PARADIGMS OF THE Role of CD40-CD40L INTERACTIONS IN DISEASE

Transplantation. 移植手術は、移植拒絶反応のリスクを最小限に抑える効率的な免疫抑制剤の開発なくしては、過去数十年間に見られるような成功の度合いに達することはなかったであろう。 CD40Lに対するモノクローナル抗体（MAb）は、多くの動物移植モデルで免疫抑制剤として使用されてきた。 霊長類では、抗CD40L MAbの投与は移植片の拒絶反応を遅らせるが、細胞表面分子CTLA-4の細胞外ドメインとCD28-B7経路を遮断するヒトIgG1のFc領域からなるキメラ蛋白であるCTLA4Igとの併用は相加・相乗的な効果を発揮する。 この併用療法は霊長類では腎臓移植の生存率を持続させ、マウスでは皮膚移植の生存率を高める（53, 69）。 CsAがT細胞上のCD40L発現をダウンレギュレートすることが知られているが、CsAによる60日間の従来の免疫抑制の後、抗CD40L MAb治療に切り替えることは、サルの腎移植モデルにおいて有効な治療法であった(7)。 CD40Lの遺伝子発現は、急性拒絶反応の場合に4倍に増加することが証明されている。 このことは、移植片の機能をモニターするための非侵襲的な方法として、またCD40L誘導を阻害することが知られているCsAやタクロリムスなどの古典的な免疫抑制剤に対する生物学的反応を決定するための方法として有用であろう(54)。 動物移植モデルでは、カルシニューリン阻害剤はin vitroではT細胞のCD40L発現を抑制するが、リンパ組織では抑制しないことから、これらの薬剤による治療中もCD40-CD40L経路は機能しており、これが臨床場面での移植片拒絶反応に寄与していると考えられる（63）＜4859＞＜1104＞動脈硬化症。 欧米で最も多く見られる致命的な疾患であるアテローム性動脈硬化症の現在の見解は、免疫系が重要な役割を果たすと考えられている慢性、変性、炎症性疾患であるというものである。 CD40およびCD40Lは、実験およびヒトの動脈硬化病巣で過剰に発現している。 内皮細胞、平滑筋細胞、マクロファージなどのアテローム関連細胞におけるCD40のライゲーションは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、メタロプロテアーゼなどのアテローム性動脈硬化の進展に関わるメディエーターの発現を増加させることにつながる。 マウスで抗CD40L MAbを用いてCD40-CD40L相互作用をブロックすると、マウス粥腫の形成と進行が減少するが、病変の生物学的および構造におけるこのような変化が助長され、ヒト疾患におけるプラークの安定化において重要であると考えられる（52）

血小板もCD40Lを発現し、生体内で損傷内皮への炎症細胞の動員に対して大きく寄与すると考えられている（5）。 CD40Lを発現する活性化T細胞は、動脈硬化の血管壁内に位置し、この事実は、活性化CD4+ T細胞が動脈硬化のプロセスを指揮することがあるという仮説を支持している(43).

CD40-CD40Lペアが役割を果たすと考えられる他の疾病を表1に簡単に概説する。 自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、および多発性筋炎におけるこの相互作用の役割についての簡単な議論は以下の通りである。

CD40-CD40L相互作用が役割を果たす可能性のある非リウマチ性疾患

SLE。 (i)ヒトSLEにおけるCD40Lの発現（表2）。 Desai-Mehtaらは、活動性ループス患者からの末梢血単核細胞（PBMC）が、健常者と比較してCD40L+ CD4+細胞の割合で21倍の増加を示すことを報告している。 さらに抗CD3 MAbでPBMCを刺激すると、CD40L+ CD4+細胞の割合は健常者で5倍増加したが、活動性SLE患者では1.4倍にしかならなかった。 しかし、CD40L+ T細胞の割合は依然として活動性-SLEグループでより高いままであった。 寛解期にあるSLE患者からのPBMCは、対照群と同様の挙動を示した。 SLE患者から新たに分離したCD8+T細胞によるCD40Lの発現に関しても同様の観察がなされた（対照群に比べ22倍高い発現）。 B細胞は活性化T細胞で観察されるのと同程度にCD40Lを過剰発現している。 正常なヒトB細胞は、CD40Lを自発的に発現する活性型SLEのB細胞とは対照的に、非常に低レベルで、操作されたときのみ発現する（12）。

CD40L expression on B and T cells from SLE and RA compared with healthy B and T cells

Koshy et al.が発表した研究では、健康人または疾患コントロール患者からの活性化PBMCはCD40Lの高強度の発現を示して48時間後にはベースライン値近くまで徐々に減少したが、ループスのPBMCはこの時点でCD40Lの有意な高濃度を引き続き示していた。 この研究では、CD40L発現と疾患活動性の明らかな相関は認められなかった(33)。

Higuchiらは、SLEとマウスループスの両方でこれらの結果を確認し、ループスB細胞における異所性CD40L発現が、SLE発症に重要な役割を果たす可能性を示唆した。 B細胞にCD40Lを発現するトランスジェニックループス傾向マウスは、自発的に自己抗体を産生し、さらにその半数は免疫複合体沈着を伴う糸球体腎炎を発症する(22)。 Deviらは、TおよびBループス細胞上にCD40Lが高発現していることも確認している。 具体的には、SLE患者のT細胞の45％がCD40Lを発現しているのに対し、健常者やRA患者のT細胞ではわずか8〜18％であった。 さらに、調査した48人のSLE患者のうち30％は、B細胞上でもCD40Lの発現が増加していた(13)。 しかし、上記の結果とは対照的に、ループスリンパ球のCD40L発現に変化が見られなかったという報告もある。 その代わりに、これらの著者らは、重要なコスティミュレーション分子でもあるCD86がSLEのB細胞に高発現していることを報告している(3)。 別の研究では、活動性SLE患者の単球がCD40Lを異常に発現していることが報告されている。 23名の活動性SLE患者を調査し、16名の健常者と比較した。 その結果、SLE患者からのCD40Lを発現する末梢単球の頻度は、健常者に比べて7倍も増加していることがわかった。 CD40Lの発現はmRNAとタンパク質の両レベルで確認され、疾患活動性と有意な相関があった(28)。

CD40Lは、活性化T細胞の細胞表面からマトリックスメタロプロテイナーゼによって切断されて、約18から20kDaのsCD40Lとなり、この分子はホモ三量体を形成しています。 sCD40Lの機能的役割を研究した報告によると、sCD40LはB細胞の活性化と分化を誘導することができると結論づけている。 血漿中sCD40L濃度は、活動性SLE患者では健常人ドナーに比べ有意に高かった。 これらのレベルは、SLEDAIによって評価される疾患活動性、および循環抗二本鎖DNA（dsDNA）自己抗体価と相関していた。 活動性SLE患者に見られる高レベルのsCD40Lは、血管炎や活動性ループスで起こる腎炎において病原的な役割を担っているのではないかという仮説が立てられている。 著者らは、将来、sCD40LレベルがSLEの病状悪化の予測マーカーとして機能する可能性を提唱しています(27)。 Vakkalankaらも、ループス患者におけるsCD40Lの平均濃度が、疾患対照者や健常者に比べて有意に高いことを示している。 具体的には、66名のSLE患者を調査し、30名の疾患対照患者および23名の健常者と比較しました。 健常者ではsCD40Lはほとんど検出されなかったが、SLE患者38名ではsCD40Lが2ng/ml以上（平均濃度2.61±2.15ng/ml）、疾患対照者では1ng/ml以上のsCD40Lは7名のみであった。 患者は、臨床症状によって、重症、中等症、軽症の3群に分けられた。 重症SLE患者のsCD40L平均濃度は3.93 ± 2.86 ng/ml、中等症SLE患者のsCD40L平均濃度は2.81 ± 1.57 ng/ml、最後に軽症患者のsCD40L平均濃度は 1.52 ± 1.0 ng/mlであった。06 ng/mlであり、sCD40L濃度と疾患活動性の相関が示された(62)。

活性化した正常T細胞のCD40L誘導はCsA存在下で抑制されるが、この効果がSLE T細胞には当てはまらないことは興味あることであった。 ヒトループスのCD40L発現に関する研究では、抗CD3抗体で活性化されたループスT細胞で観察された、in vitroでのCD40L発現の延長と増強をCsAで抑制することができなかったと結論づけている。 CsAに対する抵抗性は疾患活動性とは無関係であった。 循環しているループス単球もCD40Lの発現に対するCsAの抑制効果に対して顕著な抵抗性を示した。 これらの結果は、SLE T細胞におけるCD40L誘導は、カルシウム／カルシニューリン非依存的経路によって制御されている可能性を示している（29）。

なぜSLE患者でCD40L発現が高いのか、この過剰発現が病因に関係しているかどうかは不明である。 SLEのTリンパ球は、TCRの関与によって活性化されると、バランスのとれたNFAT-AP-1転写因子プロファイルではなく、NFAT優位のプロファイルを好むことが提唱されている。 この細胞内メディエーターパネルは、CD40L遺伝子を含む特定の遺伝子の転写とmRNAの安定性を促進します。 SLE T細胞におけるCD40Lの初期発現は、CsA感受性のNFAT経路を必要とするが、長期発現は特定のMAPキナーゼ、すなわち細胞外シグナル制御キナーゼに依存することがより多い。 ループスT細胞における細胞外シグナル制御キナーゼ活性の増加と持続は、AP-1転写因子の活性化を介して、またおそらくCD40L mRNAの安定化によって、CD40Lの過剰発現に寄与すると考えられる(10, 68)。 SLE患者の循環T細胞やB細胞では細胞質Ca2+フラックスが異常であり、この異常がループスにおけるCD40L発現異常の分子的背景である可能性が提案されている (38, 40, 64)。 また、SLE患者で報告されているTCR ζ鎖の欠損が、上記の異常なCa2+反応に一部関与している可能性も指摘されている（39, 61）。 この相関は、ループスT細胞におけるTCR ζ鎖の欠損をトランスフェクションで補正すると、細胞質Ca2+フラックスが正常化するという最近の報告によって補強されている(48)。 免疫反応におけるCD40/CD40Lの多機能性は、自己免疫疾患における治療介入のための魅力的なターゲットとなった。 CD40Lに対するMAbは、まずマウスのループスモデルでテストされました。 New Zealand Black × New Zealand White (NZB×NZW) F1マウスに抗CD40L抗体を持続注入したところ、発病が平均4カ月遅れ、IgG抗dsDNA自己抗体レベルが低下し、活性化メモリー表現型を持つT細胞の蓄積が遅れ、脾臓のB細胞数が低下し、Igクラススイッチと身体突然変異が抑制された。 血清中のIgG抗dsDNA抗体レベルは、未治療の年齢をマッチさせた対照群に比べ4〜10倍低下していた。 投与中止後、T細胞の表現型は対照と区別がつかなくなり、B細胞は完全に活性化した表現型になり、IgG抗dsDNA抗体価の上昇、蛋白尿の発現、進行性腎臓病の発生がみられた(65)。 NZB×NZWのF1前腎炎マウスに短期間併用投与したところ、腎機能障害の発症が約6ヶ月遅れた。 タンパク尿の発症後、投与を繰り返すと、既治療マウスでは寛解を誘導できたが、未治療マウスでは寛解を誘導できなかった。 IgG抗dsDNA自己抗体のレベルの減少が見られ、マウスの脾臓は注入後16〜20週でもB細胞が著しく枯渇していた。 CTLA4Igと抗CD40L抗体による治療が相乗的に作用して、抗アポトーシスシグナルをブロックし、その結果、初期のB細胞活性化においてB細胞のアポトーシスを促進するのではないかと推測された。 この治療法は長期のグローバルな免疫抑制を引き起こさなかった(66)。

動物実験研究で得られた有望な結果は、SLEでは確認されなかった。 ヒトのループスでは、シクロフォスファミドは主要な臓器病変の治療のための「ゴールドスタンダード」であることに変わりはありません。 シクロホスファミドはアルキル化剤であり、非特異的な免疫反応の抑制と臨床的に重要な免疫抑制を引き起こします。 膀胱癌や性腺障害などの重大な副作用があるため、新たな治療介入の必要性が生じています。 シクロホスファミドの投与は、SLEの一般的で恐ろしい合併症であり、罹患率と死亡率の主要原因の1つであるループス腎炎の治療法として確立されています

ヒトループスにおける抗CD40L MAb投与の2つの研究が発表されています。 1つ目の第2相二重盲検プラセボ対照多施設共同試験では、軽度から中等度の活動性のSLE患者85名が登録され、16週間にわたってIDEC-1（抗CD40L抗体）またはプラセボを6回注射されました。 有効性は20週目に、主にSLEDAIを用いて評価されました。 4859>

2番目の試験は、生検で証明された増殖性ループス腎炎患者を対象に、BG9588（抗CD40L抗体）を用いて評価したものである。 活動性の増殖性ループス腎炎の患者28名が登録され，BG9588 20mg/体重kgを最初の3回は隔週間隔で，追加の4回は月間隔で投与された。 その結果、腎機能の悪化なしに蛋白尿が50％減少し、血尿が消失し、血清C3濃度が上昇しました。 抗dsDNA抗体価は治療後低下し、治療後1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月でそれぞれ平均38.8%、50.1%、25.3%の減少がみられた(4)。 この試験は、血栓塞栓症の合併症により早期に中止された。 具体的には、心筋梗塞が2例報告された。 この治療レジメンに合併した血栓症の影響は、ヒトを対象とした今後の研究に関して重要な問題を提起した。 なお、血栓症を発症した患者の中には、抗リン脂質抗体を持つ者はいなかった。 これらの血栓性合併症におけるCD40-CD40L相互作用の役割はまだ不明であり、仮説に過ぎない。

抗CD40L療法を受けたループス腎炎患者5人の研究では、この治療の短期コースがIgG抗DNA抗体産生B細胞数の減少につながることが示されました。 これらの変化は治療中止後数ヶ月間持続しました(25)。 抗CD40L治療（BG9588）を受けた4人の活動性ループス腎炎患者を対象とした同様の研究では、抗CD40L治療中にB細胞分化マーカーとされるCD38、CD5、CD27を発現するB細胞が末梢から消失していることが示されました。 これらの変化は、抗dsDNA抗体値、蛋白尿、SLE疾患活動性指数の低下と関連していた（20）＜4859＞＜1104＞RA. (i) RAにおけるCD40Lの発現(表2)。 RAは、一般的な自己免疫性全身性リウマチ疾患であり、抗原駆動型免疫反応の継続に起因する慢性的な組織破壊プロセスによって特徴づけられる。 活性化T細胞が重要な役割を果たすと考えられているため、CD40-CD40L相互作用がRAとの関連で研究されてきたことは驚くべきことではない。

Berner らは、RA患者のT細胞におけるCD40Lの発現を研究した。 RA患者62名と健常者20名が研究対象となった。 CD40LはRA患者の29％ではT細胞の>10％に強く発現していたが，健常対照者ではT細胞の0％にしか発現していなかった。 >10% CD4+CD40L+T細胞を持つRA患者は、より活発な疾患を有していた。 このグループの患者の83%はCRP値が上昇し、89%はリウマトイド因子（RF）陽性で、臨床的完全寛解の米国リウマチ学会の基準を満たした患者はいなかったことから、疾患活動性とCD40L発現の間に強い相関があることが示唆された(2)。 CD40Lの高発現は、リンパ球の活性化が増強され、その結果、炎症活性が増強され、長引くことを反映していると考えられる。 RA患者からのT細胞における高レベルでの機能的CD40Lの発現は、MacDonaldらによっても証明された(42)。 健康な免疫系では、高親和性自己反応性B細胞は削除されている。 健常者では、低親和性RF産生B細胞はリンパ節に存在するが、高親和性RFは検出されない。 RAでは、高親和性RF産生B細胞は炎症を起こした滑膜内に蓄積する。 本研究の結果、活性化T細胞上のCD40LとRF産生B細胞上のCD40との相互作用は、これらの自己反応性B細胞の生存のみならず、RF合成にも重要であることが示された。 in vivoでの高親和性RF合成の誘導に必要かつ十分なシグナルは、IgGとCD40-CD40Lの相互作用であることが判明した。 CD40-CD40L相互作用がない場合、RF B細胞は削除された（35）。

Cho らは、血管内皮増殖因子（VEGF）の産生におけるCD40-CD40L相互作用の役割について研究している。 RAでは、炎症を起こした滑膜が腫瘍のような特徴を持つ。 滑膜への単核細胞の広範な移動とパンヌスの過成長は、豊富な血管床の存在に依存するため、リウマチ性パンヌスの永続と拡大は新生血管形成に依存している。 VEGFはヘパリン結合性二量体糖タンパク質で、血管新生の中心的なメディエーターであり、内皮細胞の増殖と毛細血管の透過性を誘導する。 活性化T細胞のCD40Lによる滑膜線維芽細胞のCD40ライゲーションは、VEGFの産生を増加させ、この産生はIL-1、TNF-α、トランスフォーミング増殖因子βの存在下でさらに増強することが証明された(8)。 RA滑膜細胞上のCD40を滑膜内の活性化T細胞上のCD40Lでライゲーションすると、TNF-αの産生が用量依存的に有意に増加する(21)。 TNF-αはRA病態における重要なサイトカインである。 TNF-αα の他に、CD40-CD40L の相互作用により IL-10 の産生が増強される (15)。 RA患者の滑液T細胞は、健常人ドナーの末梢血T細胞に比べ、CD40Lを高発現し、in vitroでの活性化後、長時間、高発現を示すことがわかった。 その結果、RA患者の滑液T細胞の8.71%がCD40L+であったのに対し、対照群では1.74%であった(41)。 RA発症におけるCD40-CD40L相互作用の潜在的な役割は、RA患者の治療アプローチとしてこの軸の薬理学的操作の取り組みにつながった。 抗CD40L MAbによる治療は、RAの動物モデルであるコラーゲン誘発関節炎の発症を抑制する。 具体的には、関節炎症の発生が阻害され、炎症細胞による滑膜下組織への浸潤や軟骨の侵食が減少しました(14)。 Ig介在性関節炎モデルであるK/B×Nトランスジェニックマウスでは、臨床的に明らかな疾患発症の1週間前に抗CD40L MAbを投与すると関節炎の発症を有意に抑制したが、疾患が確立した状態で投与すると治療は不成功だった（36）

皮膚筋炎／多発性筋炎。 多発性筋炎と皮膚筋炎の患者9人を分析したある研究では、筋肉浸潤T細胞が9例すべてでCD40L+であることが観察され、上記の臨床症状におけるCD40-CD40L相互作用の役割の可能性を示唆している（58）

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