HypaCas9 and Cas9-HF1 show slow observed rates of cleavage

我々は、各 Cas9変異体の酵素活性部位濃度の測定からキネティックス分析を開始した23。24,25. DNA濃度を増加させながら酵素の滴定を行い、生成物の量を測定したところ、280 nmでの吸光度に基づく公称濃度100 nMの酵素サンプルについて、SpCas9、HypaCas9、Cas9-HF1の活性部位濃度はそれぞれ31 nM、26 nM、23 nMだった（補足図1a-d）。 また、Integrated DNA Technologies（IDT）社のSpCas9とHiFiCas925の活性部位濃度を測定し、同様の活性酵素濃度を観察した（補足図1e-f）。 いずれの場合も、シグナルを飽和させるのに必要なDNA濃度は生成物の濃度と等しく、酵素の一部がDNAと結合しても反応しないのではないかという懸念が排除されていることは重要な点である。 SpCas9のオンターゲットあるいはオフターゲットのDNA基質の動態を比較するために、まず各酵素のターゲット鎖（HNH）切断の時間経過を調べた（図1および補足図2）。 データはそれぞれ式(1)、式(2)を用いて単式または二重指数関数でフィットさせた。

ここで、Yは切断生成物の濃度、A1は振幅、λ1は観測された崩壊率（固有値）17.

ここで、Yは開裂生成物の濃度、A1は振幅、λ1は第1相の観測速度を表す。 A2は振幅、λ2は第二段階の観測速度を表す。

SpCas9によるオンターゲットとオフターゲットの基質の切断減衰の観測速度を比較すると、3bp PAM-遠位ミスマッチは酵素を13倍（1 s-1 から 0.076 s-1 ）遅くすることが示された。 両方の高忠実度Cas9変異体は、SpCas9と比較して、オンターゲットDNA基質の切断の観察された減衰速度を21-35倍劇的に減少させた（HypaCas9は0.028 s-1、Cas9-HF1は0.047 s-1 vs SpCas9は1 s-1） 。 さらに、HypaCas9とCas9-HF1は、標的外DNA切断の減衰速度を標的内DNAとのそれぞれの速度に比べて8〜290倍（それぞれ0.0033 s-1と0.00016 s-1）さらに減衰させることがわかった。 これらのデータは、設計された変異体がオンターゲットおよびオフターゲットのDNAで切断される速度が劇的に変化していることを示している。 しかし、これらの測定値だけでは、DNA切断と解離の速度論的分割の関数である特異性の変化を定義することはできない。この関数には、可逆的DNA結合、Rループ形成、HNHドメインのドッキング、DNA切断など経路17の最初の不可逆ステップに至るすべてのステップが含まれる。

DNAの巻き戻しはCas9変異体でほとんど変化しない

我々の以前の研究がRループ形成が標的上の切断の律速であると同定し、その後、他の者がRループ形成と巻き戻し速度がSpCas9とCas9-HF116の酵素特異性を規定する可能性を示唆したので、HypaCas9が同様の動態を示すかどうかをテストしてみた。 すべての酵素のR-ループ形成速度を直接測定するために、我々は-16 ntのtCoの蛍光測定に基づくストップフローアッセイを用いた。この蛍光三環シトシン類似物質は、dsDNAの塩基スタッキングによって消光し、二重鎖が開くと蛍光が大きく増加するようになっている。 tCoと2-APで標識した塩基アナログ基質をそれぞれ-16、-9、-1 ntの位置で用いた対照実験（補足図3）からは、いずれのアナログもDNA切断の観察された減衰率に影響を与えないことが示された。 tCoと2APの化学構造は、大きなCy3やCy5ラベルよりもはるかに嵩張らず、酵素の動力学に干渉する可能性が低い（補足図4）。 Mg2+存在下、SpCas9、HypaCas9、Cas9-HF1はほぼ同じ減衰速度（〜2 s-1）で標的DNA基質を解離する（図2）。 驚くべきことに、全てのCas9変種において、標的外DNA基質のRループ形成の減衰速度もほとんど変わらなかった（0.85 s-1から2.59 s-1の間で）。 したがって、DNA巻き戻しは律速ではなく、SpCas9とは異なり、高忠実度変異体の切断の観察された速度と相関しない。

Rループ形成の減衰率は、10mM Mg2+存在下で酵素（28nM）とDNA（10nM）を混合した後の時間の関数としてtCo（非標的鎖の-16位）からの蛍光増加をモニターすることによって測定された。 a, b SpCas9（28nm）とオンターゲット（a）およびオフターゲット（b）DNA、c, d HypaCas9とオンターゲット（c）およびオフターゲット（d）DNAを混合したデータ。 e, f Cas9-HF1 with on-target (e) and off-target (f) DNA.

tCoが-16 ntにあることから、我々の測定は巻き戻しプロセスの遅い段階を反映していると思われる。 比較のために、PAM のすぐ近くの位置 (-1 nt の位置) で標識した tCo を使用して、R ループ形成の減衰率を測定しました。 Cas9-RNAと標的DNA基質を急速に混合した後、DNAがtCo塩基アナログを巻き戻す際に、蛍光の著しい増加を観察した。 データを二重指数関数にフィットさせ、主要な減衰速度10 s-1を決定した（Fig. 3a-f）。 興味深いことに、これらの結果は、いったんPAM部位が酵素と結合すると、DNAの最初の巻き戻しは-16 ntで観察されるよりも速くなることを示している。 これらのデータは、-16 ntで観察された巻き戻しの正味の減衰速度は、完全な巻き戻しに至るいくつかの速い巻き戻しステップの関数である可能性を示唆している。 しかし、速度論に遅れは見られなかったので、より速く、より早い部分的な巻き戻しのステップが、-16 ntの位置で測定された完全な巻き戻しの最終的な律速ステップにつながると思われる。 巻き戻しの初期段階でのミスマッチの影響についてはさらなる研究が必要であるが、今回の測定はR-ループ形成の正味の速度について最もよい推定結果を与えている。 このラベルを使用して測定したR-ループ形成の減衰率は、テストしたすべての基質でSpCas9と高忠実度変異体の両方で区別できないので、DNA巻き戻し速度は、設計されたCas9酵素によって変化しないようである。

Rループ形成の速度とHNHドメインが標的鎖にドッキングするステップを相関させるために、先に述べたようにCy3およびCy5でラベルしたCas9をストップフロー解析して酵素の構造変化を測定した18。 簡単に言うと、Cysteine-lightバージョンのCas9は、アミノ酸355でCy3、アミノ酸867でCy5で標識されたものである。 HNHドメインが触媒活性状態に再配列されると、FRET効率が上昇する（図3g）。 FRET対で標識したCas9を完全に一致したオンターゲットDNAと急速に混合した後、FRET効率の増加を観察し、HNHドメインが触媒的に活性な状態に再配列していることを示唆する。 これは1分子のFRET測定と同様であった（図3h）。 驚くべきことに、R-ループ形成（1.5秒-1）とHNHドメインのドッキングの速度は非常に似ており、これらのステップは動力学的に関連している可能性があることが示された。

また、FRETペアで標識したDNAを用いて、1分子法でDNA巻き戻し速度の測定が行われている。Cy3とCy5はそれぞれ標的鎖の-6 ntと非標的鎖の-16 ntに標識されている16。 そこで、FRETシグナルと観察されたDNA切断速度との相関を調べるために、FRETペアを持つDNA基質もテストした。 この基質は、我々の基質と2塩基の違いがあり、具体的には、-16位と-18位にTの置換があるものである16。 標的鎖（HNH）切断の減衰速度は我々の基質と同様であり（0.7 s-1 vs 1 s-1, Supplementary Fig. 5a）、この位置の配列状況は大きな影響を及ぼさない。 また、この別の配列を持つCy3/Cy5標識DNAで切断を試みたところ、我々の配列と同様の減衰率を示した（0.05 s-1 vs 0.06 s-1、補足図5bおよび6a）。 その後、我々の配列でCy3/Cy5標識したDNAの標的鎖（HNH）切断の時間経過を、各酵素について調べた（補足図6）。 SpCas9では、Cy3/Cy5標識DNAの反応は単一指数関数的に進み、減衰率は著しく低下した（0.06 s-1 vs 1 s-1）。これは、非標識基質に比べ、DNA切断の減衰率が約17倍減少していることを示している。 HypaCas9とCas9-HF1のDNA切断速度は、それぞれ0.0046 s-1と0.0016 s-1と、非標識基質と比較して5.9倍と28.75倍遅くなることが示された。 Cy3/Cy5ラベルによる妨害が、DNA切断速度に対する高忠実度変異体の効果を変化させていることは明らかである。 これらを総合すると、かさ高いCy3およびCy5ラベルでDNAを標識することは、酵素に劇的な影響を与えることがわかった。

Cas9の特異性はkinetic partitioningによって支配されている

酵素の特異性は最初の大きく不可逆なステップに至るすべてのステップの関数であるので、DNA切断の前のすべてのイベントを考慮する必要がある17. 内在性切断速度を測定するために、SpCas9と標的外DNAをMg2+非存在下でプレインキュベーションし、結合と構造変化が平衡に達してSpCas9とDNAの複合体を形成させることによって、通常は律速となるRループ形成ステップを迂回させることにした。 その後、10 mM Mg2+の添加により化学反応を開始させた。 これまでの研究では、オンターゲットDNAと反応するSpCas9ではR-loop形成が律速となり、プレインキュベーションプロトコルを用いて測定すると固有切断の減衰速度が速くなることがわかった。 ここで、オフターゲットDNAを用いた場合、HNHとRuvCの切断速度はそれぞれ0.12 s-1と0.14 s-1と測定され（補足図7c、d、補足図8）、Rループ形成速度よりもはるかに遅いことがわかった。 これらの結果は、我々が測定したR-loop形成の減衰速度が0.85 s-1であったことから、オフターゲットを持つSpCas9の酵素経路における律速段階がDNA切断であることを示している（図2b）。 これらのデータは、オンターゲットとオフターゲットのDNAを比較する際に、少なくとも部分的には律速段階が変化することに基づいて識別が行われることを示している

我々は、オンまたはオフターゲットのDNAを持つHypaCas9とCas9-HF1を使ってこれらの実験を繰り返した。 この結果、HypaCas9のHNH切断速度はオンターゲット基質で0.035 s-1、オフターゲット基質で0.0023 s-1となった（補足図7g,k）。 また、Cas9-HF1のオンターゲット基質とオフターゲット基質の切断速度は、それぞれ0.038 s-1と0.00014 s-1と測定された（補足図7o,q)。 この切断速度は、DNAとMg2+を同時に添加した場合の測定値よりもやや速く、R-loop形成以外のDNA切断に先行する何らかのステップが、観察された切断速度を遅くしている可能性を示唆している。 それにもかかわらず、これらの結果は、HypaCas9とCas9-HF1がSpCas9と比較して、標的DNAの切断速度が約100分の1に減少していることを示している。 オフターゲットDNAについては、観察された切断率はHypaCas9またはCas9-HF1ではそれぞれSpCas9に比べて50倍または860倍減少している。 むしろ、R-loop形成は高速であるため、識別はDNAの放出と切断の速度の間の動力学的分割の関数である17,26,27. Rループの形成は平衡に達するが、触媒作用は阻害される15。 次に、トラップとして機能する大過剰の同一の非標識オンターゲットDNAの存在下で、Mg2+を加えて反応を開始させた。 DNAトラップの存在下と非存在下で並行して行った実験を比較することにより、結合したDNAの解離と切断の分数速度分割を推定することができる（Fig.4a）。 SpCas9がオンターゲットDNAに結合すると、それは急速に切断され、DNAトラップはほとんど影響を与えなかった(Fig. 4b)。 一方、オフターゲットDNAの33%は酵素から外れ、DNAの約67%が切断された（図4cおよび補足図9a）。 これらの結果は、SpCas9がPAM-distalのミスマッチDNAを識別して切断率を低下させ、切断されずに放出されるDNAの割合を増加させていることを示している。 しかし、その効果は小さいので、解離速度は切断よりも遅いように見える。

a DNA trap実験の概略。 b、c On-target (Gong et al. 15より) に対する SpCas9 による開裂反応。d、e HypaCas9によるオンターゲット（d）またはオフターゲット（e）DNAの切断 f、g Cas9-HF1によるオンターゲット（f）またはオフターゲット（g）DNAの切断 酵素（28 nM）と標識DNA（10 nM）をMg2+非存在下でインキュベートし、過剰の非標識DNAトラップの存在下または非存在下でMg2+を加えて反応を開始させた。 A-はトラップあり（塗りつぶし円）、A◦はトラップなし（開き円）の振幅をそれぞれ表す。 パーセンテージは、トラップがない場合の反応と比較して、切断のために前進することが約束されたあらかじめ結合したDNAの割合を示す

次に、標的DNAに結合したHypacas9とCas9-HF1の速度分割を調べた（図4d、f、補図9b、d）。 HypaCas9とCas9-HF1の結果は、トラップ存在下で標的上のDNAのそれぞれ〜75％と〜92％が切断されたことを示している。 HypaCas9（0.035秒-1）とCas9-HF1（0.038秒-1）による標的DNAの固有切断速度はSpCas9（4.3秒-1）の100倍遅いので、切断割合は野生型SpCas9より小さい。 この遅い切断速度は、オンターゲットDNAの小さな割合（8〜25％）が切断される前に解離する時間を与える。

HypaCas9とCas9-HF1がオフターゲットのDNAと反応すると切断速度がそれぞれ0.0023 s-1と 0.00014 s-1にさらに減少するので解離を好む運動分割は増強された（図4e、g、補足図9c,e). これらの速度は、オフターゲット基質上のSpCas9と比較して、それぞれ50倍から860倍遅い。 したがって、トラップDNAの存在下では、結合した標的外DNAのうち、HypaCas9とCas9-HF1による切断に進むのはそれぞれ約24％と約10％だけであった。 これらの結果を総合すると、設計された高忠実度変異体は、PAM-distal mismatched DNAに対する特異性を、切断速度の顕著な減少を通じて獲得したことがわかる。 式（3）を用いて見かけの解離速度定数を計算すると、高忠実度変異体は見かけのDNA放出速度を増加させないことが分かった（補足表1）。

むしろ、識別力の増加は、切断の見かけの速度定数の減少に完全に起因する。

Cas9酵素のキネティクスに関するこれまでの説明では、反応の観測減衰率は、通常複数の速度定数の複合関数である固有値をもたらす指数関数にデータを適合させることに基づいて推定されている17。 反応速度と機構を完全に理解するために、各酵素とDNA基質のすべての実験を、単一の統一モデルを用いた速度式の数値積分に基づいてグローバルにフィットさせた（図5および補足図10～14）。 グローバルなデータフィッティングの結果、我々の最小限のモデル（図5f、挿入図）がデータを説明し、各パラメーターがデータによってどの程度制約されるかをテストする信頼区間分析によって、それぞれの速度定数がうまく定義されていることがわかった（図6）17,28。 特に、我々のモデルは、異質性を考慮することなく、いくつかの実験で見られた二相性のトレースを説明し、R-ループ形成、HNHおよびRuvC切断イベントを含む経路の各ステップの固有の速度定数を提供していることに注目されたい。 DNA切断のための触媒残基の配列には、さらに未解決の構造再配列が必要であると思われるが、これらは動力学的に異なる事象としてまだ解決されていない。 現在のモデルは、すべての利用可能なデータを説明するのに必要かつ十分な最小の経路を表しており、経路の追加のステップを定義するために新しい情報が利用可能になると、容易に拡張することができる。

図5のデータに対する適合信頼度コンターが示されている。 番号付けされた速度定数は我々のキネティックモデルで定義されたものである（図5f、挿入図）。 χ2閾値（破線）を0.99に設定し、17,32と同様に各速度定数の上限と下限を定義した。 等高線は対称的でパラメータはよく拘束されていたため、表1では±の誤差限界を報告している。 この解析では、χ2閾値をF分布を用いて計算し、各パラメータの下限と上限を定義するのに用いた。

酵素特異性を理解するには、自由エネルギープロファイルに示されるように、すべての運動学的関連ステップとの関連で速度定数を解釈しなければならない（式を使って計算）。 (2275>

透過係数A = 0.001

グローバルデータフィットは、各関連ステップの速度定数を提供するので（図5および6）、真の自由エネルギープロファイル（図7b、補足図10〜14）を構築することができる。） SpCas9、HypaCas9、Cas9-HF1を比較した自由エネルギープロファイルでは、律速段階と特異性決定段階が変化していることがわかる。 酵素の特異性はkcat/Kmで定義され、出発状態に対して最も高い全体障壁によって与えられる。一方、最大速度kcatは、先行する状態に対して最も高い局所障壁によって定義され、先行する急速平衡ステップによって減衰される。 Rループ形成の速度定数は、異なる基質や酵素変異体で大きく変化しないため、特異性は、我々のキネティックモデル（図5f、挿入図）におけるCas9 Rループ（EDH状態）が、不可逆的切断をもたらす前進とDNAの再アニーリングと酵素からの排出による放出のどちらかに速度分割によって大きく支配されている。 高忠実度変異体では、切断の全体的な障壁が高いため、DNA の解離を促進するような速度論的分割確率が高くなります (図 6c)。 7：特異性はCas9の動力学的分割によって支配される。