling van hetzelfde maternale haplotype (Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2) illustreert het optreden van een chromothripsis gebeurtenis (Fig. 1a), zoals blijkt uit de aanwezigheid van twee niet-contigue verdubbelde regio’s gescheiden door ~ 1,3 Mb waarvan de interstitiële een omgekeerde oriëntatie heeft (Online Resource 2: Figuur S15). Chromothripsis-gebeurtenissen zijn waargenomen in een aantal gevallen van de novo ongebalanceerde translocaties (Weckselblatt et al. 2015), en van de meeste van hen is gemeld dat ze van vaderlijke oorsprong zijn en meer dan twee chromosomen betreffen (Marcozzi et al. 2018). Daarentegen was de ongebalanceerde translocatie in onze casus 6 van maternale oorsprong en inderdaad de novo, in overeenstemming met FISH-onderzoek van ouderlijke metafasen. Bovendien, althans zoals beoordeeld door de hoge-resolutie (1M) aCGH en FISH-onderzoeken, betrof het slechts twee chromosomen, terwijl een complexere herschikking werd uitgesloten. Daarom is het verleidelijk om te speculeren dat de zygote of het vroege embryo trisomisch was voor chromosoom 8 als gevolg van ofwel een meiotische of postzygotische maternale non-disjunctie. De verbrijzeling van het supernumeraire chromosoom 8 werd gevolgd door het herstel van slechts twee niet-contigue delen, waaronder het telomere deel dat, toen het al weer aan elkaar was genaaid, werd overgenomen door de ontvanger 18q (Fig. 1a).

Het model van de vorming van de novo onevenwichtige translocaties, uitgaande van een trisomische zygote, past ook bij casus 24, hoewel we geen ondersteunend moleculair onderzoek konden uitvoeren. Echter, de aanwezigheid van een residuele cellijn trisomisch voor chromosoom 9, samen met een hoofdcellijn met een normaal karyotype en een derde met de onevenwichtige t(14;9) translocatie suggereert hoe, uitgaande van een trisomische zygote, verschillende cellijnen kunnen worden gevormd, sommige met het totale verlies van het boventallige chromosoom en andere met het verlies van een deel ervan (9p) en het overblijvende deel (de volledige 9q) gevangen door een ander chromosoom. Dit type mozaïek van drie cellijnen is zelden gedocumenteerd (Phillips et al. 1997), maar in de prenatale diagnostiek komen mozaïeken met één normale cellijn en een tweede met een de novo ongebalanceerde translocatie relatief vaak voor en in de meeste daarvan kan een verhoogde maternale leeftijd worden vastgesteld (Kovaleva en Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).

Een onafhankelijke ondersteuning voor de hypothese dat maternale non-disjunctie een belangrijke trigger is voor de novo ongebalanceerde translocaties, is een verhoogde maternale leeftijd. Inderdaad, in onze acht gevallen (gevallen 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28, en 32), waar de duplicatie zonder enige twijfel gekoppeld was aan een maternale meiotische niet-disjunctie (twee verschillende maternale allelen binnen het duplicatiegebied), werd een stijging van de gemiddelde maternale leeftijd gedocumenteerd (34,75 jaar, Online Resource 1: Tabel S1), rekening houdend met het feit dat de gemiddelde maternale leeftijd in Italië in 2016 31,8 jaar was (ISTAT, https://www.istat.it/). Een verhoging (33,5 jaar) werd ook vastgesteld in de 12 gevallen (gevallen 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 en 37) met duplicatie van hetzelfde maternale allel, compatibel met een maternale niet-disjunctie als initiërende gebeurtenis. Zelfs in de gevallen waar de duplicatie vaderlijk was, werd een toename, hoewel veel beperkter, in de gemiddelde maternale leeftijd (32,6 jaar) aangetoond, wat er mogelijk op wijst dat andere mechanismen dan maternale niet-disjunctie een rol kunnen spelen bij de vorming van deze onevenwichtige translocaties. Inderdaad, in de vier gevallen (3, 8, 29, en 36) geanalyseerd met SNP array geen maternale hetero-isodisomie aanwezig was in de niet-gedupliceerde deel van de homologe chromosomen (Online Resource 1: Table S2), zoals men zou hebben verwacht voor een trisomic zygote waarin de supernumeraire vaderlijke chromosoom had ondergaan chromothripsis met de redding van alleen de telomerische deel. Dus, ook rekening houdend met de verwaarloosbare frequentie van trisomie als gevolg van missegregatie in paternale meiose (Nagaoka et al. 2012), lijkt het optreden van onevenwichtige translocaties ontstoken door gedeeltelijke trisomische redding van een paternale-van-oorsprong trisomische zygote zeer onwaarschijnlijk. In plaats daarvan lijken andere mechanismen, zoals een overgeërfde of postzygotische dubbelstrengs paternale breuk die gerepareerd moet worden door telomeer capture, aannemelijker (Fig. 1b). Inderdaad, case 25 die mozaïek is voor twee cellijnen, aanwezig in bloed en in fibroblasten, met een terminale 2q deletie en een afgeleid chromosoom der(2)t(2q;14q) van vaderlijke oorsprong (Online Resource 2:Figuur S9), past bij deze hypothese. Dus, in de aanwezigheid van een terminale deletie, kunnen verschillende reparatie mechanismen optreden op verschillende tijdstippen in verschillende cellen van het vroege embryo, uiteindelijk leidend tot een mozaïek toestand. In dit model initieert het gedeleteerde chromosoom de translocatie-gebeurtenis, optredend als de ontvanger, terwijl het gedupliceerde de donor is, optredend als schadeherstellend (Fig. 1b). Het is echter niet mogelijk om te onderscheiden of de deletie daadwerkelijk de eerste gebeurtenis is die tot de translocatie leidt of in plaats daarvan secundair is aan de vorming van een dicentrisch chromosoom (Fig. 1BIII en IV) dat, als gevolg van zijn asymmetrische breuk, een inv-dup del chromosoom en een eenvoudig verwijderd chromosoom genereert, waarbij het laatste vervolgens wordt gerepareerd door telomeervangst (Fig. 1b). Het is mogelijk dat de persistentie van de dicentrische voorbij de eerste embryonale delingen resulteert in breuken van verschillende grootte in de verschillende cellen, opnieuw gerepareerd door telomerase of telomeer capture.

Het is opmerkelijk dat, ongeacht het mechanisme, een hoge prevalentie van gevallen, waarin beide onevenwichtigheden dezelfde ouderlijke oorsprong hebben, werd gedetecteerd (Fig. 1, Online Resource 1: Table S2), ondanks een biparentale oorsprong van deletie en duplicatie zou worden verwacht in de helft van de gevallen, volgens een postzygotische finale gebeurtenis. De demonstratie van een duidelijke compartimentering van de twee sets ouderlijke chromosomen in muizenembryo’s tot het 8-cel stadium (Du et al. 2017) kan een verklaring bieden. Aangezien deze periode samenvalt met een zeer hoge chromosomale instabiliteit, (McCoy et al. 2017), is het verleidelijk om te speculeren dat een mechanisme zoals telomeer capture, noodzakelijk voor de stabilisatie van een eerdere structurele afwijking, optreedt op dezelfde ouderlijke chromosomale set van de oorspronkelijke afwijking. Daarentegen zou verwacht worden dat verdere latere heraanpassingen willekeurig zouden optreden, waarbij chromosomen van beide ouderlijke oorsprong betrokken zouden zijn, wat zou leiden tot een onevenwichtig getranslokeerd chromosoom van biparentale oorsprong, zoals we inderdaad in vijf gevallen vonden (gevallen 10, 12, 27, 30, en 31; Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2).

Zoals voor klasse C herschikkingen, vonden we geen bijzonderheden aan de knooppunt breekpunten die zouden kunnen verduidelijken of hun stabilisatie door telomeer vastlegging van het chromosomale deel tegenover het verwijderde te wijten is aan een ander mechanisme dan de gevallen waarin de vastlegging van het telomeer afhankelijk is van een ander chromosoom. Deze analyse kon echter slechts in twee gevallen worden uitgevoerd. De bevinding dat in 4 van de 5 gevallen zowel de deletie als de duplicatie van vaderlijke oorsprong waren, suggereert dat zij ofwel door een oorspronkelijke deletie ofwel door de breuk van een dicentrisch chromosoom zijn ontstaan.

Complexe onevenwichtige translocaties en inversies (klassen B en D)

Er is algemene overeenstemming dat deze herschikkingen het gevolg zijn van een intermediair dicentrisch, na zijn asymmetrische breuk leidend tot een inv-dup del en een eenvoudig verwijderd chromosoom (Fig. 1B.III). Het verkrijgen van een stabiliserende telomere sequentie kan op verschillende manieren gebeuren: door telomerase gemedieerde toevoeging van de novo TTAGGG sequenties, het vastleggen van telomeren van het distale deel van een ander chromosoom (Yu en Graf 2010) of van het tegenoverliggende deel van hetzelfde chromosoom (Buysse et al. 2009; Fan en Siu et al. 2001), of zelfs de vorming van een ringchromosoom (Rossi et al. 2008). De twee getransloceerde inv-dup del(8p) gevallen die we konden genotyperen (gevallen 42 en 44) zijn, zoals verwacht (Giglio et al. 2001), ontstaan door NAHR bij mat-MI, zoals aangetoond door de aanwezigheid van twee maternale en één paternale allelen in de 8p duplicatie regio (Online Resource 1: Tabel S2). Deze recurrente abnormale recombinatie wordt gemedieerd door zeer identieke segmentale duplicaties gelegen op 8p23 binnen een normaal en een omgekeerd chromosoom 8 (Giglio et al. 2001). In de zygote zal het resulterende dicentrische chromosoom waarschijnlijk verschillende breukgebeurtenissen in verschillende cellen ondergaan, wat soms leidt tot een mozaïekconditie met een del(8p) cellijn en een tweede met de inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010), of in uitzonderlijke gevallen zelfs een derde met de inv-dup del(8p) eindigend op de distale regio van een ander chromosoom (Pramparo 2004). Deze mozaïeken worden vaker gedetecteerd in de prenatale diagnose, terwijl in het postnatale leven een enkele cellijn met de inv-dup del(8p), al dan niet getranslokeerd, de meest frequente bevinding is, althans in bloed. In onze drie getransloceerde gevallen (gevallen 42, 43, en 44), werden telomeren gedoneerd door 6q, 17p, en Xq, respectievelijk, allemaal van maternale oorsprong, en met hetzelfde duplicatie haplotype van de maternale chromosomen 6, 17, en X, zoals verwacht voor een stabilisatie gebeurtenis die postzygotisch optrad. In de overige drie gevallen (gevallen 39, 40, en 45), die, net als alle inv-dup del herschikkingen waarbij 8p niet betrokken is, niet-recurrent zijn, was de getransloceerde inv-dup van vaderlijke oorsprong met identieke vaderlijke allelen in de duplicatie regio, terwijl telomeer capture werd geleverd door een vaderlijk-afkomstig chromosoom in twee gevallen (gevallen 39 en 49, Online Resource 2., S3, S4), en telomeer capture werd geleverd door een vaderlijk-afkomstig chromosoom in twee gevallen (gevallen 39 en 49, Online Resource 2., S3, S4): Figuren S3, S4) en een maternale een in het derde geval (geval 45), een foetus waarin de getransloceerde chromosoom t(inv-dup5p;3q) was in mozaïek met een cellijn die een niet getransloceerde inv-dup del (5p) (Online Resource 2: figuur S12). Met name de 5p duplicatie is van verschillende grootte in de twee cellijnen (Online Resource 1: Tabel S1), inderdaad waaruit blijkt dat de oorspronkelijke dicentric chromosoom vermoedelijk aanwezig in de zygote of in het zeer vroege embryo (Fig. 1b), verschillende breuken ondergingen in de verschillende cellen, voorbij het splitsingsstadium embryo.

Identieke gedupliceerde allelen zijn bona fide gerapporteerd in alle inv-dup del herschikkingen waarbij 8p niet betrokken is, wat duidt op een intrachromosomale oorsprong van deze herschikkingen (Hermetz et al. 2014). Dienovereenkomstig lijken deze inv-dup del herschikkingen het uiteindelijke resultaat te zijn van een initiële mitotische gebeurtenis, mogelijk in het vroege embryo (Voet 2011), zoals een dubbelstrengs breuk gevolgd door intrastrengs pairing op relatief nabije plaatsen van inverted homologe sequenties, leidend tot de generatie van het dicentrische chromosoom met een tussenliggende normale kopie regio (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Zoals reeds vermeld, kan het reciproke product van de inv-dup del, namelijk een geschrapt chromosoom, worden gerepareerd en gestabiliseerd door het vastleggen van het distale gedeelte van een niet-homoloog chromosoom, of de tegenoverliggende arm van hetzelfde chromosoom, wat resulteert in een eenvoudige onevenwichtige translocatie of inversie, respectievelijk, zoals we voorstellen voor een aantal van de herschikkingen die in de klassen A en C (Fig. 1b).

Breakpoint junctions

De sequencing van breakpoint translocation junction kon worden gedaan in 26 gevallen (Online Resource 1: Tabel S1, Online Resource 2: Figuur S1), hoewel in 4 gevallen cryptische complexiteit (gevallen 4, 10, 28, en 51) belemmerd een fijne sequencing. Alternatieve niet-homologe end joining (alt-NHEJ) of microhomologie-gemedieerde breuk-geïnduceerde replicatie (MMBIR) kenmerken zoals microhomologies en templated of non-templated kleine inserties werden gedetecteerd in 16 gevallen (gevallen 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50, en 52) (Online Resource 2: figuur S1). Opmerkelijk is dat, hoewel in de gevallen 18 en 40 de herschikking plaatsvond binnen Alu-sequenties, de aanwezigheid van respectievelijk 5 bp korte getempliseerde insertie en 4 bp microhomologie aantoonde dat de herschikking geen NAHR gemedieerd mechanisme tot stand bracht, maar eerder een alt-NHEJ of MMBIR. Canonieke NHEJ (c-NHEJ, stomp eind juncties) kwam in vier gevallen voor (gevallen 26, 29, 31, en 43). In de gevallen 2 en 38, de breekpunt juncties, waren aan de rand van homologe retrotransposon (Online Resource 2: Figuur S13). Deze bevinding suggereert dat in een minderheid van de gevallen herstelmechanismen, zoals telomeer capture, door deze sequenties worden vergemakkelijkt. Hoewel Robberecht et al. vonden dat de meeste van hun de novo ongebalanceerde translocaties werden gemedieerd door NAHR tussen LINEs, HERVs, of segmentale duplicaties (Robberecht et al. 2013), kunnen we een NAHR-gebeurtenis ten minste uitsluiten in geval 2, waar de aanwezigheid van twee gedupliceerde maternale haplotypen, waarvan er een getranslokeerd is naar het ontvangende chromosoom, duidelijk wijst op een mat-MI niet-disjunctie (Fig. 1, Online Resource 1: Table S2), waardoor het onmogelijk is om de translocatie toe te schrijven aan een meiotische gebeurtenis. Inderdaad is aangetoond dat LINE-1-gemedieerde retrotranspositiegebeurtenissen zich voordoen in somatische cellen van het vroege menselijke embryo, in menselijke embryonale stamcellen, en in ieder geval bij muizen voornamelijk in de embryogenese (voor een review Kazazian en Moran 2017), wat ondersteunt dat in onze gevallen de vorming van de translocatie ook een postzygotische gebeurtenis was.

Gecombineerd wijzen deze kenmerken erop dat reparatie-gebaseerde mechanismen (c-NHEJ en alt-NHEJ) en replicatieve reparatiemechanismen (MMBIR) verantwoordelijk zijn voor de kruising van het donorchromosoom met het ontvangende chromosoom, of het tegenoverliggende deel van hetzelfde chromosoom (Fig. 1).

Genotype-fenotype relatie

Hoewel genotype-fenotype correlaties in grote onevenwichtige herschikkingen, zoals die gerapporteerd in onze studie, in het algemeen nogal grof zijn, voegen de gegevens die wij rapporteren ook in deze context enige verdere details toe.

Het sterke bewijs dat sommige onevenwichtige translocaties afkomstig zijn van een zygote met een boventallig chromosoom dat een chromothriptische gebeurtenis ondergaat, suggereert dat het duplicatiegebied, hoewel schijnbaar alleen samengesteld uit de distale regio van het chromothriptische chromosoom, fragmenten van andere gedeelten kan bevatten, zoals het geval is van ons geval 6 en zoals aangetoond door Weckselblatt et al. (2015). In deze gevallen, als de grootte van de verbrijzelde stukken kleiner is dan die detecteerbaar door arrayGH, bestaat het risico om het abnormale fenotype alleen toe te schrijven aan de genen die gedupliceerd of verwijderd lijken, terwijl verdere morbiditeit te wijten kan zijn aan abnormale genexpressie gegenereerd door TAD-verstoring (Fukami et al. 2017).

Verder, in onevenwichtige translocaties die afkomstig zijn van gedeeltelijke trisomie-redding, als de chromotripsis zou optreden op het supernumeraire chromosoom van vaderlijke oorsprong, zou de daaropvolgende maternale hetero/isodisomie voor de resterende twee chromosomen verdere pathogeniciteit kunnen genereren (Niida et al. 2018), hetzij door ziekteveroorzakende varianten die in de moeder in heterozygote toestand aanwezig zijn, te reduceren tot homozygote toestand, hetzij door de aanwezigheid van ingeprente genen die alleen door het vaderlijke allel tot expressie worden gebracht.

Als laatste overweging is het verleidelijk om te speculeren dat de keuze van welk telomeer wordt vastgelegd voor de stabilisatie van het gebroken chromosoom, mogelijk niet willekeurig is, maar wordt beïnvloed door de deregulatie van de oorspronkelijke TAD’s (Topologically Associated Domains), waardoor op zijn beurt een gunstig substraat ontstaat voor specifieke inter-chromosomale contacten en ruimtelijke 3D-chromatinecompartimentering (Dekker en Mirny et al. 2016).