Fungi examined

Escovopsioides isolates were obtained from fungus garden of different leafcutter and non leafcutter ant species collected in prior research …過去の研究で集められた様々な葉刈りアリと非葉刈りアリの栽培菌の拮抗菌である。 このコレクションは、Acromyrmex subterraneusから得られたE. niveaのタイプ種に加えて、Ata sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi and Trachymyrmex tucumanusから得られた20株である(Table 3)． また、ブラジル・パラ州パラウアペバスで見つかった非葉刈りアリのApterostigma megacephalaのコロニーから1株追加で分離された（表3）。 すべての分離株は、PDA上のヒアルロン酸コロニー、鞭毛状のフィアライドを持つ終末および間質小胞、長い鎖状のヒアルロン酸分生子、アロイコニダ、クラミドスポア様構造というエスコヴォプシオイド属の特徴的な形態学的特徴を有していた。

分離株は、真菌生態・系統研究所 (LESF, Rio Claro, São Paulo State, Brazil) で-80℃（グリセロール10%）、蒸留水10℃の条件で子虫懸濁液として保存されています。 すべての分離株は、保存しておいた分生子をPDA培地に接種し、25℃、暗黒下で7日間培養することにより、ストックから復活させた。

Molecular characterization of Escovopsioides

Malt Agar 2% (MA2%), in darkenss, 5 days grown culturesからCTAB法によりゲノムDNAを抽出した． Tef1 (プライマー: EF6-20F, EF6A-1000R), LSU (プライマー: CLA-F, CLA-R), ITS (プライマー: ITS5, ITS4) をコードする遺伝子はすべての分離株について増幅された。 tef1については、1μLの希釈ゲノムDNA（1:100）を鋳型として、 illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) を用いて、以下の条件で増幅した：最初の変性ステップを94℃で2分間、続いて94℃で30秒間、最初のアニール温度を65℃でタッチダウンサイクルごとに1℃ずつ下げて15サイクル、最終伸長温度を72℃で1分間。 2回目のPCRステップを実施した。 94 ℃、30秒の後、94 ℃、30秒、48 ℃、30秒のサイクルを35回行い、最終的に72 ℃、1分間伸長させた。 ITSについては、2μLの希釈したゲノムDNA（1:100）をPCRの鋳型として用い、Schochらに記載の条件に従って行った：94 ℃、3分間、その後94 ℃、1分間、55 ℃、1分間のサイクルを35回行い、最後に72 ℃、2分間の伸長ステップを実施した。 LSUでは、2μLの希釈したゲノムDNA（1:100）を使用し、Augustinらに記載の条件に従ってPCRを行った：95℃で2分間、95℃で30秒間、62℃で60秒間、72℃で90秒間、72℃で5分間の延長を40サイクル行った。 PCR産物はGelRed™ (Biotium)で染色し、1%アガロースゲルで電気泳動後、紫外線下で可視化した。

アンプリコンはWizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) でメーカーのプロトコルに従い精製した。 サンプルはNanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) で分析し、20 ngのDNAをBigDye™ Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) を用いて製造元の指示に従って塩基配列を決定した。 EscovopsioidesのITS領域はGC含量が高いため、配列決定反応には5%のDMSOを添加した。 ABI 3500 (Life Technologies) でフォワードおよびリバース配列を作成し、BioEdit v.7.1.3 でコンティグにアセンブルした。 本研究で作成した配列はNCBI-GenBankに寄託した（Additional file 1: Table S1）。

系統解析

本研究で作成した配列に加えて、タイプ種（E. nivea）、6種のEscovopsis、Hypocrealesに属する8菌（Hypomyces、TrichodermaおよびLecanicillium）の配列はNCBI-GenBankから回収された。 このため、本研究で使用したデータセット全体では37菌種の配列が得られている（Additional file 1: Table S1）。

系統解析では、配列をMAFFTでアライメントした。 また、tef1, ITS, LSU の配列は Winclada v.1.00.08 で連結された。 再構成アルゴリズムにはベイズ推定を用いた。 jModeltest2のAICを用いて、tef1とITS/LSUについて、それぞれGTR + GとGTR + I + Gという塩基置換モデルを選択し、信頼区間を95%に設定した。 そこで、MrBayesでデータセットを分割し、それぞれ3つの加熱鎖と1つの冷温鎖で独立した解析を行った。 各解析におけるMCMCサンプリングは100万世代まで行われた。 加熱連鎖と寒冷連鎖の収束は、分割頻度の標準偏差が0.01以下になったときに起こり、その後、最初の25%の世代はバーンインとして廃棄された。

二重培養実験

葉刈りアリの培養菌に対するエスコボピオイドの拮抗能を確認するために、in vitroテストを実施した。 i）tef1遺伝子に何らかの多型が認められる、ii）関連するアリ種が異なる、iii）地理的な場所（都市や採集場所が異なる）が異なる、という基準で、Escovopsioides 21株中、13株を選択した（表3）。 選択された2つの分離株（LESF 596およびLESF 599）は、Varanda-Haifigらの研究において、菌類栽培との相互作用についてすでに評価されていた。 しかし、我々は追加のEscovopsioides分離株と比較するためにこのアッセイを再現した。

二重培養実験では、アリ種Atta sexdens rubropilosaが培養したLeucoagaricus gongylophorus FF2006を使用した。 本菌株は寒天平板上で、25℃、24日ごとに連続移植することにより維持されている。 この菌株によるゴカイ類の生産は、移植サイクルごとに確認される。 この菌はPDA培地で培養し、25℃で14日間、暗黒下で培養した。 この期間後、菌糸片（直径8mm）を、同じくPDAを含む新しいペトリ皿（90×15mm）に、境界から1.5cmの距離で移した。 これらのプレートを25℃、暗黒下で14日間培養した。 次に、あらかじめPDA上で培養しておいたエスコボピオイデスの菌糸片（直径8mm）を、相互作用菌から3cmの距離をおいて接種した。 エスコボプシオイデスの菌糸成長に対する効果を他の菌類による効果と比較するために、アタ・セクスデン・ルブロピローサ（ブラジル、ボツカトゥ）の菌園から分離したエスコボプシス属菌1株（LESF19）を用いた。 この分離株は、クロラムフェニコールを添加したPDA上に菌園の小片を接種して得た。 対照のプレートには同じ相互作用のある菌類を接種したが、エスコボピオサイドもエスコボプシスは接種していない。 すべてのプレートは、25℃、暗黒下で14日間培養した。 Escovopsioides、Escovopsis、相互作用性菌の各組み合わせを10枚のプレートで実施した。 実験プレートと対照プレートを、HP Deskjet F2050スキャナで0、2、3、5、7、10日の間隔でスキャンした。 画像はImageJ v.1.38 .

二重培養実験におけるL. gongylophorusの菌糸成長面積を、真菌分離株（EscovopsioidesとEscovopsis）対対照を被験者間変数、時間（日）を被験者内変数とし、処理における時間の反復測定を考慮して、二元混合分散分析で解析した。 データは、Shapiro-Wilk検定とLevene検定をそれぞれ用いて、正規性と分散の均質性をチェックした。 これらの基準に違反したため、データは必要に応じて対数または平方根を用いて変換された。 また、異なる糸状菌との多重比較は、ボンフェローニ補正を用いたt検定で行った。

分離菌間の比較では、Escovopsioides分離菌と接触したL. gongylophorusの菌糸成長面積を10日目のコントロールの平均面積で除した。 データは正規性と分散の均質性をチェックした。 10日目の面積で一元配置分散分析を行い、異なる処理間の比較はポストホックTukey-HSD検定で行った。 統計解析はR v. 2.12.1で行った。

Bioassays on fungus garden fragments in absence of workers

Leucoagaricus gongylophorus is cultivating in attine ant colony in fungus gardens. そこで，働きアリの保護作用がなくてもエスコヴォプシオイデスが菌庭で発育できるかどうかを調べるため，アリがいないこの基質の断片を用いたバイオアッセイを行った． 菌庭の破片は、社会性昆虫研究センター（UNESP, Rio Claro）で維持されている成熟した健全なA. sexdens rubropilosaのコロニー1個から入手した。 蟻と子虫を取り除いた2 cm3の菌庭片を、縁に湿らせた綿を敷いた滅菌シャーレに入れた（Elizondo-Wallace et al.による）。

二重培養実験に用いた12種のEscovopsioide（LESF 591はこの実験では使用しなかった）およびEscovopsisの各1種の菌糸塊と分生子を0.05% Tween 80で10 mL懸濁液に調製し、実験に用いた。 この懸濁液をNewmeyerによる方法に従って2〜3回ろ過し、懸濁液中に存在する菌糸片から分生糸を分離した。 次に、この懸濁液をノイバウアーチャンバーで105から2.105コニディアmL-1まで希釈した。 100μLの分生子懸濁液のアリコートをマイクロピペットを用いて庭の断片の表面上に接種した。 陰性対照として、同量の0.05% Tween 80溶液を園地表面に添加した。 菌庭のあるペトリ皿は25℃で最長10日間保管し、各処理に5皿、それぞれのコントロールに5皿使用した。 接種した菌の菌糸の発達の可能性を実体顕微鏡（EZ4、Leica）で毎日観察した。 菌庭でのエスコヴォシオデスの分生子は、菌庭に生育する菌糸片を採取し、水につけて顕微鏡（DM500、Leica）で観察した。

菌庭の生育と分生子のデータは、10日間のモニタリングで、生育なし（スコア0）、実体顕微鏡でのみ観察される生育（スコア1）、巨視的生育（スコア2）と分生（スコア3）のスコアで評価した（追加ファイル1：図 S1）。 分生子は菌庭での菌糸大発生後にのみ観察した。 5749>

エスコボピオイデスの働き蜂のいる菌床への影響

アリは菌床において、病原菌や不要な微生物に対するコロニーの防御に重要な役割を担っている。 そこで、働きアリのいない菌場でバイオアッセイに用いた菌と同じ菌の分生子（Escovopsioides 12株とEscovopsis 1株）を接種した菌場で働きアリの影響を確認する実験を行った

女王アリコロニーによるバイオアッセイは、多数のコロニーが必要であり、困難であった。 そこで、働き蜂を含む庭園片を用いたバイオアッセイを実施し、菌類分離株の影響をin vivoで評価した。 この実験セットは自然のコロニーで起こることを表しているわけではないが、試験した菌に対する働き蜂の防御作用について示唆的な情報を与えてくれるものであった。 このバイオアッセイは Elizondo-Wallace らによる方法を応用したものである。 菌園の乾燥を防ぐため、底に石膏を敷いたプラスチック容器を使用した。 プラスチック容器には、前の実験で使用したのと同じコロニーの菌園を約20 cm3入れた。 実験セットは合計84個の容器で構成され、13種類の菌の分生子による処理とコントロールはそれぞれ6個の容器を使用した。 働きアリは頭包径が1.0～1.6 mmのものを選び、各容器に50匹ずつ配置した。 1.0 mm 未満の働きアリはカウントせず、1.6 mm 以上の働きアリは除外した。 これは、1.0 mm から 1.6 mm の間にあるワーカーが有意にクリーニング活性を持つため、各処理から 6 つのコンテナ間および処理間の均質性を確保するために採用された手順である。 容器の内面はテフロン®でコーティングし、アリが逃げないようにした。

容器は25℃で3日間培養し、菌園を安定化させた。 上記のようにして、子嚢菌懸濁液を得た。 合計1mLのコニジア懸濁液を噴霧器を用いて菌庭の表面に散布した。 陰性対照の菌庭には、滅菌した0.05% Tween 80溶液を1mLだけ噴霧した。

実験は、菌庭の健全性を確認するために、接種後0、5および10日後にモニターした。 このパラメータはスコアリングシステムに基づいており、健全な庭はスコア0、部分的に劣化した庭はスコア1、完全に劣化した（「感染した」）庭はスコア2とした。 菌庭の破片がアリによって除去され、ゴミ捨て場に割り当てられたことが、我々が調べた庭の劣化の主な兆候である（追加ファイル1：図S2参照）。 各実験の6つのコンテナから3日間の観察で得られたスコアを、フリードマン検定を用いて比較した。

処理後0、5、10日目に菌園にEscovopsioides分離株が存在することを確認するために、園から断片を取り出し、150 μg mL- 1のクロラムフェニコール添加MA2%上に植菌した。 プレートは25℃、暗所で7日間培養した。 各処理から6つの容器のそれぞれについて、1つの庭の断片を含む5枚のプレートを使用し、1処理あたり合計30枚のプレートを使用した。 生育が肯定的な断片を数え、菌庭に接種した菌が長期間存在するかどうかをフィッシャーの正確検定を用いて検定した。 この分析では、実験の各日において、真菌の分生子（EscovopsioidesとEscovopsis）に感染した菌糸の割合を、分生子を全く含まない対照と比較した。 また、各日において、菌類を接種した異なる処理区間同士を比較した。