Abstract

関節リウマチ（RA）は世界的に流行している消耗型自己免疫疾患である。 本疾患は、軟骨や骨に損傷を与える滑膜の炎症によって特徴づけられる。 関節リウマチの治療に用いられる従来の薬剤は、そのほとんどが重篤な副作用を伴い、また非常に高価である。 近年、RAやその他の免疫疾患を持つ患者の多くが、補完代替医療（CAM）に頼るようになってきています。 天然植物製品は、炎症性疾患や免疫疾患に対する最も一般的なCAMの一つである。 これらのハーブCAMは、中国伝統医学、漢方医学、アーユルヴェーダ医学など、多様な伝統医学の体系に属している。 本論文では、自己免疫性関節炎の誘発と制御に関与する主要な免疫学的経路を概説し、これらの免疫経路を効果的に調節することができる様々な漢方CAMについて説明した。 RA の実験モデルにおけるハーブ製品の作用機序に関する情報のほとんどは、関節炎患者にも関連するものである。 このように、免疫経路の研究は、CAM研究におけるゲノミクスとプロテオミクスの新たな応用と相まって、異なるCAM様式の作用メカニズムに関する新しい洞察を提供すると考えられる。 炎症性自己免疫関節炎の治療のためのハーブCAM

従来の（アロパティック）抗炎症剤は、関節リウマチ（RA）を含む様々な免疫疾患の治療の主役である。 非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）や生物学的製剤（抗TNFα抗体やデコイTNFα受容体など）は、その代表的な薬剤である。 しかし、これらの薬剤の使用は、消化管出血や心血管系合併症などの重篤な副作用を伴う。 従来から使用されている抗炎症剤の副作用と高コストのために、関節炎患者は補完代替医療（CAM）の治療法を使用するようになってきています。 アメリカ人の36％以上が、異なる疾患に対して毎年CAM製品を使用しており、この傾向は増加傾向にあります。 伝統的な中国医学、アーユルヴェーダ医学、漢方、ホメオパシーは、患者集団が消費する天然物の主要な貢献者の1つです。 しかし、欧米ではCAM製品の使用と人気が高まっているにもかかわらず、その使用の主な限界の1つは、その作用機序と有効性評価の客観性についての情報が乏しいことです。 このことはまた、一般市民と専門家の両方がCAMに対して懐疑的である主な理由の1つでもある。 したがって、CAM製品の作用機序に関する研究を継続する必要がある。

多様な疾患群は、外来微生物抗原だけでなく自己抗原によっても誘発される炎症によって特徴づけられる。 自己抗原に対する反応は、自己免疫性の炎症となる。 したがって、感染症同様、自己免疫疾患（多発性硬化症（MS）、1型糖尿病（T1D）、リウマチ、動脈硬化症など）も炎症と関連している。 自己免疫疾患は、免疫システムの異常によって引き起こされることを考えると、自己免疫疾患やその他の炎症が関与する疾患に対するCAM製品の治療効果の免疫学的基盤を検証し、解明することが必要である。 本論文では、ハーブを用いたCAM製品による自己免疫性関節炎の免疫調節に焦点を当てる。 我々は、RAのプロトタイプの実験モデルとして、アジュバント関節炎（AA）（図1）について詳しく説明した。 概念的には、AAにおける主要な免疫エフェクター経路は、例えば、コラーゲン誘発関節炎（CIA）、連鎖球菌細胞壁誘発関節炎（SCWIA）、プロテオグリカン誘発関節炎などの他の様々な関節炎動物モデルを広く代表するものである。 我々は、世界の様々な地域に自生する植物に由来する様々な生薬製剤によって調節される関節炎における特定の免疫経路について詳しく説明した（表1、および図2、図3）。 これらの免疫機構には、細胞性及び体液性反応、サイトカイン反応/バランス、そして標的臓器への細胞移動が含まれます。

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図1

実験的に—。ルイスラットに誘発されたアジュバント関節炎（AA）。 (a) 関節炎を起こした前足、(b) 疾患の経過。 熱で殺したM. tuberculosis H37Ra (1 mg/rat) を皮下免疫することによりAAが誘発される。 AA の病相は、潜伏期、発症期、ピーク期、回復期である。 関節炎スコアは、関節炎の重症度を表す。 各足は0から4のスケールで評価され、ラットの4足すべてのスコアを合計することで1匹あたりのスコアが算出される。

Figure 3

Herbal CAMは、自己免疫関節炎の発症における複数のステップで介入することが可能である。 実験的関節炎は、関節炎物質（例えば、Mtb、II型コラーゲン、連鎖球菌細胞壁など）の皮下（s.c.）、皮内（i.d.）、または関節内注射によって感受性ネズミ系統に誘導することが可能である。 s.c. または i.d. で注入された抗原は、排出リンパ節に導かれ、そこで抗原提示細胞、T細胞、およびB細胞を含む免疫応答が開始される。 活性化されたリンパ球やその他の白血球は、関節に移動し、炎症性サイトカインや抗体などの様々な可溶性メディエーターを介して関節炎を引き起こす（図1）。 ハーブCAMは、関節炎に関与する複数の経路に影響を与えることにより、関節炎の発症と進行を抑制することができる。 特定の免疫経路に干渉する特定のハーブは、表1に記載されています。

関節炎の病因における上記の免疫学的事象は、治療介入のための多くの有望なターゲットを提供します（図2および3）。 我々は、ハーブCAM製品の作用機序の評価のために、様々な生化学的および薬理学的パラメータに加えて、これらおよび他のカスタマイズされた免疫パラメータをテストするために考慮することをお勧めします。 表1に示したハーブCAMは、関節炎の実験モデルにおいて、in vivoで抗関節炎活性に寄与する免疫学的事象の調節について試験されたものの代表的なものである。 当然のことながら、他にも抗関節炎活性を有する天然物がいくつかあるが、免疫系への作用はまだ検証されていない。 本論文では、免疫調節の範囲を考慮し、表1からそれらの製品のほとんどを除外しました。 関節リウマチ

RAは世界中で流行しており（0.8%）、すべての人種が罹患します。 女性は男性の約3倍の頻度で罹患しています。 発症年齢は20代後半から50代前半ですが、どの年齢でも発症する可能性があります。 小児および若年成人では、若年性慢性関節炎（JCA）として発症します。 RAは、持続的な炎症性滑膜炎を特徴とする慢性の多臓器疾患であり、通常、末梢の関節が左右対称に分布している。 滑膜の炎症がコントロールされないと、軟骨の損傷、骨びらん、罹患関節の強直を引き起こすことがあります。 双子研究や家族研究により、RAには遺伝的素因があり、患者の約70％がHLA-DR4またはDR1対立遺伝子あるいはその両方を有していることが示されている。 RA の正確な標的抗原はまだ同定されていない。 II型コラーゲン（CII）、アグリカン、免疫グロブリン結合蛋白（BiP）、熱ショック蛋白65（Hsp65）などが、RA発症に関与する抗原として指摘されている。 前述のように、NSAIDSは多くのRA患者にとって主要な治療法である。 しかし、副作用、高い費用、多くの患者での有効性が限られていることから、米国やその他の先進国では、RA患者によるCAMの使用がますます一般的になっている。 このような背景のもと、日本では「アジュバント関節炎」（以下、「アジュバント関節炎」）が注目され、米国では「アジュバント関節炎」（以下、「アジュバント関節炎」）が注目されている。 この病気は，肉球の関節を含む前肢の炎症として現れる。 肉球の炎症は、主に足首、手首、より小さな関節に起こります。 関節炎は8〜10日後に始まり、15〜17日目にピークを迎え、その後12〜15日で自然に徐々に回復していきます（図1）。 肉球の関節における主要な免疫反応は滑膜組織への単核細胞の浸潤であり、これが制御されないと軟骨や骨に損傷を与えることになる . マイコバクテリアのhsp65 (Bhsp65)は、AAの病態に関与していることが示唆されている。 Bhsp65は、Mtb注射後、局所排出リンパ節に取り込まれ、そこで抗原提示細胞（APC）がこの抗原を処理し、ナイーブT細胞に提示する（図3）。 そして、Bhsp65内のエピトープに特異的なレセプターを持つT細胞が活性化され、増殖していく。 この抗原を持ったT細胞は、リンパ節を離れ、末梢循環に入る。 そして、これらのT細胞は、血管から標的臓器である関節に移動し、免疫病態を開始する（図3）。 ラットAAは、ヒトのRAといくつかの特徴を共有しており、RAの優れたモデルとして役立っている。

このモデルは、自己免疫性関節炎の病態に関する研究や、新しい天然または合成の抗関節炎治療薬の試験に広く使用されている。 様々なハーブのCAM製品は、ラットAAモデルにおける疾患の重症度を減弱させることが示されている（表1）。 これらのハーブは、病気のプロセスに関与するさまざまな免疫学的エフェクターおよび調節経路（詳細は後述）を調節する（図2および図3）。 骨量減少につながる慢性炎症の別のモデルも、慢性関節炎に伴う骨損傷と骨量減少を制限する天然物（例えば、緑茶）の役割を調べるために採用されている。 自己免疫性関節炎の標的抗原としての熱ショックタンパク質（Hsps）

Hspsは、RA、クローン病、MS、全身性エリテマトーデス（SLE）などの多くの自己免疫疾患と関連してきた。 また、Hspsは関節炎に対する防御を誘導する可能性もある。 ほとんどのhspsは急性ストレス反応物質であり、過酷な条件下で細胞の生存を保証しています。 また、タンパク質の折り畳みや他のタンパク質の構造的完全性を維持するための他の機能に関与する分子シャペロンである。 ルイスラットの関節炎を誘発するT細胞クローンは、Bhsp65のエピトープ180-188（p180-188）に特異的であることが判明した。 若年性慢性関節炎（JCA）患者では、Bhsp65のp180-188と、関節軟骨リンクタンパク質内の部分的に相同な決定因子に対してT細胞反応性が見られた。 これらの患者のT細胞は、ヒトのhsp60およびBhsp65にも有意な反応を示したことから、Hsp65が関節炎発症の主要な抗原の一つであることが強調された。 hsp70 や hsp47 を含む他の hsp もまた、関節炎の発症に関与していると考えられている。 齧歯類とヒトの疾患関連抗原に対する免疫反応の類似性から、疾患発症メカニズムに関する有用な知見が得られている。

フラボノイドやセラストロールなどの天然植物がhspsの細胞発現を変化させることが示されている。 これらの観察は、緑茶フラボノイドやセラストルスのエタノール抽出物で観察された疾病予防効果を考慮すると、潜在的に重要である。 しかし、この2つの観察結果の間の正確なメカニズムについては、まだ十分に解明されていない。 CAM による抗原特異的 T 細胞応答の調節に関して、我々は、漢方処方である霍去病（HLXL）丹をルイスラットに与えると、Bhsp65 に対する T 細胞増殖応答が著しく減少し、この効果は関節炎の抑制に関連することを示した。 一方、緑茶抽出物またはセラストラスをラットに与えたところ、AAの重症度が有意に低下したにもかかわらず、Bhsp65に対するT細胞増殖反応に影響を与えることはできなかった。 しかし、後述するように、これらのラットはBhsp65に対するサイトカイン反応に有意な変化を示したが、T細胞増殖には全く変化がなく、この2つの免疫パラメータの二面性が明らかとなった。 我々の結果を裏付けるように、他のいくつかの天然物（例えば、ケルセチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ビネアトロール）も、リンパ球の増殖反応に影響を与え、そのほとんどが増殖反応の抑制につながることが報告されている 。 また、Kaemferolのような天然物にさらされたリンパ球の増殖と機能との間に解離があることも報告されている .

5. CD4+CD25+T制御細胞（Treg）は自己寛容と自己免疫の制御に不可欠である

Th2、Th3、Treg、NKT細胞、Tr1など多くの種類の制御T細胞が記述されてきた。 制御性T細胞のグループに最近加わったのは、CD4+CD25+ T-regulatory cell (Treg)である。 Tregは、ヒト自己免疫疾患の様々な実験モデルにおいて、自己免疫の中心的な制御因子として浮上してきた。 重要なことは、動物モデルにおいて、細胞の養子移入によるCD4+CD25+ T-細胞療法は、糖尿病、大腸炎、胃炎を含む様々な免疫疾患を効果的に遅らせたり抑えたりすることができることである . 逆に、in vivoでのTregの枯渇は、他の自己免疫疾患と同様に自己免疫関節炎の早期開始および／または悪化につながる。

Tregには、胸腺で発生する「ナチュラルTreg」と、抗原曝露に反応して末梢で発生する「アダプティブ（誘導）Treg」の2種類が存在する。 Tregの作用機序は、Tregとレスポンダー細胞との細胞間接触であり、T細胞受容体（TCR）を介したTregの活性化が必要である … 続きを読む 分泌されたTGF-βやIL-10は、in vivoでTregによる抑制を媒介することが示唆されている。

Tヘルパー17（Th17）とTregの分化が相互に制御されていることを示す証拠が存在する。 炎症性で病原性のあるTh17細胞の分化は、TGF-βとIL-6の同時存在によって誘導されるが、TGF-βの単独存在では、転写因子Foxp3を発現するTregの生成が誘導される.

ここ5-10年の間に、自己免疫疾患のプロセスを評価したり、異なる自己免疫疾患に対する治療薬の効果を評価したりするために、Tregの頻度と抑制機能を決定することの重要性がますます認識されてきています。 RAではTregの欠損が報告されており、このTregの活性低下は、例えばRAの場合、抗TNF-α抗体による治療が成功すると回復することがある。 最近の移植研究の分野では、Tryptolide（Tripterygium wilfordiiという漢方薬に由来する）で処理した樹状細胞が、in vitroでTregの拡大を促進することが示されている。 Tregの数や機能の評価は、天然植物を含む様々なCAMの作用機序を明らかにすることを目的とした研究において、定期的に取り入れられることが期待されている。 また、上述したように、制御性T細胞はTreg以外にも様々な種類が存在する。 例えば、ある製品はTregに対してより顕著な効果を示し、他の製品はTh2またはTr1タイプの制御性細胞に対して主要な効果を示すかもしれない。 自己免疫性関節炎の発症に寄与する抗体

自己免疫性関節炎の自然発症モデルにおける研究により、この疾患における免疫病理の仲介における抗体の重要性が強調された；病理はT細胞によって開始されるが、その後、抗体によって永続化する。 マウスのCIAモデルの研究では、II型コラーゲン（CII）に対する抗体の重要性が明らかにされた。 しかし、現時点では、AAにおけるhsp65に対する抗体の生理的な役割については、あまり情報がありません。 AAにおける抗hsp65抗体の病原性については、正式には否定されていない。 それどころか、他の研究者や我々が行った研究から、抗Bhsp65抗体のAAに対する防御効果を指摘する証拠もある。 ある研究では、抗Bhsp65抗体によるAA保護効果は、単核細胞からのIL-10の産生に起因するとされています。

CIAモデルでは、緑茶ザクロの抽出物 、タキソールが関節炎を抑制することが示され、この効果は抗CII抗体の有意な減少に関連していることが示された。 また、ウコンの主要成分であるクルクミンを投与した場合の臨床病態、炎症性サイトカイン、血清IgG2aに対する同様の効果が、CIAに関する別の研究において報告された。 また、ウコンエキスは、連鎖球菌細胞壁誘発関節炎モデルRAにおいて、関節炎に対する保護作用を誘導することが示されています . AAモデルに基づく我々の研究の1つでは、緑茶のポリフェノール抽出物をLewisラットに与えたところ、Bhsp65に対する抗体反応が有意に減少したことが観察された . 同様の結果は、11種類のハーブを混合した漢方薬であるHLXLでも得られている。 どちらの場合も、抗体反応の低下は、それに対応する関節炎の重症度の低下と関連していた。 しかし、私たちが試験したすべての抗関節炎ハーブがBhsp65に対する抗体反応を低下させたわけではありません。 別の研究では、LewisラットにCelastrusを与えると、臨床的な関節炎が有意に抑制されたにもかかわらず、抗Bhsp65抗体反応が増加したことから、我々は逆の結果を観察した。

現時点では、異なる植物製品を与えた場合に主に変化する抗体サブセットの機能的属性の違いを明らかにするための追加情報はない。 しかし、我々は、Lewis ラットの AA の経過中に産生される抗 Bhsp65 抗体は、病原性と防御性の 2 つの主要なカテゴリに属することを提案する。 この文脈で、我々は、異なるハーブが異なるサブセットの抗体を標的とし、臨床的関節炎の軽減には、病原性抗体の抑制または防御抗体の増強のいずれか、あるいは両方が関与している可能性を示唆するものである。 さらに、関節炎や他の自己免疫疾患で標的となる抗原のパネルを使用した抗体のパターンの研究は、病気のプロセスでCAM製品の効果について有用な読み出しを提供するかもしれません。 Tヘルパー（Th1）-/Th2-タイプサイトカインのバランスを介して自己免疫の制御

マクロファージや他の免疫細胞によって生成プロ炎症性サイトカインTNF-α、IL-1βおよびIL-6は関節炎の開始と伝播に極めて重要である。 T細胞のうち、Th1細胞はIFN-γとTNF-αを分泌し、Th2細胞はIL-4、IL-5、IL-10、IL-13を分泌して、関節炎を抑制する。 Th1細胞は特定の臓器特異的な自己免疫疾患の病因に主に関与しているのに対し、Th2細胞は全身性の自己免疫に主要な役割を担っている。 自己免疫の制御におけるTh1-Th2バランスの役割は、いくつかの動物モデル研究によって検証されている。 RA患者の疾患に対する感受性や抵抗性、疾患からの保護、そして疾患の改善は、Th2型へのサイトカインバランスの変化と関連していた。 このTh1/Th2バランスの変化は、炎症性サイトカイン（例えば、IFN-γ）の減少、抗炎症性サイトカイン（例えば、IL-4/IL-10）の増加、またはその両方によって起こりうるものである。

CIAの研究では、Th2反応の活性化は、関節炎の重症度の低下だけでなく、IFN-γ産生を抑制することが示された 。 他の研究者は、緑茶、ザクロ、またはPlectranthus amboinicusの抽出物でマウスを処理することによって、炎症性サイトカイン（例えば、TNF-α、IL-1β、およびIL-6）の抑制と相まってCIAのダウンモジュールを報告した。 同様の効果は、in vitroでムータン皮質で観察されている。 セラスト、緑茶、HLXLという異なる天然植物製品を用いた3つの別々の研究で、これら3つのハーブ製品のそれぞれが、Th1/Th2比の変化と相まってAAに対する保護を誘導することが観察された。 後者の効果は、主にIL-10の増加によってもたらされ、IFN-γは変化しなかった。 また、IFN-γやTNF-αなどの炎症性Th1サイトカインは、炎症性サイトカインと免疫抑制性サイトカインの二重の役割を担っている可能性があることもわかってきた。 例えば、AAではIFN-γによる炎症の抑制が観察されている。 そのため、漢方薬によるサイトカインの変化には注意が必要である。

8. T-ヘルパー17（Th17）細胞は関節炎における炎症と組織損傷を媒介する

Th17細胞は、炎症や自己免疫疾患に関与することが示されているIL-17を分泌する． T細胞のTh17サブセットはTh1やTh2細胞とは異なり、Th17細胞の分化はTGF-βとIL-6の同時暴露によって誘導される。 レチノイン酸関連オーファン受容体γ-t (RORγt) は、Th17 細胞の分化に必要な転写因子である。 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-27 は、Th17 細胞の活性を抑制することが示されているが、IL-21 と IL-23 は、Th17 細胞のクローン拡大と安定化（維持）に重要である . IL-17 は、関節炎を含む自己免疫疾患の病態に関与していることが示唆されている . RA患者の滑液には、豊富な量のIL-17が検出されている。 可溶性IL-17受容体や中和抗IL-17抗体によるin vivoでのIL-17の遮断は、ネズミの関節炎を著しく減少させる。 さらに、IL-17あるいはIL-17受容体を欠損させたマウスは、CIAの誘発に抵抗性を示すことが判明した。

前節では、天然植物製品によって誘導されるTh1-Th2比率のシフトがルイスラットのAAの重症度の低下と関連していることを示した我々の先行研究の結果を要約した． これらの研究のうち2つでは、IL-17の反応についても検証した。 重要なことは、緑茶またはHLXLをラットに与えると、IL-17反応が有意に減少することであった。 このように、Th1/Th2比とIL-17反応の同時変化が、緑茶とHLXLの有益な抗関節炎活性に結実したのである。 ケモカインと接着分子による関節炎における白血球の標的臓器への移動の制御

血液から関節へのリンパ球、マクロファージ、その他の細胞の移動は、ケモカインと接着分子を介した特定の相互作用によって制御される。 ケモカインは、血管内腔から末梢の炎症部位に白血球の移動を誘導する化学誘引性サイトカインである。 ケモカインとその受容体の発現は、サイトカインや他の炎症性メディエーターの影響を受けます。 ケモカインやその受容体の発現の異常は、免疫病態を引き起こす可能性がある。 これらの分子をアンタゴニストや抗体によってブロックしたり中和することは、実験モデルやRA患者における関節炎の治療のために研究されています。 このように、様々なケモカインや接着分子の発現レベルの研究、および適切な試薬によるこれらの生体分子の遮断は、抗関節炎活性を有するCAM製品の作用メカニズムを定義するための重要なツールとなり得るものである。

多くの漢方薬が異なる組織における特定のケモカインの発現を調節することが報告されており、これらのケモカインの多くは関節炎における白血球の関節への移動にも関連している。 我々の研究の一つで、放射性同位元素で標識した白血球のin vivoでの移動を調べる簡便な方法を報告した 。 また、関節を通過する白血球の移動の速度と関節炎に対する感受性の間に明確な関連性があることを示しました。 今後、このようなアッセイをCAM研究に使用する際には、必要に応じて放射性標識の代わりに蛍光色素を使用することが可能である。 結論：

この論文は、実験的自己免疫関節炎の治療のための多種多様なハーブCAMの作用を媒介する細胞性および液性免疫学的エフェクター機構に焦点を当てたものである。 しかし、天然物は、これらの経路の特定の分子メディエーターを変更することを介して、炎症と関節炎のプロセスの抑制に貢献することができます。 例えば、天然物から精製された様々な化合物（茶ポリフェノール、ボスウェリック酸、モリンなど）の抗関節炎活性は、その抗酸化活性と核因子-kB（NF-kB）、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）、5-リポキナーゼ（5-LOX）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMPs）への作用に一部起因しています（レビュー記事）。 したがって、ハーブ製品に関する今後の研究では、疾患プロセスの病理学的、免疫学的、生化学的、および分子生物学的関連側面にまたがる試験パラメータを含めることが有益であると考えられる。 免疫学的側面では、新しいサイトカイン（例えば、IL-17/IL-23軸）やTregに関するin vitroおよびin vivoのCAM研究が増えることが期待される。 さらに、CAMのゲノミクスとプロテオミクスの研究は、CAM研究への投資が現在進行中であるいくつかの近代的研究ツールの代表的なものである。 このことは、CAM研究の深化と幅を広げるだけでなく、CAMと従来の医学が治療薬の作用機序を理解し、患者の最終的な利益のために実用化するための共通の基盤を提供することになるであろう。 RA治療薬として成功する可能性のある天然物や化合物を確実に予測することは、かなり困難である。 しかしながら、RAの動物モデルから得られた結果、および示されたハーブ製品の複数の免疫学的および分子的標的の定義に基づき、茶ポリフェノール、セラストロール、トリプトライド、クルクミン、ボスウェリック酸、HLXLは、RAの前臨床および臨床試験をさらに行う有望な候補として見出されたのである。

謝辞

著者らは、Hua Yu、Ying-Hua Yang、Steva Komeh-Nkrumahの有益な批評と提案、Siddaraju Nanjundaiahの細かいアートワークへの協力に感謝している。 この研究は，米国国立衛生研究所補完代替医療センター（National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA）からの助成金（R01AT004321, P.I.: KDM, and PO1 AT002605, P.I.: BMB）により行われた

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