In wezen behelst celkweek de distributie van cellen in een kunstmatige omgeving (in vitro) die is samengesteld uit de nodige voedingsstoffen, ideale temperatuur, gassen, pH en vochtigheid om de cellen te laten groeien en zich te vermenigvuldigen.

• In vivo – Wanneer bij het onderzoek levende biologische entiteiten in het organisme worden betrokken.

• In vitro – Wanneer het onderzoek wordt uitgevoerd met biologische entiteiten (cellen, weefsel enz.) die van hun natuurlijke biologische omgeving zijn geïsoleerd. Bijv. weefsel of cellen geïsoleerd uit de lever of de nier.

Waar stukjes weefsel in de juiste cultuur kunnen worden gebracht om cellen te produceren die vervolgens kunnen worden gebruikt voor kweek (explantcultuur), kunnen cellen uit weefsels (zacht weefsel) worden verkregen door middel van enzymatischereacties. Enzymen zoals trypsine en proname worden gebruikt om het weefsel af te breken en de gewenste cellen vrij te maken.

Wanneer cellen rechtstreeks uit het organisme/dierlijk weefsel (of zelfs plantenweefsel) zijn verkregen door middel van enzymatische of mechanische technieken, worden dergelijke cellen primaire cellen genoemd. Cellen die zich (na de eerste subcultuur) onder speciale omstandigheden onbeperkt blijven vermenigvuldigen, worden cellijnen genoemd.

Deze specifieke cellen zijn meestal gedurende lange tijd gepasseerd, waardoor zij homogene (vergelijkbare) genotypische en fenotypische eigenschappen krijgen.

Morfologie

Gebaseerd op hun uiterlijk kunnen cellen in cultuur in drie hoofdgroepen worden ingedeeld:

• Fibroblastisch – Hieronder vallen cellen die de neiging hebben bipolair/multipolair te zijn met langwerpige vormen. Deze cellen hechten zich tijdens hun groei aan het substraat.

• Epitheelcellen – Epitheelachtige cellen hebben een veelhoekige vorm met regelmatige afmetingen. Hoewel ze de neiging hebben in afzonderlijke gebieden te groeien, hechten deze cellen zich ook aan het substraat.

• Lymfoblast – Deze cellen zijn gewoonlijk bolvormig en hechten zich niet aan het oppervlak van het substraat. Daarom worden ze in suspensie gekweekt.

* Voor vaste platen worden verhardingsmiddelen (zoals agar) gebruikt wanneer de vloeibare media met agar worden gebruikt.

Betekenis van celcultuur

Celcultuur is een belangrijke techniek in zowel de cellulaire als de moleculaire biologie, aangezien zij het beste platform biedt om de normale fysiologie en de biochemie van cellen te bestuderen. Een cel is de fundamentele structurele, functionele en biologische eenheid van alle levende wezens.

Om een organisme of bepaalde weefsels te begrijpen, is het belangrijk te begrijpen hoe de cellen werken. Door celkweek wordt dit mogelijk, vooral omdat de primaire cellen lijken op de oudercellen van het organisme/weefsel.

Wat men ook leert over de cellen in vitro, het is representatief voor wat er met het organisme/weefsel gebeurt. Dit maakt celkweek van groot belang voor de ontwikkeling van vaccins, screening (geneesmiddelen enz.) en diagnose van bepaalde ziekten/aandoeningen.

Gezien het feit dat verschillende celtypen verschillende omgevingen vereisen voor proliferatie, zijn er verschillende soorten media die voor kweek worden gebruikt, zoals onder andere serumvrije media en media die serum bevatten.

Als eenmaal in de juiste omstandigheden is voorzien, zullen de cellen in aantal toenemen en kolonies vormen, die dan gemakkelijk kunnen worden gezien en geïdentificeerd.Dit alles vereist echter dat het doel van de procedure wordt begrepen.

Als men goed begrijpt wat men met de procedure wil bereiken, wordt het gemakkelijker om de kweek met de juiste componenten voor te bereiden. Door te begrijpen wat het doel van de procedure is, weet de onderzoeker of hij een selectief medium (waarin specifieke cellen kunnen groeien) of een differentieel medium (waarin verschillende soorten cellen kunnen groeien) moet bereiden.

Primaire celcultuur

Celcultuur is een proces waarbij cellen (dierlijke of plantaardige cellen) uit het organisme worden verwijderd en in een kunstmatige omgeving met gunstige groeicondities worden gebracht. Hierdoor kunnen onderzoekers de cellen bestuderen en er meer over te weten komen.

Er zijn drie hoofdtypen celkweek, waaronder:

• Primaire celkweek
• Secundaire celkweek, en
• Cellijn

Hierbij zullen we ons richten op primaire celkweek.

Er zijn twee soorten primaire cellen:

Aanhangende cellen – Ook wel ankerafhankelijke cellen genoemd, dit zijn het soort cellen dat gehechtheid nodig heeft voor groei. Adherente cellen zijn immobiel en worden bijvoorbeeld uit de nieren verkregen.

Suspensiecellen – Dit zijn het soort cellen dat niet gehecht hoeft te zijn om te kunnen groeien. Zij worden daarom ook wel ankeronafhankelijke cellen genoemd, en omvatten cellen zoals de lymfocyten in het bloed.

In de primaire celkweek worden cellen die zijn verkregen uit ouderweefsels (levende weefsels) zoals de lever en de nier, in geschikte media gebracht om te groeien. Wanneer de cellen eenmaal zijn verkregen, kunnen zij worden gekweekt als explantiekweek, suspensie of monolayer.

* Bij primaire celkweek moeten de cellen zijn verkregen uit het ouderlijk/levend weefsel. Dat wil zeggen dat zij niet afkomstig zijn van een ander kweekproces.

Voordat de cellen worden gekweekt, ondergaan zij eerst een enzymatische behandeling voor dissociatie. Echter, moet worden voor een minimale hoeveelheid tijd om te voorkomen dat beschadiging of het doden van de cellen. Zodra afzonderlijke cellen zijn verkregen, worden zij vervolgens op passende wijze gekweekt in media om hen in staat te stellen te groeien (zich te delen) en de gewenste aantallen te bereiken.

In eerste instantie heeft de cultuur de neiging heterogeen te zijn in die zin dat zij is samengesteld uit verschillende soorten cellen die uit het weefsel zijn verkregen.Hoewel dit via het in vitro proces (in een cultuur in geschikte media) kan worden gehandhaafd, zou dit slechts gedurende een beperkte periode het geval zijn.

Door het transformatieproces kunnen de primaire cellen gedurende een lange periode worden gebruikt, waardoor de cultuur in de loop van de tijd verandert. Deze cellen worden continucellijnen genoemd.

Het gebruik van primaire cellen verdient echter de voorkeur boven dat van continucellijnen, omdat zij (fysiologisch) meer lijken op invivocellen (cellen uit het levende weefsel). Bovendien kunnen doorlopende cellijnen bepaalde veranderingen ondergaan (fenotypische en genotypische veranderingen) die tijdens de analyse tot discrepanties zouden leiden. Als zodanig kunnen zij niet worden gebruikt om te bepalen wat er met de in vivo cellen gebeurt. Het is om deze reden dat primaire cellen de voorkeur.

Gezien het feit dat de primaire cellen aanzienlijk lijken op de cellen verkregen uit levend weefsel, ze zijn belangrijk voor onderzoeksdoeleinden in dat zij kunnen worden gebruikt om hun functies, metabole regulaties, cel fysiologie, ontwikkeling, gebreken en voorwaarden die het weefsel van belang te bestuderen.

Ook worden zij onder meer gebruikt voor de productie van vaccins, de screening van geneesmiddelen op basis van gentechnologie, toxiciteitstests en prenatale diagnose.

Celkweekmedia

In celkweektechnieken worden cellen (of weefsels) uit een plant of een dier verwijderd en in een nieuwe, kunstmatige omgeving gebracht die hun proliferatie (overleving en groei) kan ondersteunen.

Een aantal van de vereisten van een dergelijke omgeving voor de proliferatie van de cellen zijn onder meer:

• Een substraat (voedingsbron)
• Ideaal temperatuurbereik (gecontroleerd)
• Groeimedium, en
• Ideale pH onder andere

Hier, zullen we ons concentreren op het medium (celkweekmedium)

Hoewel er verschillende types van kweekmedium zijn (voor verschillende soorten cellen), zijn ze typisch samengesteld uit:

• Glucose
• Aminozuren
• Vitaminen
• Anorganische zouten
• Aanhechtingsfactoren enz.

Er zijn twee hoofdtypen voedingsbodems. Deze omvatten:

Natuurlijke voedingsbodems – Natuurlijke voedingsbodems bestaan uit biologische vloeistoffen die in de natuur voorkomen. Hoewel dit type medium voor een groot aantal cellen kan worden gebruikt, is het grootste nadeel ervan dat de exacte componenten die voor bepaalde cellen nodig zijn, kunnen ontbreken, wat de reproduceerbaarheid sterk kan beïnvloeden.

Kunstmatige media – Kunstmatige media worden ook wel synthetische media genoemd en zijn media die worden geproduceerd door toevoeging van voedingsstoffen zoals vitaminen, gassen (zuurstof en kooldioxide) en eiwitten, naast andere. Deze organische en anorganische voedingsstoffen worden toegevoegd om aan de specifieke behoeften van bepaalde cellen te voldoen en zo de ideale omgeving voor hun groei te creëren.

Zo kunnen zij onder meer voor de volgende doeleinden worden gebruikt:

• Het onmiddellijk doen overleven van de cellen
• Het mogelijk maken van een langdurige overleving van de cellen
• Het mogelijk maken van een onbeperkte groei van de cellen
• Het mogelijk maken van gespecialiseerde functies

Anderzijds kan cultuur worden gecategoriseerd als:

Selectieve media- Dit is een speciaal soort media waarop alleen bepaalde cellen kunnen groeien. Zo kan bijvoorbeeld bloedagar (gebruikt om Streptococcus & Moraxella-soorten te isoleren) door toevoeging van antibiotica in een selectief medium worden veranderd.

Differentiële media- Dit type media laat verschillende soorten cellen/micro-organismen groeien, afhankelijk van hun metabolisme.

Zoals hierboven vermeld, worden verschillende soorten synthetische media op zodanige wijze bereid dat zij de ideale proliferatie-omgeving voor bepaalde cellen bieden. Om deze reden kunnen synthetische media in vier grote categorieën worden onderverdeeld.

Deze omvatten:

Serumhoudende media – In deze typen media wordt serum (foetaal runderserum) gebruikt als drager voor voedingsstoffen en groeifactoren, naast andere die gewoonlijk niet in water oplosbaar zijn.

Serumvrije media – Deze typen media worden gewoonlijk geproduceerd ter ondersteuning van de kweek van één celtype. Als zodanig levert het bepaalde voedingsstoffen en andere factoren die door het celtype worden vereist. In deze media is serum afwezig omdat het enkele nadelen vertoont en kan resulteren in een verkeerde interpretatie van immunologische resultaten.

Chemisch gedefinieerde media – Zoals de naam al doet vermoeden, is dit type media samengesteld uit contaminatie-vrije zuiver organische en anorganische ingrediënten. Bestanddelen van dit type media worden meestal geproduceerd door middel van genetische manipulatie in bacteriën/gist.

Proteïnevrije media – Eiwitvrije media zijn meestal zonder enige vorm van eiwit. Het wordt grotendeels gebruikt voor het bevorderen van een betere groei van de cellen en eiwitexpressie in aanvulling opfaciliteren voor de zuivering van een uitgedrukt product.

Enkele van de belangrijkste bestanddelen van celkweekmedia zijn:

• Nutriënten – geleverd doorpeptiden en aminozuren, die de bouwstenen zijn van eiwitten
• Koolhydraten voor energie
• Essentiële mineralen zoals calcium, magnesium, fosfaten en ijzer onder andere buffermiddelen zoals acetaten om de kweekmedia te stabiliseren
• vitaminen
• PH veranderingsindicatoren zoals fenolrood

Celkweekmedia worden gebruikt voor de proliferatie van cellen, die dan kunnen worden geïdentificeerd en bestudeerd. Als zodanig kunnen ze worden gebruikt voor verschillende doeleinden, waaronder onderwijs, diagnose en behandeling van een ziekte.

Celsuspensie

In kweekmethoden verwijst celsuspensie naar een kweeksoort waarbij cellen worden gesuspendeerd in een vloeibaar medium.

Om afzonderlijke cellen te verkrijgen, wordt een brokkelige callus (klein weefsel dat gemakkelijk uit elkaar valt) in een geschud vloeibaar medium gebracht (schommeling maakt gasuitwisseling mogelijk, in tegenstelling tot een vast medium), waardoor het uiteenvalt. Hierdoor kunnen afzonderlijke cellen vrijkomen, die vervolgens worden overgebracht naar een ander versmedium.

Cellensuspensieculturen hebben een groot voordeel ten opzichte van de stationaire culturen, aangezien de cellen hierdoor gelijkmatig kunnen worden omspoeld. Aangezien het medium de neiging heeft in beweging te worden gebracht, kan het bovendien worden belucht, zodat de cellen van gassen worden voorzien. Aangezien het medium een suspensie is, wordt het ook gemakkelijk om de inhoud van de cultuur te manipuleren.

Zoals elke andere cultuur moet suspensiecelcultuur onder gecontroleerde omstandigheden plaatsvinden, zodat de cellen een ideale omgeving hebben om zich te vermenigvuldigen. Zodra zij ongeveer 80% confluentie hebben bereikt, is het tijd voor een subcultuur om een verdere goede groei te verzekeren.

* 80% confluentie verwijst naar de toestand waarbij80% van het kweekoppervlak bedekt is met de groeiende cellen.

In sommige gevallen kunnen de cellen in suspensie zich vasthechten aan het plastic oppervlak van de kweekfles of zelfs klonten vormen. In dergelijke gevallen kan een pipet worden gebruikt om deze cellen op te pakken en uit te drijven op het oppervlak van de kolf en dus weg van het plastic oppervlak. Dit helpt bij het verkrijgen van afzonderlijke cellen, aangezien zij niet hechten aan het plastic oppervlak.

Rode bloedcelsuspensie

• (links: zonder hemolyse) rode bloedcelsuspensie (0,5% schapen-RBC’s in zoutoplossing), lijkt rood en ondoorzichtig.
• (midden: zonder hemolyse) RBC’s sedimenteerde spontaan gedurende 60 min. Merk op dat het supernatant niet gekleurd is.
• (rechts: hemolyse) RBC-suspensie behandeld met de hemolysine van S. pyogenes bij 37C gedurende 30 min, worden transparant door hemolyse.

Zie meer over rode bloedlichaampjes

Cellen tellen

Het tellen van het aantal cellen in een suspensie is een proces waarbij een kleurstof wordt gebruikt. Wanneer bijvoorbeeld trypanblauw wordt gebruikt, dringt dit door het celmembraan van de dode cellen, maar niet door dat van de levende cellen.

De cellen worden dan voorzichtig onder het dekglaasje in een hemocytometer (die de telkamer bevat) uitgestoten en onder een microscoop geobserveerd. De cellen worden dan geteld binnen een bepaald aantal vierkantjes voor de berekeningen.

Betekenis

Deze methode geniet grotendeels de voorkeur omdat de cellen in een oplossing kunnen worden gesuspendeerd in plaats van in een vast medium te worden gehouden. Hierdoor wordt het gemakkelijker om de inhoud te manipuleren en te voorkomen dat ze clusters vormen. Met celsuspensies is het ook gemakkelijker afzonderlijke cellen onder de microscoop te observeren.

In dit geval wordt het mogelijk niet alleen de structuur van de cellen te bestuderen, maar ook te zien hoe goed ze gedifferentieerd zijn; dode en levende cellen worden onder de microscoop bekeken.

Cell Culture Protocol

Cell culture protocols zijn bedoeld om ervoor te zorgen dat de kweekprocedures volgens de vereiste normen worden uitgevoerd. Dit is niet alleen bedoeld om besmetting van de cellen te voorkomen, maar ook om ervoor te zorgen dat de onderzoekers zelf worden beschermd tegen elke vorm van besmetting.

Bovendien wordt verwacht dat de aard van het werk voldoet aan de juiste ethische richtlijnen. Daarom is het van essentieel belang ervoor te zorgen dat de gehele procedure in overeenstemming is met zowel de medisch-ethische richtlijnen als de richtlijnen voor dierproeven. Het overtreden van deze richtlijnen kan leiden tot zware straffen en zelfs tot sluiting van het laboratorium.

Voordat met het werk wordt begonnen, moet de volgende procedure worden gevolgd:

• Zorg ervoor dat de werkruimte wordt ontsmet (met 70 procent ethanol)
• Gebruik steeds een nieuw paar handschoenen. Als een paar handschoenen moet worden gebruikt voor een andere celkweek procedure, moeten ze worden ontsmet met 70 procent ethanol en laat aan de lucht drogen.
• Al het materiaal dat uit de kast is gehaald, moet ook worden ontsmet om besmetting te voorkomen
• Zoals pipetten, glazen potten en plastic dat voor de procedure wordt gebruikt, moeten worden geautoclaveerd

Hoewel er een breed scala van kweekmedia voor cellen is, moet er rekening mee worden gehouden dat celkweken, en met name primaire celkweken, gemakkelijk kunnen worden verontreinigd en bovendien het risico inhouden dat zij onopgemerkte virussen bevatten. Daarom moet al het materiaal als potentieel besmettelijk worden behandeld om infecties te voorkomen.

Voor de veiligheid moet het werk met celkweken bovendien worden uitgevoerd in een geschikte laminaire-stroomkap, waarbij de lucht van de onderzoeker wordt weggeleid.

Protocollen voor de bereiding van celkweken

Controleer altijd de informatie op de verpakking om er zeker van te zijn dat het medium geschikt is voor de te kweken cel,

Eenmaal bereid, moet de celcultuur onder het aanbevolen temperatuurbereik worden gehouden,

Controleer de cultuur om de 30- 48 uur en controleer op confluentie (wanneer de cellen het oppervlak van de cultuur volledig bedekken) – Dit is echter grotendeels afhankelijk van het type cellen.

Als de procedure is voltooid en de cellen zijn geanalyseerd, moet de kweek op de juiste wijze worden weggegooid. Hier is grote voorzichtigheid geboden, omdat de cellen tegen die tijd al zijn gaan woekeren en in aantal zijn toegenomen. Bovendien is de kans groot dat het specimen besmet is, waardoor de risico’s op infecties bij de onderzoeker toenemen als er niet op de juiste wijze mee wordt omgegaan.

Verwijdering

• Voor voorwerpen als scalpels, objectglaasjes en dekglaasjes moet de verontreiniging worden geautoclaveerd bij 121 graden Celsius en 15 psi (druk) gedurende ten minste 30 minuten. Als zij echter moeten worden weggegooid, is het van belang dat zij in een plastic zak en in de daarvoor bestemde container worden gedaan om later te worden verbrand.
• Bij vloeibaar afval is chemische desinfectie een van de beste methoden om het afvalproduct te inactiveren. Chemische producten zoals bleekwater kunnen voor dit doel worden gebruikt voordat de vloeistof in de gootsteenafvoer wordt gegoten.
• Voor vaste afvalstoffen geldt dat zij in een plastic zak worden verzameld om te worden verbrand. Anderzijds kunnen zij eerst worden geautoclaveerd alvorens te worden verbrand.

Conclusie

In het algemeen houdt celkweek, of het nu gaat om het gebruik van een suspensie of een stationair medium, de groei van cellen in een kunstmatige omgeving met gunstige omstandigheden in. Terwijl enzymatische actie kan worden gebruikt om cellen te verkrijgen voor cultuur, is het de mechanische uitsplitsing methode die de meeste voorkeur, gezien het feit dat het een eenvoudiger en minder traumatische manier van het verkrijgen van cellen biedt.

Deze methode behelst gewoon het snijden van een weefsel inkleine stukjes waaruit de uitgelopen cellen wordt vervolgens verzameld. Ook kan de primaire explantatietechniek worden gebruikt om de cellen te verkrijgen. Deze methode is echter meestal nuttig voor de uitsplitsing van kleinere hoeveelheden weefsel.

Terwijl alle cellen kunnen worden gebruikt in culturen tebserve hun gedrag, zijn embryonale weefsels de voorkeur (voor primaire cellen) in vergelijking met volwassen cellen, omdat ze cellen die meer levensvatbaar en kan snel prolifereren.

Hier is het ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen zijn van grotere hoeveelheid gezien het feit dat hun overlevingskans de neiging om lager in vergelijking met de sub-culturen. I

Om het succes van de culturen te vergroten, is het ook belangrijk ervoor te zorgen dat schade aan de cellen tot een minimum wordt beperkt, zowel tijdens de celverzameling als tijdens de verwerking. Dit is een aanvulling op het gebruik van het juiste medium voor de cellen in kwestie.

Op dezelfde lijn, neem een kijkje op soorten en technieken van weefselkweek.

Kijk naar MicroscopeMaster’s picks voor Microscoop Accessoires.

Zoals informatie over celdeling, celdifferentiatie en celkleuring en krijg wat inzicht in celtheorie.

Voor de meer gevorderden en een geweldige lectuur is Moleculaire Biologie van de Cel. Evenals het leren over Cytochemie.

Misschien bent u een student, leraar of hobbyist en wilt u MicroscopeMaster’s informatie over leuke microscoop experimenten volgen.

Zie ook Microscopiecultuur en Gevoeligheidsbeproeving

Terug van Celcultuur naar Hoofdpagina Celbiologie

Terug van Celcultuur naar MicroscopeMaster Home