Simple unbalanced translocations and inversions (class A and C): mechanisms of origin

この研究のストレートな結果は、de novo unbalanced translocation 37件のうち20件で重複が母親由来である（図1、オンラインリソース1：表S2）ことであった。 6 例（7、14、23、24、33、35）では、母方の起源を調べることができなかったので、重複領域が母方起源である de novo 不均衡転座は、十分に情報が得られる症例の 64.5%（20/31） を占めています。 これらのデータと、これらのケースのうち8例（ケース1、2、9、11、15、19、28、32）において3つの対立遺伝子があるという所見（Fig. 1, Online Resource 1: Table S2) が重複領域の少なくとも一部に存在していたこと、そして25％以上（31例中8例）において、de novo 不均衡転座の発生の主因は母方の減数分裂非分裂であり、その後、母方の染色体過剰の部分トリソミーが救出されるというシナリオが浮上しています（図1a)。 重複領域内に母方2本、父方1本の計3本の対立遺伝子が存在することの最も有力な説明は、母方減数第一分裂（mat-MI）での非分裂であろう（図1A.I）。 あるいは、転座切断点に近接した、あるいは転座切断点での減数分裂組み換えが、母方減数分裂II（mat-MII）での非分裂に先行していたに違いない。 一方、同じ母方重複ハプロタイプを持つ12例（4-6、10、12、13、17、22、26、30、34、37）では、他のメカニズムを排除できない（図1B）が、それらは、いくつかの非接合染色体に示されるテロメア交差の優先的発生に従って、テロメア交差の後に、マットMI非分裂（図1A・I）から生じる可能性もある(Oliver et al. 2014）、またはトリソミー救済の多くの事例（Chantot-Bastaraudら2017に総説あり）で報告されているように、母性MII（mat-MII）不接合（図1A.II）。

超数字染色体のアナフェースの遅れと、その小核内のトラップは、多くのクロモスリープシスイベントの基礎になることはよく知られている（Zhangら2015; Lyら2017; Zhuら2018）。 その結果、一方の娘細胞では、余剰染色体は除去されるが、他方の娘細胞では、小核のゲノム物質が粉砕され、その後、全部または一部の断片が主核の内部に再封入されることにより、元の染色体は、新しい順序に再編成されているもののその物質の大部分を維持するか、一部の部分を失って、大規模な再編成となる（図1参照）。 図1a）。どの部分が失われ、どの部分が保存されるかは、確率的な事象、切断端が互いに、あるいはゲノムの他の部分と統合しやすいか、あるいは、最小限の断片の不均衡の存在下で生存・増殖できる細胞がその後選択されるかどうかにかかっていると思われます。 理論的には、セントリックフラグメントは、環状染色体を形成することによって、両端のテロメア配列の欠如を克服し、超数値的マーカー染色体として保存される可能性がある。 このような場合、新セントロメアを形成するか、あるいは、他の染色体に捕捉され、挿入転座が形成されることが必要である。 実際、加藤ら（Kato et al. 2017）は最近、トリソミック接合体に存在する上代染色体の染色体切断によって派生するde novo間質転座の事例を報告している。 最後に、テロメアを持つ染色体断片を保存するためには、テロメアの捕獲、例えばVetroら（2012）の報告（ケース2、3）のように転座したマーカー染色体か、あるいはここに述べたように、遠位部を失った他の染色体（レシピエント染色体）に捕獲されて、46染色体のアンバランスde novo転座の細胞を形成するかのどちらかが必要である。 実際、同じ母方のハプロタイプが重複したケース6（図1、オンラインリソース1：表S2）では、クロモトリプシス現象（図1a）が起こっており、約1.3 Mb離れた2つの連続しない重複領域が存在し、そのうち間質が逆方向であることを示しています（オンラインリソース2：図S15）。 染色体切断事象はde novoアンバランス転座の多くの症例で観察されており（Weckselblatt et al. 2015）、その多くは父系由来で2本以上の染色体を含むと報告されている（Marcozzi et al. 2018）。 一方、本症例6のアンバランス転座は母方由来であり、親のメタフェースのFISH調査とも一致し、まさにde novoであった。 さらに、少なくとも高解像度（1M）のaCGHとFISH調査によって判断すると、それはわずか2本の染色体に関わっており、より複雑な再配列は除外された。 したがって、接合子または初期胚は、減数分裂または接合後の母方の非分裂のために、8番染色体がトリソミーであったと推測することは魅力的である。 8番染色体が破壊された後、テロメア部分を含む2本の非連続部分が復元され、それが18qに受け継がれたのです（図1a）。 しかし、9番染色体のトリソミックの細胞株が残存し、正常核型の細胞株と不均衡なt(14;9)転座を持つ第3の細胞株が存在することから、トリソミックの接合体から、超過数の染色体を完全に失った細胞株、染色体の一部（9p）を失ってその残存部分（9q全体）を他の染色体が取り込んだものなど、さまざまな細胞株が形成され得ることが示唆されます。 このような3細胞株モザイクはほとんど記録されていないが（Phillips et al. 1997）、出生前診断では、1つの正常細胞株とde novoアンバランス転座を有する2番目の細胞株によるモザイクは比較的多く、そのほとんどで母体年齢の上昇が検出できる（Kovaleva and Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018）。

母体の非分裂がde novoアンバランス転座の主なトリガーであるという仮説に対する独立したサポートは、母体年齢の上昇である。 実際、重複が間違いなく母親の減数分裂非分裂（重複領域内に2つの異なる母親の対立遺伝子）に関連していた我々の8例（例1、2、9、11、15、19、28、32）において、2016年のイタリアにおける母親の平均年齢が31.8歳（ISTAT、https://www.istat.it/）であることを考慮し、母親の平均年齢の上昇が記録されていた（34.75年、オンラインリソース1：表S1）。 同じ母性アレルの重複を有する12例（4、5、6、10、12、13、17、22、26、30、34、37）でも増加（33.5歳）が認められ、開始事象としての母性非分裂に適合した。 父方重複の症例でも、平均母体年齢（32.6歳）の上昇が見られたが、これは母方不分離以外のメカニズムがこれらのアンバランス転座の形成に関与している可能性を示していると思われる。 実際、SNPアレイで解析した4例（3、8、29、36）では、相同染色体の非複製部分に母方の異所性染色体は認められなかった（オンライン資料1：表S2）。これは、父方の超過分染色体がテロメア部分のみを救出するクロモスリープを起こしたトリソミック接合体に予想されることであった。 このように、父方減数分裂におけるミスセグメンテーションに起因するトリソミーの頻度がごくわずかであること（Nagaoka et al. むしろ、テロメア捕捉による修復が必要な遺伝的または接合後の父方の二本鎖切断など、他のメカニズムの方がより妥当であると思われる（図1b）。 実際、血液と線維芽細胞の2つの細胞株にモザイクがあり、末端2q欠失と父親由来の派生染色体der(2)t(2q;14q)を持つケース25（オンラインリソース2：図S9）はこの仮説に合致する。 このように、末端欠失がある場合、初期胚の異なる細胞で異なる時期に異なる修復機構が起こり、最終的にモザイク状態になる可能性があるのです。 このモデルでは、欠失した染色体が転座を開始し、レシピエントとして働き、複製された染色体がドナーとして傷害修復を行うことになります（図1b）。 しかし、欠失型染色体が転座に至る最初の事象なのか、それとも二動原体染色体（図1BIII、IV）の形成に伴う二次的な事象なのかは判別できません。二動原体染色体は非対称的に切断され、その結果、del染色体と単に欠失した染色体が生じ、後者はテロメア捕捉により修復されます（図1B）。

驚くべきことに、どのようなメカニズムであれ、欠失と重複が両親由来であることが半数の症例で予想されるにもかかわらず、両方の不均衡が同じ親由来である症例が高い頻度で検出された（図1、オンラインリソース1：表S2）。 8細胞期までのマウス胚における親染色体の2セットの明確な区画化の実証（Duら2017）は、説明を提供する可能性がある。 この時期は非常に高い染色体不安定性と一致するため（McCoy et al. 2017）、初期の構造異常の安定化に必要なテロメア捕捉などのメカニズムが、元の異常の同じ親染色体セットで発生すると推測したくなる。 これに対して、さらに後の再調整は、両方の親に由来する染色体を巻き込んでランダムに起こることが予想され、その結果、実際に5例（10、12、27、30、31例；図1、オンライン資料1：表S2）で見つかったように、両親由来のアンバランス転座染色体になると思われます。

クラスCの転座については、染色体の反対側でテロメアを捕捉することによって安定化するのか、他の染色体に依存する場合と異なるメカニズムによるのか、接合部切断点の特異性を見出すことはできなかった。 しかし、この解析は2つのケースに限って行うことができた。 5例中4例で欠失と重複の両方が父親由来であることから、もともとの欠失か二動原体染色体の切断のどちらかに由来するものと思われる。

複雑な転座・逆位（クラスBとD）

これらの転座は、中間二分体の非対称な切断により、inv-dup delと単なる欠失染色体（図1B・III）が生じるというのが一般的な見解である。 テロメラーゼを介したde novo TTAGGG配列の付加、他の染色体の遠位部分のテロメア捕捉（Yu and Graf 2010）、同じ染色体の反対部分の捕捉（Buysse et al.2009; Fan and Siu et al.2001) 、あるいはリング染色体の形成 (Rossi et al.2008) などが考えられている。 我々が遺伝子型を決定できた2つの転座inv-dup del(8p)症例（症例42と44）は、予想通り（Giglio et al. 2001）、8p重複領域に母方と父方の対立遺伝子が2つ存在することから、mat-MIにおけるNAHRによって生じた（オンラインリソース1：Table S2）。 この再発する異常な組換えは、正常な8番染色体と逆位染色体の中の8p23に位置する非常に同一の区分的重複によって仲介される（Giglioら、2001年）。 接合体において、得られた二動原体染色体は、異なる細胞で異なる切断を受ける可能性があり、時には、del(8p)の細胞株とinv-dup del(8p)を持つ第2の細胞株とのモザイク状態（Hand et al.2010）や、例外的にinv-dup del(8p)が他の染色体の末端領域と結合する第3の細胞株にさえ至ることがある（Pramparo 2004）。 これらのモザイクは出生前診断でより頻繁に検出されるが、出生後の生活では、転座したかどうかにかかわらず、inv-dup del(8p)を持つ単一の細胞株が、少なくとも血液中で最も頻繁に発見されている。 我々の転座した3例（42、43、44）では、テロメアはそれぞれ6q、17p、Xqから提供されたが、いずれも母体由来で、母体染色体6、17、Xの重複ハプロタイプが同じであり、妊娠後に起こった安定化イベントとして予想されるものであった。 残りの3例（39、40、45）では、8pに関与しないinv-dup del再配列と同様に、転座したinv-dupは父方由来で、重複領域には同一の父方対立遺伝子があった。一方、2例（39と49、オンラインリソース2）では父方由来の染色体でテロメア捕捉が行われた。 3例目（45例）は転座した染色体t(inv-dup5p;3q)が転座しないinv-dup del(5p)を含む細胞株とモザイク状態にあった胎児である（オンラインリソース2：図S12）。 注目すべきは、この2つの細胞株で5p重複のサイズが異なることである（Online Resource 1: Table S1）。これは、接合体または極初期胚に存在すると思われるオリジナルの二動原体染色体（図1）を実際に示している。

8pが関与しないinv-dup del再配列のすべてで同一重複対立遺伝子が善意で報告されており，これらの再配列の染色体内起源を示している（Hermetz et al.2014）． したがって、これらのinv-dup転座型再配列は、おそらく初期胚における最初の有糸分裂イベントの最終結果であると考えられる（Voet 2011）。例えば、逆相同配列の比較的近い部位で二本鎖切断が起こり、その後鎖内対合が起こり、正常コピー領域を挟んだ二動染色体が生成された（Hermetzら2014；Roweら2009）。 すでに述べたように、inv-dup delの逆変異、すなわち欠失した染色体は、非相同染色体の遠位部や同じ染色体の反対側の腕が取り込まれることによって修復され安定化し、それぞれ単純な不均衡転座や逆位を生じることがあります（図A、Cに示したいくつかの転位について提案したとおり）。 しかし、4例（4, 10, 28, 51）では、複雑な構造のため、正確な塩基配列の決定が困難であった。 代替的非相同末端接合（alt-NHEJ）またはマイクロホモロジー媒介破断誘発複製（MMBIR）の特徴として、マイクロホモロジーやテンプレート化または非テンプレート化小挿入が16例（例3、5、6、7、8、9、12、18、22、27、30、39、40、44、50、52）検出された（オンラインリソース2：図S1）。 驚くべきことに、ケース18と40では、再配列はAlu配列内で起こったが、それぞれ5bpの短いテンプレート挿入と4bpのマイクロホモロジーが存在し、再配列はNAHRを介したメカニズムではなく、alt-NHEJまたはMMBIRを達成したことが示された。 正準NHEJ（c-NHEJ、blunt ends junctions）は4例（26、29、31、43）で発生した。 2例と38例では、相同レトロトランスポゾンの端に切断点があった（Online Resource 2: Figure S13）。 このことは、これらの配列によって、テロメア捕捉などの修復機構が容易になるケースは少数派であることを示唆している。 Robberechtらは、de novoアンバランス転座のほとんどがLINE、HERVs、またはセグメント重複間のNAHRによって媒介されていることを発見したが（Robberecht et al. この場合，2つの重複した母方ハプロタイプが存在し，一方がレシピエント染色体に転座したことから，明らかにmat-MI非分裂が示唆され（図1，オンラインリソース1：表S2），この転座を減数分裂の事象とすることは不可能であった。 実際、LINE-1を介したレトロトランスポジションイベントは、ヒト初期胚の体細胞、ヒト胚幹細胞、および少なくともマウスでは主に胚発生で起こることが示されており（レビューについてはKazazian and Moran 2017）、我々の事例では転座の形成が接合後のイベントでもあることを裏付けている。

これらの特徴を合わせると、ドナー染色体とレシピエント染色体、あるいは同じ染色体の反対側の部分との接合には、修復に基づく機構（c-NHEJとalt-NHEJ）および複製修復機構（MMBIR）が関与していることがわかる（図1）。

遺伝子型と表現型の関係

我々の研究で報告されたような大きなアンバランス再配列における遺伝子型と表現型の相関は一般に粗いのだが、我々の報告はこの文脈でもいくつかの詳細を追加するものである。

いくつかの不均衡転座は、染色体異常が発生した接合体に由来するという強い証拠から、重複領域は、一見すると染色体異常の遠位領域のみで構成されているが、我々の事例6やWeckselblattら（2015）が示したように、他の部分からの断片を含む可能性があることが示唆された。 これらの場合、砕けた断片の大きさがアレイCGHで検出可能な大きさ以下であれば、異常表現型を重複または欠失したように見える遺伝子のみに帰するリスクがあるが、さらなる罹患はTAD破壊によって生じた遺伝子発現異常によるものかもしれない（Fukami et al.2017 ）。

さらに、部分トリソミー救済に由来するアンバランス転座では、父方由来の上乗せ染色体上でクロモトリプシスが生じる場合、残りの2本の染色体について続く母方のヘテロ／アイソディソミーがさらなる病原性を生み出す可能性がある（Niida et al. 2018）ヘテロ接合状態で母親に存在する疾患原因バリアントをホモ接合状態に還元することによって、あるいは父方の対立遺伝子のみによって発現するインプリント遺伝子の存在によって、さらなる病原性を生み出す可能性がある。

最後の考察として、壊れた染色体を安定化させるためにどのテロメアを捕獲するかの選択は、ランダムではなく、元のTAD（Topologically Associated Domains）の規制緩和の影響を受け、その結果、特定の染色体間接触や空間的3Dクロマチン区画化にとって好ましい基質を作り出すのではないかと推測したくなる (Dekker and Mirny et al. 2016)．