3 Amylaseremmers

α-Amylase (1,4-α-d-glucan-glucanohydrolase, EC3.2.1.1) is een endoglucanase dat de hydrolyse katalyse van de endo α-(1,4) glycosidebindingen in zetmeel en verwante polysacchariden. De hydrolyse van zetmeel wordt eerst gekatalyseerd door α-amylase, aanwezig in menselijk speeksel, gevolgd door pancreasamylase in de twaalfvingerige darm. Humaan pancreas α-amylase (HPA) is een belangrijk farmacologisch doelwit voor de behandeling van type-2-diabetes. De kosten van HPA zijn echter relatief hoog voor onderzoeksdoeleinden. In plaats daarvan wordt varkens pancreas α-amylase (PPA) gebruikt voor in vitro verteringsmetingen. PPA bestaat uit 496 aminozuurresiduen en vertoont 83% identiteit met zijn menselijke tegenhanger HPA (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). PPA is een endo-type amylase en het katalyseert de hydrolyse van interne α-(1,4) glycoside bindingen in amylose en amylopectine door meervoudige aanval naar het niet-reducerende uiteinde (Robyt & French, 1970). De producten van hydrolyse van varkens pancreas α-amylase zijn voornamelijk maltose, maltotriose, en maltotetraose (Yook & Robyt, 2002). PPA heeft twee isomeren PPA isozyme-I (PPA-I) en PPA-II, die hetzelfde molecuulgewicht hebben maar enigszins verschillen in aminozuursamenstelling en iso-elektrisch punt (Pasero et al., 1986).

Natuurlijk voorkomende α-amylase remmers omvatten op eiwit gebaseerde remmers en secundaire metabolieten. De eerste vallen buiten het bestek van dit artikel, omdat zij de neiging hebben te denatureren bij thermische of zure (maagzuur) behandeling en hun activiteit verliezen wanneer zij de dunne darm bereiken. Hier volgt een samenvatting van de meest recente literatuur over α-amylase remmers. De methoden die gebruikt zijn bij het meten van hun remmingsactiviteit worden ook vermeld, omdat verschillende methoden kunnen resulteren in verschillende IC50-waarden. In vergelijking met α-glucosidase zijn er minder rapporten over α-amylase en de meeste studies hebben betrekking op polyfenolen.

Isookanine (57) (Fig. 3.8), geïsoleerd uit Spaanse naalden, Bidens bipinnata, werd een matige remmingsactiviteit op HPA aangetoond (IC50 van 0,447 mg/mL of 156 μM), gemeten met behulp van jodometrische assay (Yang et al., 2012). Opgemerkt moet worden dat isookanine twee catecholische eenheden bevat en dus naar verwachting een goede reductant is, die jodium kan verminderen waardoor vals-positieve resultaten kunnen ontstaan.

Figuur 3.8. Chemische structuren voor amylaseremmers, verbindingen 57-59, 5-caffeoyl-quininezuur, en 4,5-dicaffeoyl-quininezuur.

Van het blad van de waternoot (Syzygium aqueum) werden myricetine-3-O-rhamnoside (9) en europetine-3-O-rhamnoside (10) (Fig. 3.2) werden geïsoleerd, en de remmingsactiviteit op α-amylase werd gemeten met behulp van DNSA-assay en bleek 10 keer (EC50 van ~ 2,0 μM) sterker te zijn dan acarbose (EC50 van 19 μM). Een dergelijke hoge activiteit wordt zelden waargenomen bij polyfenolische verbindingen en rechtvaardigt verder onderzoek, met name naar het remmingsmechanisme en de selectiviteit wanneer deze verbindingen worden uitgedaagd met een complexe voedselmatrix. Myricetine is een sterke radicaalvanger en dus is de stabiliteit van 9 en 10 ook een punt van zorg. De auteurs meldden dat quercetine een vergelijkbare EC50 (17 μM) had als acarbose (19 μM). Met behulp van de troebelheidstest die we in ons lab ontwikkeld hebben, konden we geen enkele remmende activiteit van quercetine tegen pancreatische α-amylase detecteren, waarbij acarbose als referentiestandaard gebruikt werd (Huang et al., ongepubliceerde resultaten). Daarom moet geverifieerd worden of de gerapporteerde EC50 methode-afhankelijk is om mogelijke artefacten uit te sluiten (Manaharan et al., 2012). Cleistocalyx operculatus behoort ook tot de Myrtaceae-familie. Hu, Luo, Li, Joshi, and Lu (2012) isoleerden en zuiverden 2′4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′5′-dimethylchalcone (DMC) uit de gedroogde bloemknoppen van C. operculatus. De verbinding vertoonde een niet-competitief remmend mechanisme ten opzichte van PPA (Hu et al., 2012).

Tiliroside (58) (Fig. 3.8), geïsoleerd uit de zaden van hondsroos, Rosa canina L., remt PPA met IC50 van 280 mM, en kinetisch onderzoek toont aan dat het een niet-competitieve remmer is met Ki waarden van 84,2 μM gekwantificeerd met p-nitrofenyl-alpha-d-pentaglucoside als substraat. In tegenstelling tot acarbose vertoont tiliroside geen remmende activiteit tegen α-glucosidase. Wellicht als gevolg van zijn zwakke α-amylase remmende activiteit in het diermodel, is een hoge dosis tiliroside (600 mg/kg) nodig om de postprandiale plasmaglucoseconcentratie te verlagen bij muizen die met zetmeel van 2 g/kg zijn behandeld. Tiliroside kan antihyperglykemie vertonen door remming van zowel natriumafhankelijke glucosetransporter 1 als glucosetransporter 2-gemedieerde glucose-opname in enterocyten (Goto et al., 2012).

Curcumine en zijn derivaten zijn gesuggereerd multitargeting verbindingen te zijn die een zeer breed scala aan gezondheidsvoordelen hebben. Als potentieel middel om de verteringssnelheid van zetmeel te verminderen, heeft bisdemethoxycurcumine (59) (Fig. 3.8) uit de wortelstok van Curcuma longa een HPA- en PPA-remmingsactiviteit met IC50-waarden van ongeveer 25 μM met behulp van DNSA-assay. Kinetisch onderzoek toont aan dat het een niet-competitieve remmer van HPA is met een schijnbare Ki van 3,0 μM (Ponnusamy et al., 2012).

Mono- en gedesubstitueerde caffeoylchinzuren zijn de belangrijkste polyfenolische verbindingen die worden aangetroffen in groene koffiebonen. Door de aanwezigheid van drie secundaire hydroxylgroepen in de kininezuurring, zijn er drie inter-converterende positie-isomeren van mono-gesubstitueerde cafeïnezuren en drie dicaffeoyl-quinzuren, die allemaal werden gezuiverd uit groene koffiebonen. Hun remmende activiteit op PPA-I (Narita & Inouye, 2011) werd gemeten met p-nitrofenyl-diglucoside, dat bij hydrolyse p-nitrofenol en maltose produceert. Opmerkelijk is dat de remmende activiteit sterk afhankelijk is van de positie van de caffeoylgroepen in monocaffeoylkininezuur. 5-Caffeoylchininezuur (of algemeen bekend als chlorogeenzuur) (Fig. 3.8) heeft de hoogste remmingsactiviteit met IC50 van 80 μM, vergeleken met die van 4-caffeoylchininezuur (120 μM) en 3-caffeoylchininezuur (230 μM). Voor de drie dicaffeoyl-quininezuurisomeren is de remmende activiteit veel hoger en zijn ze niet zo gevoelig voor de positie van de estergroepen, want 3,4- en 4,5-dicaffeoyl-quininezuren (Fig. 3.8) hebben dezelfde IC50-waarden (20 mM), en 4,5-dicaffeoyl-quininezuur heeft een IC50 van 30 μM (Narita & Inouye, 2011).