HypaCas9 y Cas9-HF1 muestran tasas de escisión lentas observadas
Comenzamos nuestros análisis cinéticos midiendo la concentración del sitio activo de la enzima para cada una de las variantes de Cas923,24,25. La medición de la cantidad de producto formado en una titulación de la enzima con concentraciones crecientes de ADN reveló concentraciones del sitio activo de 31 nM, 26 nM, 23 nM para SpCas9, HypaCas9 y Cas9-HF1, respectivamente, para muestras de enzima con una concentración nominal de 100 nM basada en la absorbancia a 280 nm (Fig. Suplementaria 1a-d). También medimos las concentraciones del sitio activo de SpCas9 y HiFiCas925 de Integrated DNA Technologies (IDT) y observamos concentraciones similares de enzima activa (Fig. Suplementaria 1e-f). Es importante señalar que, en cada caso, la concentración de ADN necesaria para saturar la señal fue igual a la concentración de producto formado, lo que elimina la preocupación de que parte de la enzima pueda unirse al ADN pero no reaccionar. Todos los experimentos posteriores se realizaron utilizando la concentración de enzima activa determinada en la valoración del sitio activo.
Para comparar la cinética de los sustratos de ADN dentro o fuera del objetivo de SpCas9 con las variantes diseñadas, primero examinamos el curso temporal de la escisión de la cadena objetivo (HNH) para cada enzima (Fig. 1 y Fig. 2 suplementaria). Los datos se ajustaron con una función exponencial simple o doble utilizando la Ec. (1) o la Ec. (2), respectivamente.
donde Y representa la concentración del producto de escisión, A1 representa la amplitud y λ1 representa la tasa de desintegración observada (valor propio)17.
donde Y representa la concentración del producto de escisión, A1 representa la amplitud y λ1 representa la tasa observada para la primera fase. A2 representa la amplitud y λ2 representa la tasa observada para la segunda fase.
La comparación de las tasas de decaimiento de escisión observadas de sustratos on- y off-target por SpCas9 muestra que el desajuste PAM-distal de 3 pb ralentiza la enzima 13 veces (de 1 s-1 a 0,076 s-1). Ambas variantes de Cas9 de alta fidelidad disminuyen drásticamente la tasa de decaimiento observada para la escisión de sustratos de ADN en el objetivo entre 21 y 35 veces en comparación con SpCas9 (0,028 s-1 para HypaCas9 y 0,047 s-1 para Cas9-HF1 frente a 1 s-1 para SpCas9). Además, HypaCas9 y Cas9-HF1 reducen aún más las tasas de desintegración del ADN fuera del objetivo entre 8 y 290 veces (tasas de 0,0033 s-1 y 0,00016 s-1, respectivamente) en relación con sus respectivas tasas con el ADN dentro del objetivo. Estos datos demuestran cambios dramáticos en las tasas de escisión observadas por las variantes diseñadas con el ADN en y fuera del objetivo. Sin embargo, estas mediciones por sí solas no definen los cambios en la especificidad, que es una función de la partición cinética de la escisión del ADN frente a la disociación, abarcando todos los pasos que conducen al primer paso irreversible en la vía17, incluyendo la unión reversible del ADN, la formación del bucle R, el acoplamiento del dominio HNH y la escisión del ADN.
El desenrollado del ADN no cambia en gran medida con las variantes de Cas9
Dado que nuestro trabajo anterior identificó la formación del bucle R como limitante de la tasa de escisión en el objetivo y que otros sugirieron posteriormente que la formación del bucle R y las tasas de rebobinado pueden dictar la especificidad de la enzima para SpCas9 y Cas9-HF116, probamos si HypaCas9 mostraría una cinética similar. Para medir directamente las tasas de formación del bucle R para todas las enzimas, utilizamos un ensayo de flujo detenido basado en la medición de la fluorescencia del tCo a -16 nt, un análogo fluorescente de la citosina tricíclica que se apaga por el apilamiento de bases en el dsDNA, de modo que la apertura del dúplex resulta en un gran aumento de la fluorescencia. Nuestros experimentos de control utilizando nuestros sustratos análogos de base marcados con tCo y 2-AP en las posiciones -16, -9 y -1 nt, respectivamente (Fig. Suplementaria 3), muestran que ninguno de los análogos afecta a la tasa de decaimiento observada para la escisión del ADN. Las estructuras químicas de tCo y 2AP son mucho menos voluminosas que las etiquetas Cy3 y Cy5 más grandes y es menos probable que interfieran con la cinética de la enzima (Fig. Suplementaria 4). En presencia de Mg2+, SpCas9, HypaCas9 y Cas9-HF1 desenrollan el sustrato de ADN objetivo con velocidades de decaimiento casi idénticas (~2 s-1) (Fig. 2). Sorprendentemente, la tasa de decaimiento de la formación del bucle R para los sustratos de ADN fuera del objetivo para todas las variantes de Cas9 tampoco cambió mucho (entre 0,85 s-1 y 2,59 s-1). Por lo tanto, el desenrollado del ADN no es limitante de la tasa y no está correlacionado con las tasas de escisión observadas para las variantes de alta fidelidad, a diferencia de SpCas9.
Las tasas de decaimiento de la formación del bucle R se midieron monitorizando el aumento de fluorescencia desde tCo (posición -16 en la hebra no objetivo) en función del tiempo después de mezclar la enzima (28 nM) con el ADN (10 nM) en presencia de 10 mM de Mg2+. Los datos se ajustaron a una función exponencial doble para obtener las tasas de decaimiento mostradas. a, b SpCas9 (28 nM) con ADN on-target (a) y off-target (b), c, d HypaCas9 con ADN on-target (c) y off-target (d). e, f Cas9-HF1 con ADN on-target (e) y off-target (f).
Dada la ubicación del tCo en -16 nt, es probable que nuestras mediciones reflejen un paso tardío en el proceso de desenrollado. Para comparar, medimos la tasa de decaimiento para la formación del bucle R utilizando el tCo marcado en una posición inmediatamente proximal a la PAM (posición -1 nt). Después de mezclar rápidamente el ARN-Cas9 con el sustrato de ADN en el objetivo, observamos un marcado aumento de la fluorescencia a medida que el ADN desenrolla el análogo de base tCo. Ajustamos los datos a una doble exponencial para determinar la mayor tasa de decaimiento de 10 s-1 (Fig. 3a-f). Intrigantemente, estos resultados indican que una vez que un sitio PAM está comprometido con la enzima, el desenrollado inicial del ADN es más rápido que el observado a -16 nt. Estos datos sugieren que la tasa neta de decaimiento del desenrollado observada a -16 nt puede ser una función de varios pasos de desenrollado rápido que conducen al desenrollado completo. Sin embargo, dado que no se observó ningún retraso en la cinética, parece que los primeros pasos de desenrollado parcial más rápidos conducen a un paso final de desenrollado completo, medido en la posición -16 nt. Aunque se necesitan más estudios para examinar los efectos de los desajustes en etapas anteriores del desenrollado, nuestra medición actual proporciona la mejor estimación de la tasa neta de formación del bucle R. La tasa de decaimiento medida para la formación del bucle R utilizando esta etiqueta es indistinguible tanto para SpCas9 como para las variantes de alta fidelidad en todos los sustratos probados, por lo que las tasas de desenrollado del ADN parecen no cambiar con las enzimas Cas9 modificadas.
Las tasas de decaimiento de la formación del bucle R se midieron mediante la monitorización del aumento de fluorescencia desde tCo (posición -1 en la cadena no objetivo) en función del tiempo tras mezclar la enzima (28 nM) con el ADN (10 nM) en presencia de 10 mM de Mg2+. Los datos se ajustaron a una función exponencial doble para obtener las tasas de decaimiento mostradas. a, b SpCas9 (28 nM) con ADN on-target (a) y off-target (b), c, d HypaCas9 con ADN on-target (c) y off-target (d). e, f Cas9-HF1 con ADN on-target (e) y off-target (f). g Dibujo del reordenamiento del dominio HNH. h El FRETSpCas9 marcado con el par Cy3 y Cy5 en C867 y C355, respectivamente, se utilizó para medir el movimiento del dominio HNH durante la escisión de sustratos on-target.
Para correlacionar las tasas de formación del bucle R con los pasos implicados en el acoplamiento del dominio HNH a la cadena diana, medimos el cambio conformacional de la enzima utilizando un análisis de flujo detenido en una Cas9 que estaba marcada con Cy3 y Cy5 como se ha descrito previamente18. Brevemente, una versión de Cas9 con cisteína se marcó con Cy3 en el aminoácido 355 y Cy5 en el aminoácido 867. La eficiencia de FRET aumenta cuando el dominio HNH se reordena al estado catalíticamente activo (Fig. 3g). Después de mezclar rápidamente la Cas9 marcada con pares FRET con un ADN perfectamente emparejado en el objetivo, observamos un aumento en la eficiencia FRET, indicando que el dominio HNH se estaba reordenando a un estado catalíticamente activo. Medimos que la tasa de decaimiento del acoplamiento del HNH era de ~2,5 s-1 (Fig. 3h), lo que es similar a las mediciones de FRET de una sola molécula. Sorprendentemente, las tasas observadas de la formación del bucle R (1,5 s-1) y del acoplamiento del dominio HNH son muy similares, lo que indica que estos pasos pueden estar cinéticamente relacionados. La velocidad de decaimiento ligeramente más rápida observada para el movimiento del dominio HNH podría deberse a la reacción inversa, ya que el movimiento del dominio llega al equilibrio después o coincidiendo con la formación del bucle R.
Las velocidades de decaimiento del desenrollamiento del ADN también se han medido utilizando métodos de una sola molécula usando un ADN marcado con un par FRET, Cy3 y Cy5 se marcaron en la posición -6 nt de la hebra objetivo y -16 nt en la hebra no objetivo, respectivamente16. Por lo tanto, también probamos los sustratos de ADN emparejados con FRET en un intento de correlacionar la señal de FRET con las tasas observadas de escisión del ADN. En primer lugar, probamos el sustrato utilizado previamente en estudios de molécula única sin las etiquetas Cy3/Cy516, que tiene una diferencia de dos nucleótidos con nuestro sustrato, concretamente, una sustitución T en las posiciones -16 y -18. La velocidad de desintegración de la cadena objetivo (HNH) es similar a la de nuestro sustrato (0,7 s-1 frente a 1 s-1, Fig. Suplementaria 5a), por lo que el contexto de la secuencia en esta posición no tiene un efecto significativo. También probamos la escisión con ADN marcado con Cy3/Cy5 con esta otra secuencia, y mostró una tasa de decaimiento similar a la de nuestra secuencia (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, Figs. 5b y 6a suplementarias). Posteriormente, examinamos el curso temporal de la ruptura de la cadena diana (HNH) del ADN marcado con Cy3/Cy5 con nuestra secuencia para cada enzima (Fig. Suplementaria 6). Con SpCas9, la reacción del ADN marcado con Cy3/Cy5 sigue una única exponencial con una tasa de decaimiento marcadamente reducida (0,06 s-1 frente a 1 s-1) mostrando una disminución de ~17 veces en la tasa de decaimiento observada para la escisión del ADN en comparación con el sustrato no marcado. Los modelos HypaCas9 y Cas9-HF1 también mostraron una disminución de la velocidad de corte del ADN de 0,0046 s-1 y 0,0016 s-1, respectivamente, que son 5,9 veces y 28,75 veces más lentos que los sustratos no marcados medidos en condiciones idénticas. Está claro que la interferencia de las etiquetas Cy3/Cy5 altera el efecto de las variantes de alta fidelidad en las tasas de escisión del ADN. En conjunto, el etiquetado del ADN con etiquetas voluminosas Cy3 y Cy5 impactó dramáticamente en la enzima. Por estas razones, no se realizaron más estudios utilizando el ADN marcado con pares FRET.
La especificidad de Cas9 se rige por la partición cinética
Dado que la especificidad de la enzima es una función de todos los pasos que conducen al primer paso, en gran medida irreversible, se deben considerar todos los eventos previos a la escisión del ADN17. Para medir la tasa de escisión intrínseca, evitamos el paso de formación del bucle R, que normalmente limita la tasa, preincubando SpCas9 con ADN fuera del objetivo en ausencia de Mg2+ para permitir que la unión y los cambios conformacionales lleguen a un equilibrio para formar un complejo SpCas9.ADN. A continuación, iniciamos la reacción química mediante la adición de 10 mM de Mg2+. En nuestros estudios anteriores, la formación del bucle R era la que limitaba la velocidad de reacción de SpCas9 con el ADN objetivo, y la tasa de descomposición intrínseca era más rápida cuando se medía utilizando el protocolo de preincubación. Aquí, con el ADN fuera del objetivo, las tasas de escisión de HNH y RuvC se midieron en 0,12 s-1 y 0,14 s-1, respectivamente (Fig. Suplementaria 7c, d, y Fig. Suplementaria 8), que son mucho más lentas que las tasas de formación del bucle R. Intrigantemente, estos resultados muestran que el paso que limita la velocidad en la ruta enzimática de SpCas9 con un off-target es la escisión del ADN, ya que la tasa de decaimiento para la formación del bucle R que medimos fue de 0,85 s-1 (Fig. 2b). Estos datos indican que la discriminación se basa, al menos en parte, en un cambio en la identidad del paso que limita la velocidad al comparar el ADN dentro y fuera del objetivo.
Repetimos estos experimentos con HypaCas9 y Cas9-HF1 con ADN dentro y fuera del objetivo. Estos resultados definen las tasas observadas de escisión de HNH de 0,035 s-1 y 0,0023 s-1 para HypaCas9 con sustratos dentro y fuera del objetivo, respectivamente (Fig. suplementaria 7g, k). Las tasas de corte observadas de Cas9-HF1 para sustratos on- y off-target se midieron como 0,038 s-1 y 0,00014 s-1, respectivamente (Supplementary Fig. 7o, q). Estas velocidades de escisión observadas son algo más rápidas que las medidas con la adición simultánea de ADN y Mg2+, lo que indica que algún paso distinto de la formación del bucle R pero que precede a la escisión del ADN puede ralentizar la velocidad de decaimiento observada. No obstante, estos resultados muestran que las tasas de corte observadas para el ADN objetivo se reducen ~100 veces tanto para HypaCas9 como para Cas9-HF1 en relación con SpCas9. Para el ADN fuera del objetivo, las tasas de corte observadas se reducen 50 u 860 veces para HypaCas9 o Cas9-HF1, respectivamente, en relación con SpCas9.
La discriminación no se define únicamente por las tasas relativas de corte del ADN. Más bien, dado que la formación del bucle R es rápida, la discriminación es una función de la partición cinética entre las tasas de liberación del ADN y de escisión17,26,27. Para cuantificar la división cinética, incubamos la enzima y el ADN marcado en ausencia de Mg2+, lo que permite que la formación del bucle R alcance el equilibrio, pero impide la catálisis15. A continuación, añadimos Mg2+ para iniciar la reacción en presencia de un gran exceso de ADN idéntico, no marcado, que sirviera de trampa. La comparación entre experimentos paralelos realizados en presencia y ausencia de la trampa de ADN proporciona una estimación de la partición cinética fraccional para la disociación frente a la escisión del ADN unido (Fig. 4a). Una vez que SpCas9 se unió al ADN objetivo, se escindió rápidamente, y la trampa de ADN tuvo poco efecto (Fig. 4b). Por el contrario, el 33% del ADN off-target se disoció de la enzima, mientras que el ~67% del ADN estaba comprometido con la escisión (Fig. 4c y Fig. 9a suplementaria). Estos resultados muestran que SpCas9 discrimina el ADN mal emparejado PAM-distal disminuyendo la tasa de escisión, lo que aumenta la fracción de ADN que se libera en lugar de escindirse. Sin embargo, el efecto es pequeño, por lo que la tasa de disociación parece ser más lenta que la de escisión.
a Esquema del experimento de trampa de ADN. b, c Escisión de SpCas9 en el objetivo (de Gong et al.15) (b) o fuera del objetivo (c). d, e Corte de HypaCas9 en el objetivo (d) o fuera del objetivo (e). f, g Corte de Cas9-HF1 en el objetivo (f) o fuera del objetivo (g). La enzima (28 nM) y el ADN marcado (10 nM) se incubaron en ausencia de Mg2+ y la reacción se inició añadiendo Mg2+ en presencia o ausencia de un exceso de trampa de ADN no marcado. A- y A◦ representan la amplitud con (círculos rellenos) y sin trampa (círculos abiertos), respectivamente. El porcentaje indica la fracción de ADN pre-ligado que se compromete a seguir adelante para la escisión en relación con la reacción en ausencia de trampa.
A continuación, examinamos la partición cinética para HypaCas9 y Cas9-HF1 ligado al ADN on-target (Fig. 4d, f, Supplementary Fig. 9b, d). Nuestros resultados con HypaCas9 y Cas9-HF1 muestran que el ~75% y el ~92% del ADN sobre el objetivo se escindió en presencia de la trampa, respectivamente. El porcentaje de escisión es menor que en el caso de SpCas9 de tipo salvaje, ya que la tasa de descomposición intrínseca observada para el ADN en el objetivo por HypaCas9 (0,035 s-1) y Cas9-HF1 (0,038 s-1) fue 100 veces más lenta que con SpCas9 (4,3 s-1). Esta tasa de corte más lenta da tiempo a que una pequeña fracción (del 8 al 25%) del ADN en el objetivo se disocie antes de ser cortado.
La partición cinética para favorecer la disociación fue mayor cuando HypaCas9 y Cas9-HF1 reaccionan con el ADN fuera del objetivo porque las tasas de corte se redujeron aún más a 0,0023 s-1 y 0,00014 s-1, respectivamente (Fig. 4e, g, Fig. suplementaria 9c, e). Estas tasas son entre 50 y 860 veces más lentas, respectivamente, en comparación con SpCas9 en un sustrato fuera del objetivo. En consecuencia, sólo el ~24% y el ~10% del ADN fuera del objetivo unido se comprometió a seguir adelante para la escisión por HypaCas9 y Cas9-HF1, respectivamente, en presencia de ADN trampa. En conjunto, estos resultados demuestran que las variantes de alta fidelidad diseñadas adquirieron una especificidad mejorada contra el ADN desajustado PAM-distal a través de una tasa de escisión notablemente reducida, que altera la partición cinética para favorecer la liberación en lugar de la escisión del sustrato unido tanto para el ADN on-target como para el off-target, pero el efecto es mayor para el ADN off-target. El cálculo de las constantes de velocidad de disociación aparente utilizando la Ecuación (3) muestra que las variantes de alta fidelidad no aumentan la velocidad aparente de liberación del ADN (Tabla Suplementaria 1).
Más bien, el aumento de la discriminación se atribuye enteramente a la disminución de la constante de velocidad aparente para la escisión.
En nuestras descripciones de la cinética de las enzimas Cas9 hasta ahora, las tasas de decaimiento observadas de las reacciones se estimaron sobre la base de los datos de ajuste a las funciones exponenciales, que producen valores propios que suelen ser funciones complejas de múltiples constantes de velocidad17. Para comprender plenamente la cinética y el mecanismo, todos los experimentos para cada enzima y sustrato de ADN se ajustaron globalmente basándose en la integración numérica de las ecuaciones de velocidad utilizando un único modelo unificado (Fig. 5 y Figs. suplementarias 10-14). El ajuste global de los datos muestra que nuestro modelo mínimo (Fig. 5f, recuadro) da cuenta de nuestros datos y cada una de las constantes de velocidad está bien definida en base al análisis del contorno de confianza que comprueba hasta qué punto cada parámetro está restringido por los datos (Fig. 6)17,28. Obsérvese, en particular, que nuestro modelo da cuenta de las trazas bifásicas observadas en algunos experimentos sin tener que invocar la heterogeneidad, y proporciona constantes de velocidad intrínsecas para cada paso de la vía, incluyendo la formación del bucle R y los eventos de escisión de HNH y RuvC. Aunque es probable que se requieran reordenamientos estructurales adicionales no resueltos para la alineación de los residuos catalíticos para la escisión del ADN, éstos aún no se han resuelto como eventos cinéticamente distintos. El modelo actual representa una vía mínima necesaria y suficiente para dar cuenta de todos los datos disponibles, y puede ampliarse fácilmente a medida que se disponga de nueva información para definir pasos adicionales en la vía.
a Escisión iniciada por el ADN y el Mg2+ por el dominio HNH. b Escisión iniciada por el ADN y el Mg2+ por el dominio RuvC. c Tasa de formación del bucle R. d Escisión iniciada por el Mg2+ por el dominio HNH. e Escisión iniciada por el Mg2+ por el dominio RuvC. f Efecto de la trampa de ADN en la partición cinética de la escisión de Cas9. Todas las curvas se calcularon basándose en el ajuste global de los datos según el modelo cinético (recuadro), con las constantes de velocidad mostradas en la Tabla 1. Las estimaciones de error se basaron en el análisis del contorno de confianza, como se muestra en la Fig. 6. E es Cas9.gRNA, D es el ADN diana, ED es Cas9.gRNA.D es el ADN diana, EDH es la formación del bucle R con el acoplamiento de la cadena diana al HNH, EDHR y EDP1R son la formación del bucle R con el acoplamiento de la cadena no diana al RuvC, EDHP2 es la escisión del RuvC de la cadena no diana, EDP1 es la escisión del HNH de la cadena diana, EDP1P2 es la escisión de ambas cadenas, Dtrap es el exceso de ADN no marcado y perfectamente emparejado. EDtrap es Cas9.gRNA.DNAtrap.
Se muestran los contornos de confianza para el ajuste de datos en la Fig. 5. Las constantes de velocidad numeradas se definen en nuestro modelo cinético (Fig. 5f, recuadro). El umbral χ2 (línea discontinua) se fijó en 0,99 para definir los límites superior e inferior de cada constante de velocidad, tal como se describe17,32. Dado que los contornos eran simétricos con parámetros bien restringidos, informamos de los límites de error ± en la Tabla 1. Para este análisis se calculó un umbral χ2 utilizando una distribución F y se utilizó para definir los límites inferior y superior para cada parámetro.
Para entender la especificidad de la enzima, las constantes de velocidad deben interpretarse en el contexto de todos los pasos cinéticamente relevantes como se ilustra en el perfil de energía libre (calculado utilizando la Ec. (4) a partir de las constantes de velocidad de la Tabla 1).
El coeficiente de transmisión A = 0,001
Dado que el ajuste global de los datos proporciona las constantes de velocidad para cada paso relevante (Figs. 5 y 6), podemos construir un perfil de energía libre de buena fe (Fig. 7b, y Figs. suplementarias 10-14). Los perfiles de energía libre que comparan SpCas9, HypaCas9 y Cas9-HF1 muestran un cambio en los pasos que limitan la velocidad y determinan la especificidad. La especificidad de la enzima se define por kcat/Km y viene dada por la barrera global más alta en relación con el estado inicial, mientras que la tasa máxima, kcat, se define por la barrera local más alta en relación con el estado anterior, atenuada por cualquier paso de equilibrio rápido precedente. Dado que las constantes de velocidad para la formación del bucle R no cambian significativamente con diferentes sustratos y variantes de la enzima, la especificidad se rige en gran medida por la partición cinética del bucle R de Cas9, el estado EDH en nuestro modelo cinético (Fig. 5f, recuadro), para avanzar dando lugar a la escisión irreversible o a la liberación a través del resellado del ADN y la expulsión de la enzima. Las barreras generales más altas para la escisión observadas con las variantes de alta fidelidad aumentan la probabilidad de partición cinética para favorecer la disociación del ADN (Fig. 6c).
a Representación en dibujos animados de la vía de reacción de las enzimas Cas9. b Perfiles de energía libre para la escisión de SpCas9 de un objetivo (línea gris) de Gong et al.15 y fuera del objetivo (línea roja), respectivamente; la escisión de HypaCas9 de un objetivo fuera del objetivo (línea azul); y la escisión de Cas9-HF1 de un objetivo fuera del objetivo (línea negra). Cada perfil se calculó mediante la teoría de los estados de transición utilizando las constantes de velocidad y equilibrio derivadas del ajuste global de cada conjunto de experimentos (Tabla 1). Obsérvese que las barreras más altas para la escisión del ADN en relación con la barrera más baja para la reacción inversa precedente aumentan la probabilidad de liberación del ADN. c Gráfico de barras de resumen para k2, k3 y partición cinética (P).