Translocaciones e inversiones simples desequilibradas (clases A y C): mecanismos de origen

El resultado directo de este estudio es que en 20 de las 37 translocaciones de novo desequilibradas, la duplicación tiene un origen materno (Fig. 1, Recurso en línea 1: Tabla S2). Dado que la investigación del origen parental no fue informativa o no fue posible en seis casos (casos 7, 14, 23, 24, 33 y 35), las translocaciones de novo desequilibradas en las que la región duplicada es de origen materno representan el 64,5% (20/31) de los casos totalmente informativos. Combinando estos datos con el hallazgo de que en ocho de estos casos (casos 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 y 32) tres alelos (Fig. 1, Recurso en línea 1: Tabla S2), dos maternos y uno paterno, estaban presentes al menos en parte de la región de duplicación, el escenario emergente es que en no menos del 25% (8 de 31), el conductor principal para la ocurrencia de translocaciones desequilibradas de novo es una no disyunción meiótica materna, seguida de una trisomía parcial de rescate del cromosoma materno supernumerario (Fig. 1a). La explicación más probable para la presencia de tres alelos dentro de la región duplicada, dos maternos y uno paterno, sería la no disyunción en la meiosis I materna (mat-MI) (Fig. 1A.I). Alternativamente, una recombinación meiótica próxima o en el punto de rotura de la translocación debe haber precedido a una no disyunción en la meiosis II materna (mat-MII). Por el contrario, en los 12 casos (4-6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 y 37) con el mismo haplotipo duplicado materno no se pueden excluir otros mecanismos (Fig. 1b), aunque también podrían ser el resultado o bien de una no disyunción mat-MI (Fig. 1A.I), después de un cruce telomérico, según la ocurrencia preferente de cruces teloméricos demostrada para algún cromosoma no disyectado (Oliver et al. 2014) o una no disyunción materna MII (mat-MII) (Fig. 1A.II), como se ha informado en varios casos de rescate de trisomías (revisado en Chantot-Bastaraud et al. 2017).

Es bien sabido que el rezago en anafase del cromosoma supernumerario seguido de su atrapamiento dentro de un micronúcleo está en la base de muchos eventos de cromotripsis (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). Como consecuencia, en una célula hija, el cromosoma supernumerario es eliminado, mientras que en la otra, la rotura del material genómico del micronúcleo, seguida de la reincorporación de todos o algunos fragmentos dentro del núcleo principal puede dar lugar a una reorganización masiva del cromosoma original que, o bien mantiene la mayor parte de su material aunque reorganizado en un nuevo orden, o bien pierde algunas de sus porciones (Fig. 1a), qué porciones del cromosoma supernumerario original se pierden y cuáles se conservan podría depender de eventos estocásticos, de la propensión de los extremos rotos a integrarse entre sí o con otras partes del genoma, y/o de la posterior selección de células que puedan sobrevivir y multiplicarse en presencia de desequilibrios segmentarios mínimos. En teoría, los fragmentos céntricos pueden preservarse como cromosomas marcadores supernumerarios mediante su circularización con formación de cromosomas en anillo, superando así la ausencia de secuencia telomérica en ambos extremos. La preservación de los fragmentos acéntricos intersticiales supernumerarios requiere también la formación de un neocentrómero o, alternativamente, la captura del fragmento por otro cromosoma con la formación de una translocación insercional de novo. De hecho, Kato et al. (Kato et al. 2017) informaron recientemente de un caso de translocación intersticial de novo derivada de la cromotripsis de un cromosoma supernumerario presente en un cigoto trisómico. Por último, la conservación de fragmentos supernumerarios dotados de un telómero en uno de sus extremos requiere o bien una captura del telómero, por ejemplo, un cromosoma marcador supernumerario translocado como se informó en Vetro et al. (2012) (casos 2 y 3) o bien su captura por otro cromosoma, el receptor, que pierde su porción distal formando así una célula de 46 cromosomas con una translocación de novo desequilibrada, como se describe aquí. De hecho, el caso 6 con la duplicación del mismo haplotipo materno (Fig. 1, Recurso en línea 1: Tabla S2) ilustra la ocurrencia de un evento de cromotripsis (Fig. 1a), como se muestra por la presencia de dos regiones duplicadas no contiguas separadas por ~ 1,3 Mb de las cuales la intersticial tiene una orientación invertida (Recurso en línea 2: Figura S15). Se han observado eventos de cromotripsis en varios casos de translocaciones desequilibradas de novo (Weckselblatt et al. 2015), y se ha informado de que la mayoría de ellos son de origen paterno y afectan a más de dos cromosomas (Marcozzi et al. 2018). Por el contrario, la translocación desequilibrada en nuestro caso 6 era de origen materno y, de hecho, de novo, de acuerdo con las investigaciones FISH de las metafases parentales. Además, al menos según lo juzgado por las investigaciones de aCGH de alta resolución (1M) y FISH, involucró solo dos cromosomas, mientras que se excluyó un reordenamiento más complejo. Por lo tanto, es tentador especular que el cigoto o el embrión temprano era trisómico para el cromosoma 8 debido a una no disyunción materna meiótica o postzigótica. A la ruptura del cromosoma 8 supernumerario le siguió la recuperación de sólo dos porciones no contiguas, incluida la telomérica que, ya cosida, fue adquirida por el receptor 18q (Fig. 1a).

El modelo de formación de las translocaciones desequilibradas de novo, a partir de un cigoto trisómico, también encaja con el caso 24, aunque no pudimos realizar ninguna investigación molecular de apoyo. Sin embargo, la presencia de una línea celular residual trisómica para el cromosoma 9, junto con una principal con cariotipo normal y una tercera con la translocación desequilibrada t(14;9) sugiere cómo, partiendo de un cigoto trisómico, pueden formarse varias líneas celulares, unas con la pérdida total del cromosoma supernumerario y otras con la pérdida de una parte del mismo (9p) y su porción residual (todo el 9q) captada por otro cromosoma. Este tipo de mosaico de tres líneas celulares se han documentado en raras ocasiones (Phillips et al. 1997), pero en el diagnóstico prenatal los mosaicos con una línea celular normal y una segunda con una translocación desequilibrada de novo son relativamente frecuentes y en la mayoría de ellos se puede detectar un aumento de la edad materna (Kovaleva y Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).

Un apoyo independiente a la hipótesis de que la no disyunción materna es un desencadenante principal de las translocaciones desequilibradas de novo, es un aumento de la edad materna. De hecho, en nuestros ocho casos (casos 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 y 32), en los que la duplicación estaba sin duda vinculada a una no disyunción meiótica materna (dos alelos maternos diferentes dentro de la región de duplicación), se documentó un aumento de la edad materna media (34,75 años, Recurso en línea 1: Tabla S1), teniendo en cuenta que la edad materna media en Italia en 2016 era de 31,8 años (ISTAT, https://www.istat.it/). También se reconoció un aumento (33,5 años) en los 12 casos (casos 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 y 37) con duplicación del mismo alelo materno, compatible con una no disyunción materna como evento iniciador. Incluso en los casos en los que la duplicación era paterna, se observó un aumento, aunque mucho más limitado, de la edad media materna (32,6 años), lo que posiblemente indica que otros mecanismos distintos de la no disyunción materna pueden desempeñar un papel en la formación de estas translocaciones desequilibradas. De hecho, en los cuatro casos (3, 8, 29 y 36) analizados mediante SNP array no se presentó ninguna heteroisodisomía materna en la porción no duplicada de los cromosomas homólogos (Recurso en línea 1: Tabla S2), como cabría esperar para un cigoto trisómico en el que el cromosoma paterno supernumerario hubiera sufrido una cromotripsis con el rescate de sólo la porción telomérica. Por lo tanto, teniendo en cuenta también la insignificante frecuencia de trisomías originadas por errores de segregación en la meiosis paterna (Nagaoka et al. 2012), la ocurrencia de translocaciones desequilibradas encendidas por el rescate trisómico parcial de un cigoto trisómico de origen paterno parece muy poco probable. En su lugar, otros mecanismos, como una rotura paterna de doble cadena heredada o postzigótica que requiera ser reparada por la captura de los telómeros, parecen más plausibles (Fig. 1b). De hecho, el caso 25, que es un mosaico de dos líneas celulares, presentes en la sangre y en los fibroblastos, con una deleción terminal 2q y un cromosoma derivado der(2)t(2q;14q) de origen paterno (Recurso en línea 2:Figura S9), encaja con esta hipótesis. Así, en presencia de una deleción terminal, pueden producirse diferentes mecanismos de reparación en distintos momentos en diferentes células del embrión temprano, dando lugar finalmente a una condición de mosaico. En este modelo, el cromosoma borrado inicia el evento de translocación, actuando como receptor, mientras que el duplicado es el donante, operando como reparador de la lesión (Fig. 1b). Sin embargo, no es posible discernir si la deleción es realmente el primer evento que conduce a la translocación o si, por el contrario, es secundario a la formación de un cromosoma dicéntrico (Fig. 1BIII y IV) que, como resultado de su ruptura asimétrica, genera un cromosoma inv-dup del y otro simplemente delecionado, siendo este último reparado por la captura del telómero (Fig. 1b). Es posible que la persistencia del dicéntrico más allá de las primeras divisiones embrionarias dé lugar a roturas de diferente tamaño en las distintas células, reparadas de nuevo por la telomerasa o por la captura de telómeros.

Notablemente, sea cual sea el mecanismo, se detectó una alta prevalencia de casos en los que ambos desequilibrios tienen el mismo origen parental (Fig. 1, Recurso en línea 1: Tabla S2), a pesar de que se esperaría un origen biparental de la deleción y la duplicación en la mitad de los casos, según un evento final postzigótico. La demostración de una compartimentación distinta de los dos conjuntos de cromosomas parentales en embriones de ratón hasta el estadio de 8 células (Du et al. 2017) puede proporcionar una explicación. Dado que este periodo coincide con una inestabilidad cromosómica muy elevada, (McCoy et al. 2017), es tentador especular que un mecanismo como la captura de telómeros, necesaria para la estabilización de una anomalía estructural anterior, ocurre en el mismo conjunto cromosómico parental de la anomalía original. Por el contrario, se esperaría que otros reajustes posteriores se produjeran de forma aleatoria, implicando a cromosomas de ambos orígenes parentales, lo que daría lugar a un cromosoma translocado desequilibrado de origen biparental, como efectivamente encontramos en cinco casos (casos 10, 12, 27, 30 y 31; Fig. 1, Recurso en línea 1: Tabla S2).

En cuanto a los reordenamientos de clase C, no encontramos ninguna peculiaridad en los puntos de rotura de la unión que pudiera aclarar si su estabilización por captura del telómero de la porción cromosómica opuesta a la eliminada se debe a un mecanismo diferente en comparación con los casos en los que la captura del telómero depende de otro cromosoma. Sin embargo, este análisis sólo pudo realizarse en dos casos. El hallazgo de que en 4 de los 5 casos tanto la deleción como la duplicación eran de origen paterno sugiere que derivan o bien por una deleción original o bien por la rotura de un cromosoma dicéntrico.

Translocaciones e inversiones complejas desequilibradas (clases B y D)

Hay acuerdo general en que estos reordenamientos resultan por un dicéntrico intermedio, tras su rotura asimétrica que da lugar a un del inv-dup y a un cromosoma simplemente borrado (Fig. 1B.III). La adquisición de una secuencia telomérica estabilizadora puede ocurrir por una serie de modalidades: adición de secuencias TTAGGG de novo mediada por la telomerasa, captura del telómero de la porción distal de otro cromosoma (Yu y Graf 2010) o de la porción opuesta del mismo cromosoma (Buysse et al. 2009; Fan y Siu et al. 2001), o incluso formación de un cromosoma en anillo (Rossi et al. 2008). Los dos casos de translocación inv-dup del(8p) que pudimos genotipar (casos 42 y 44) se originaron, como era de esperar (Giglio et al. 2001), por NAHR en mat-MI, como demuestra la presencia de dos alelos maternos y uno paterno en la región de duplicación 8p (Recurso en línea 1: Tabla S2). Esta recombinación anormal recurrente está mediada por duplicaciones segmentarias altamente idénticas localizadas en 8p23 dentro de un cromosoma 8 normal e invertido (Giglio et al. 2001). En el cigoto, el cromosoma dicéntrico resultante probablemente sufrirá diferentes eventos de rotura en diferentes células, dando lugar a veces a una condición de mosaico con una línea celular del(8p) y una segunda con el inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010), o en casos excepcionales incluso una tercera con el inv-dup del(8p) terminando con la región distal de otro cromosoma (Pramparo 2004). Estos mosaicos se detectan con mayor frecuencia en el diagnóstico prenatal, mientras que en la vida postnatal una sola línea celular con el inv-dup del(8p), translocado o no, es el hallazgo más frecuente al menos en sangre. En nuestros tres casos translocados (casos 42, 43 y 44), los telómeros fueron donados por 6q, 17p y Xq, respectivamente, todos de origen materno, y con el mismo haplotipo de duplicación de los cromosomas maternos 6, 17 y X, como es de esperar para un evento de estabilización ocurrido postzigóticamente. En los tres casos restantes (casos 39, 40 y 45), que, al igual que todos los reordenamientos inv-dup del que no afecta a 8p, no son recurrentes, el inv-dup translocado era de origen paterno con alelos paternos idénticos en la región de duplicación, mientras que la captura del telómero fue proporcionada por un cromosoma de origen paterno en dos casos (casos 39 y 49, Recurso en línea 2: Figuras S3, S4) y uno materno en el tercer caso (caso 45), un feto en el que el cromosoma translocado t(inv-dup5p;3q) estaba en mosaico con una línea celular que contenía un inv-dup del(5p) no translocado (Recurso Online 2: Figura S12). En particular, la duplicación de 5p es de diferente tamaño en las dos líneas celulares (Recurso en línea 1: Tabla S1), lo que demuestra que el cromosoma dicéntrico original presumiblemente presente en el cigoto o en el embrión muy temprano (Fig. 1b), sufrió diferentes roturas en las distintas células, más allá del embrión en fase de clivaje.

Se ha informado de alelos duplicados idénticos de buena fe en todos los reordenamientos inv-dup del que no afecta a 8p, indicando así un origen intracromosómico de estos reordenamientos (Hermetz et al. 2014). En consecuencia, estos reordenamientos inv-dup translocados parecen ser el resultado final de un evento mitótico inicial, posiblemente en el embrión temprano (Voet 2011), como una rotura de doble cadena seguida de un emparejamiento intracromosómico en sitios relativamente cercanos de secuencias homólogas invertidas, lo que lleva a la generación del cromosoma dicéntrico con una región de copia normal interpuesta (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Como ya se ha mencionado, el producto recíproco de la inv-dup del, es decir, un cromosoma borrado, puede ser reparado y estabilizado por la captura de la porción distal de un cromosoma no homólogo, o del brazo opuesto del mismo cromosoma, dando lugar a una simple translocación o inversión desequilibrada, respectivamente, como proponemos para algunos de los reordenamientos enumerados en las clases A y C (Fig. 1b).

Uniones de punto de rotura

La secuenciación de la unión de translocación de punto de rotura pudo realizarse en 26 casos (Recurso en línea 1: Tabla S1, Recurso en línea 2: Figura S1) aunque en 4 casos la complejidad críptica (casos 4, 10, 28 y 51) impidió una secuenciación fina. En 16 casos (casos 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 y 52) se detectaron rasgos alternativos de unión de extremos no homólogos (alt-NHEJ) o de replicación inducida por rotura microhomológica (MMBIR), como microhomologías y pequeñas inserciones templadas o no templadas (Recurso en línea 2: Figura S1). Sorprendentemente, aunque en los casos 18 y 40 el reordenamiento se produjo dentro de secuencias Alu, la presencia de una inserción templada corta de 5 pb y de una microhomología de 4 pb, respectivamente, mostró que el reordenamiento no se produjo por un mecanismo mediado por NAHR, sino por un alt-NHEJ o MMBIR. La NHEJ canónica (c-NHEJ, uniones de extremos romos) se produjo en cuatro casos (casos 26, 29, 31 y 43). En los casos 2 y 38, las uniones del punto de rotura, estaban en el borde del retrotransposón homólogo (Recurso en línea 2: Figura S13). Este hallazgo sugiere que en una minoría de casos, los mecanismos de reparación como la captura del telómero se ven facilitados por estas secuencias. Aunque Robberecht et al. encontraron que la mayoría de sus translocaciones desequilibradas de novo estaban mediadas por NAHR entre LINEs, HERVs o duplicaciones segmentarias (Robberecht et al. 2013), podemos excluir un evento NAHR al menos en el caso 2, donde la presencia de dos haplotipos maternos duplicados, uno translocado al cromosoma receptor, indica claramente una no disyunción mat-MI (Fig. 1, Recurso en línea 1: Tabla S2), lo que hace imposible atribuir la translocación a un evento meiótico. De hecho, se ha demostrado que los eventos de retrotransposición mediados por LINE-1 ocurren en células somáticas del embrión humano temprano, en células madre embrionarias humanas y, al menos, en ratones principalmente en la embriogénesis (para una revisión Kazazian y Moran 2017), apoyando que en nuestros casos, la formación de la translocación fue un evento postzigótico también.

Combinadas, estas características indican que los mecanismos basados en la reparación (c-NHEJ y alt-NHEJ) y los mecanismos de reparación replicativa (MMBIR) son responsables de la unión del cromosoma donante con el receptor, o la porción opuesta del mismo cromosoma (Fig. 1).

Relación genotipo-fenotipo

Aunque las correlaciones genotipo-fenotipo en grandes reordenamientos desequilibrados, como los reportados en nuestro estudio, son en general bastante gruesas, los datos que reportamos añaden algunos detalles adicionales también en este contexto.

La fuerte evidencia de que algunas translocaciones desequilibradas se originan a partir de un cigoto con un cromosoma supernumerario que sufre un evento cromotrípico, sugiere que la región de duplicación, aunque aparentemente compuesta solo por la región distal del cromosoma cromotrípico, puede contener fragmentos de otras porciones, como es el caso de nuestro caso 6 y como muestran Weckselblatt et al. (2015). En estos casos, si el tamaño de los trozos destrozados es inferior al detectable por CGH de array, se corre el riesgo de atribuir el fenotipo anormal solo a los genes que aparecen duplicados o eliminados, mientras que la morbilidad adicional puede deberse a la expresión génica anormal generada por la disrupción del TAD (Fukami et al. 2017).

Además, en las translocaciones desequilibradas originadas por el rescate de la trisomía parcial, si la cromotripsis se produjera en el cromosoma supernumerario de origen paterno, la siguiente hetero/isodisomía materna para los dos cromosomas restantes podría generar mayor patogenicidad (Niida et al. 2018), ya sea por la reducción al estado homocigótico de variantes causantes de enfermedades presentes en la madre en estado heterocigótico, o debido a la presencia de genes impresos que se expresan únicamente por el alelo paterno.

Como consideración final, es tentador especular que la elección de qué telómero se capta para la estabilización del cromosoma roto, puede no ser aleatoria, sino estar influenciada por la desregulación de los TADs originales (Topologically Associated Domains), creando a su vez un sustrato favorable para los contactos intercromosómicos específicos y la compartimentación espacial de la cromatina en 3D (Dekker y Mirny et al. 2016).