Abstract

Melioidosis and glanders are caused by close related species Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei respectively. メリオイデス症は東南アジアで罹患率の高い疾患であるが，鼻疽は極めてまれな疾患である。 両抗菌薬に感受性のあるB. pseudomallei株およびB. mallei株に対して，ciprofloxacinとdoxycyclineの効果をin vitroで評価した。 Porton系外来種マウスおよびシリアンハムスターにdoxycyclineまたはciprofloxacin 40 mg/kgを1日2回sc注射し，次の3つのレジメンのいずれかを行った：チャレンジ48時間前からチャレンジ後5日間投与，チャレンジ直後から5日間投与，チャレンジ後24時間から5日間投与。 マウスはB. pseudomallei 4845で、ハムスターはB. mallei 23344で、それぞれipでチャレンジした。 抗菌効果は，MLD（median lethal dose：致死量中央値）の変化で判定した。 Ciprofloxacinの予防投与および即時投与により，B. pseudomalleiのMLDは未投与時の19 cfuから4 × 106 cfuに上昇したが，Ciprofloxacinの治療投与により180 cfuに上昇したのみであった． ドキシサイクリンの結果も同様であった。 B. mallei 23344のMLDは，シプロフロキサシンの予防投与により，未投与群の4 cfuから4.6 × 105 cfuに増加した． 即時投与ではMLDが7.0×104cfuに上昇し，治療ではMLDが1.6×103cfuに上昇した． ドキシサイクリンのすべてのレジメンは，2×107cfuまでのチャレンジに対してハムスターを保護した． B. pseudomalleiの感受性株を用いたが，いずれの抗菌薬も治療には有効でなかった． しかし，いずれの抗菌薬も適時に投与することにより，症状発現を抑制することができた． 実験的鼻疽に対しては、ドキシサイクリンが2つの抗菌薬の中で優れていたが、治療した動物では、チャレンジから約4～5週間後に再発した。 メリオイダス症が東南アジア、オーストラリア北部、インド亜大陸で死亡や罹患の重要な原因となっているのに対し、鼻疽は極めてまれで、一般に中東、アジア、南米の一部の地域で馬の病気に限られています1、2

そのため、B. pseudomalleiの抗菌薬感受性は精査されており3～5 メリオイダス症の抗菌療法は十分に確立されています5、6。 フルオロキノロン系抗菌薬は、いくつかのB. pseudomallei株に対する試験管内MICが高く、血清中で達成可能なレベルを超えているため、一般にメリオダイズ症の治療には使用できないことになっています4,5。 シプロフロキサシンは、B. pseudomalleiが存在する貪食細胞に浸透し、細胞外濃度の4～12倍の濃度を達成することができるため、この禁忌にもかかわらず、メリオダイズ症の治療に単独または併用で使用されている7,8。 さらに、短時間ではあるが、静脈内投与により9mg/Lの血清濃度を達成することができる11。 第二に、フルオロキノロン系抗菌薬は、特に現在免疫予防の手段がないため、メリオダイン症に感染した、またはその危険性が高いことがわかっている個人に対する即時治療または予防として有用であると考えられる。

今世紀後半に鼻疽菌の発生が少なかったため、B. malleiの抗菌剤感受性、特に最新の抗菌剤に対する知識が乏しく、最近の微生物学の文献では、主にロシアからの文献が数件あるのみである12。-18 同様に、最新の抗菌薬の生体内における有効性についても十分な知見が得られていない。 さらに、 B. pseudomallei と B. mallei は、 その抗原性、 生化学、 そして病原性（特に細胞内生存率）に関しても非常によく似ています20。 メリオイダス症に対するシプロフロキサシンの使用を促進する議論は、したがって、鼻疽にも当てはまるが、同時に、臨床試験におけるその低い成績も考慮されるべきである。

ドキシサイクリンは、局所メリオイダスの治療に単独で、全身性疾患には他の抗菌剤5との併用で使用されているので、メリオイダス症の予防または即時治療として何らかの有用性がある可能性もあります。 さらに、シプロフロキサシンと同様に細胞内に浸透し、様々な細胞内病原体に対して有効である21。以前の実験で、ドキシサイクリンはB. malleiに対して良好なin vitro活性を示した19。

マウスモデルでの実験的メリオイデス症、ハムスターモデルでの実験的鼻疽菌に対して、シプロフロキサシンとドキシサイクリンの予防と即時治療の有効性を測定した。

材料と方法

挑戦株、保管と培養

両菌は危険病原体諮問委員会（ACDP）によりカテゴリー3の病原体に分類されているため、すべての細菌学的手順はBS5726に準拠したクラス3安全キャビネットで実施された。

抗菌薬の調製

in vitro実験のために、doxycycline (Sigma, Poole, UK) とciprofloxacin (Bayer, Newbury, UK) 粉体を除イオン水に溶解して10 mg/Lのストック溶液とした。 投与液は、ドキシサイクリン粉末をリン酸緩衝生理食塩水に、シプロキシン錠剤（バイエル）を脱イオン水に溶解し、ろ過滅菌して毎日新鮮な溶液を調製した。

In vitro抗菌性試験

Mueller-Hinton broth (Oxoid, Basingstoke, UK) に5〜6個の「プロテクト」ビーズを入れて細菌を回収し、37℃で24時間、B. pseudomalleiは48時間静置培養をした。 NCCLSガイドラインに準拠したマイクロタイタープレート希釈法を用いた22。簡単に言えば、0.063 mg/L から 64 mg/L までの各抗菌薬を希釈した96ウェルのマイクロタイタープレートをあらかじめ用意し、-20℃で保存した。 Mueller-Hinton brothで一晩または48時間培養したものを100 μLで約5×105 cfu/mL（McFarland standard 5を用いて決定）の接種液を作り、すべてのウェルに添加した。 B. malleiは生育が遅いため，MICを測定する前に36時間インキュベートする必要があった。

Escherichia coli ATCC 25922およびStaphylococcus aureus ATCC 29213（NCIMB, Aberdeen, UK）を品質管理標準として使用した。

動物モデル

すべての動物試験は、Scientific Procedures Act (Animals) 1986およびCodes of Practice for the Housing and Care of Animals used in Scientific Procedures, 1989に従って行われた。

実験的メリオイド症および腺病にはそれぞれPorton outbredマウス（社内飼育）およびシリアハムスターレイクビュー系統（チャールズリバー、マーゲート、英国）が使用された。 マウスは5匹1組のケージで、ハムスターはBS5726に準拠した硬質壁ハーフスーツアイソレータ内で2匹1組で飼育した。 12時間の明暗サイクルを与え、餌と水を自由に摂取できるようにした。 マウス、ハムスターともに市販のげっ歯類用飼料を与え、ハムスターにはさらに週1回ヒマワリの種子を与えた。

これまでの研究では、ハーフスーツに装着したニトリルゴム手袋が飼育中や処置中のマウスに誤って噛まれない十分な保護になっている。 シリアンハムスターのレイクビュー系統はおとなしいことで知られているが、感染したハムスターを取り扱う際の予防措置として、ニトリルゴム手袋の上に工業用耐穿刺ケブラー手袋を着用した。

抗菌薬の投与

両抗菌薬を40mg/kg体重で、12時間間隔で毎日2回、マウスでは0.1mLでsc注入し、0.2 mLをハムスターでは3つのレジメンのうちの1つに従って投与した：抗菌剤をチャレンジの48時間前に開始しチャレンジ後5日間継続する予防療法、抗菌剤をチャレンジ直後に投与し5日間継続する即時または抑制療法、チャレンジ後24時間から抗菌剤の5日間コースからなる治療療法であった。

B.pseudomalleiでチャレンジしたマウスの2つのさらなる群に、抗生物質をチャレンジ後10日間継続したことを除いて、記載されたような予防レジメンを与えた。

動物へのチャレンジと病原性の推定

各病原体の病原性は、Reed & Muenchの方法に従って計算した動物の小さな集団（25〜30）の50％を殺すために必要な用量として定義される中央値致死量（MLD）を測定することによって決定した23。 B. pseudomalleiとB. malleiのチャレンジ培養は、適切な「プロテクト」ビーズを栄養ブロスに回収し、それぞれ24時間と48時間インキュベートすることによって調製された。

マウスは5匹のグループで、B. pseudomallei懸濁液の連続希釈液0.1 mLをip注射でチャレンジし、チャレンジ後35日間観察した。 ハムスターは4匹1組で，B. mallei懸濁液の連続希釈液0.2 mLをip注射でチャレンジさせ，チャレンジ後23日間観察した。 ドキシサイクリンによる即時投与を受けた8匹のハムスターとドキシサイクリン24時間投与を受けた8匹のハムスターは、さらなる研究のためにチャレンジ後5週間飼育された。 両モデルとも、予防投与群は抗菌薬投与のほぼ中間にチャレンジした。

各感染症の徴候および症状が特徴付けられたら、可能な限り人道的エンドポイントを観察した。 解剖はアイソレーターの中で行われた。 臓器は二等分して栄養寒天培地に塗抹し，B. pseudomalleiとB. malleiはそれぞれ37℃で24時間または48時間培養した． コロニーを200μLの脱イオン水中に採取し，5分間煮沸した． B. pseudomalleiとB. malleiの16S rRNAをコードする遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、DNAを増幅した。 PCR増幅は、18μLの次のミックスを加えることによって行った：1×PCR緩衝液（Boehringer-Mannheim、Mannheim、Germany）；0.mM PCRヌクレオチドミックス（ベーリンガー・マンハイム）、180ngの3′および5′オリゴヌクレオチドプライマー、5％（v／v）ジメチルスルホキシド（DMSO）および0.5U Taqポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）、2μLのコロニー懸濁液に添加した。 増幅は、パーキンエルマー社製のサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Cetus, Warrington, UK）を用いて、以下の条件で行った。 95℃、30秒、50℃、1分、72℃、1分を30サイクル行い、その後72℃で10分間の伸長時間を置いた。 PCR産物はアガロースゲル電気泳動で分析し、2% TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) ゲル上でエチジウムブロマイド染色により産物バンドを可視化した。

結果

In vitro 感受性

B. pseudomallei 4845 と B. mallei 23344 はともに in vitro で ciprofloxacin と doxycycline に対して感受性または中程度の感受性を示し、 B. pseudomallei では 2.で阻害された。0 mg/L ciprofloxacinと1.0 mg/L doxycyclineで阻害され，B. malleiは1.0 mg/L ciprofloxacinと0.25 mg/L doxycyclineで阻害された。

In vivoにおけるB. pseudomallei

対照マウスに0.3 cfuから2.9 × 103 cfuまでの一連の対数希釈B. pseudomalleiを腹腔内にチャレンジさせたところ、播種して急速に致命的な感染症を引き起こした。 動物はチャレンジ後24-48時間以内に発病し、毛羽立ちなどの非特異的な症状を示し、高濃度のB. pseudomalleiを投与された動物はチャレンジ後96時間以内に死亡した。 剖検では、肝臓、脾臓、肺および血液から細菌が分離されたが、肉眼的変化はほとんど認められなかった。 脾臓の腫大と肝腫大が見られた。 脾臓と膵臓に多数の小さな膿瘍ができ、肝臓にできることは少なかった。 MLDはチャレンジ後7日間で111cfuまで低下し、3週間かけてさらに低下し、最終的に20cfuとなった（図1、2）。

処理したマウスに180 cfuから1.8 × 107 cfuまでの一連の対数希釈のB. pseudomalleiを投与したところ、B. pseudomalleiは減少し、臓器は消失した。 その結果，2つの抗菌薬の効果にはほとんど差がなかった。 予防的投与または即時投与により，抗菌薬投与中に1×107 cfuの細菌を阻止することができた。 5週間の間に数匹の動物が再発したが、最も劇的だったのはドキシサイクリンの予防投与群で、チャレンジ後11日から21日の間に発生した。 しかし、実験終了時には、MLDは対照群よりかなり高く、1.4 × 106 cfuから4.6 × 106 cfuの間で変動した（図1および図2）。 生存者の剖検では、コントロールで観察された程度ではないものの、少数の動物で脾臓腫大が認められ、いくつかのケースでは膿瘍が存在した。

いずれの抗菌薬の治療的使用も感染の経過を遅らせるが，5週間にわたる最終MLDはシプロフロキサシンで180cfu，ドキシサイクリンで640cfuと，最低限の防御効果をもたらした（図1，2）．

B. malleiのin vivo感受性

B. malleiを0.3 cfuから2.9 × 107 cfuまでの一連の対数希釈でハムスターに腹腔内接種した。 この感染症は，特徴的な症状によって非常に速い経過をたどった． 24時間から48時間の間に、動物たちは落ち着きを取り戻し、活動も少なくなった。 病気の最初の兆候は、目から水っぽい分泌物が出ることで、それが膿性に変化した。 その後、四肢の腫脹や胸膜からの触知可能なクレピタスなどの徴候が見られた。 感染後7日以内にすべての死亡/致死的エンドポイントが発生した（図3）。

予防的シプロフロキサシンおよび即時シプロフロキサシン治療により、18日間最大2.9 × 107 cfuのチャレンジに対して動物を保護した後、実験終了時にMLDがそれぞれ4.6 × 105 cfuおよび7 × 104 cfuに低下し、突然再発した（Figure 3）。 死亡例の剖検では、1〜2個の大きな膿瘍を含む脾臓の肥大が認められた。

シプロフロキサシンによる治療を開始したところ、最高難度の8匹が発病の徴候を呈した。 2匹は治療にもかかわらず悪化し，3匹はそれ以上悪化せず安定していたが顕著な改善はなく，3匹は改善した。 初期の2例を除いて、動物は最大2.9×107cfuのチャレンジで11日間生き延びた。 再発は、症候性疾患を呈した動物において、当初11日から18日の間に発生した。 低チャレンジ群の再発は18日から実験終了まで起こり、チャレンジ後23日の最終MLDは1.6 × 103 cfuであった（図3）。

ドキシサイクリンのすべてのレジメンは、治療群の8匹の症状のあるハムスターの改善を含め、23日間の実験期間中に再発が観察されず、最大2.9 × 107 cfuのチャレンジからハムスターを保護した。

しかし、再発は飼育された動物で起こり、即時治療を受けた8匹のハムスターのうち4匹と、チャレンジから28-31日後に治療レジメンを受けた動物のうち1匹が病気を再発させた。

Discussion

B. pseudomalleiとB. malleiを腹腔内に投与すると、それぞれの動物モデルで急速に侵入して致死性の感染を起こし、人間のメリオダイズ症や鼻疽で起こるのと同様の劇症型全身感染を再現する。 しかし、メリオイデス症や鼻疽菌は、慢性膿瘍性感染や症状が出るまでに数年かかる静止感染など、他の臨床症状を示すことがある2,24,25。 実験的メリオダイズ症では、皮下投与やC57B6近交系、Swiss-Webster近交系などの異なるマウス系統を使用することにより、一部の動物で慢性膿瘍性感染を引き起こすことができる（未発表データ）。 Balb/C、C57B6およびSwiss-WebsterのアウトブリードマウスにおけるB. mallei感染は、慢性非致死性疾患およびPortonアウトブリードマウスにおける高いMLDを伴う慢性致死性疾患を引き起こす（未発表データ）。 これらの実験では、急性モデルが興味深く、間違いなく「より悪い場合」の感染を表しており、シプロフロキサシンまたはドキシサイクリンによって予防されれば、慢性疾患の確立も抑制される可能性がある。 さらに、メリオイデス症の多くの症例は急性疾患を呈するが、感染が最近のものか、長期間にわたって不顕性感染を保持していた患者の急性「危機」であるのかは不明である。

動物モデルにおける疾患の興味深い特徴は、膿瘍部位としての膵臓の関与で、特にハムスターモデルで顕著だった。 B. pseudomalleiとB. cepaciaはともにインスリンと結合することが報告されており26、これはインスリン受容体に結合する能力を示していると思われ、膵臓の病変を説明するものと思われる。 さらに、糖尿病はヒトの疾患における一般的な素因であるが、慢性疾患の場合、B. pseudomalleiが糖尿病を引き起こすのか、それとも糖尿病が基礎疾患となって症状が現れるのかは明らかでない。 しかし、ヒトのメリオイデス症における膵臓疾患はまれであり5、腺病における意義は不明である。

シプロフロキサシンおよびドキシサイクリンは、ヒトのメリオイデス症の治療において、単独または併用で他の抗菌薬より劣り、高い再発率と関連すると報告されている7,8。 実験株が各抗菌薬に感受性または中等度感受性であり，抗菌薬の血清および組織レベルがin vitro MICを超える場合でも，これらの試験で治療群に認められた結果は，臨床所見を反映するものであった． B. pseudomallei 4845に対するciprofloxacinのMICは，当研究所で実施した広範な試験において，試験したB. pseudomalleiの50％の菌株の典型例であったが19，他の試験と比較すると低い値であった3，4． シプロフロキサシンまたはドキシサイクリンの予防的投与および曝露直後の使用は、良好な防御効果を示したが、臨床例において予防的投与または即時治療を行う機会は、実験室の事故や流行地での外傷後の予防的即時治療などの状況に限られるであろう。 この実験では、「機会の窓」、すなわち病原体に暴露されてから抗菌薬で感染を防ぐことができるまでの時間は、挑戦後24時間以内であることが示された。

予防的治療と即時治療群ではいくつかの再発があったが、これはいくつかの要因によるものと思われ、主に抗菌薬の投与期間が短かったことであるが、臨床的には予防的治療が行われればレジメンが延長されるであろう。 また、各抗菌薬のin vitro MICに対する薬物動態の比較や、抗菌薬が到達しにくい細胞内の特権的な部位に細菌が生息する能力も重要であると考えられる。 B. pseudomalleiの駆除に関して，doxycyclineの薬物動態はciprofloxacinと比較して優れていた。 ドキシサイクリンの血清中濃度のピークは3.7 mg/Lであり，投与後24時間は血清中濃度がMICを上回った。 ciprofloxacinの血清中ピーク濃度は2.9 mg/Lで，MICを超えたのは投与後1時間のみ，脾臓のピーク濃度は10.3 mg/kgで3時間2 mg/kgを超えた（未発表データ）。 良好な薬物動態にもかかわらず，抗菌薬を10日間投与した群も含め，すべての群の生存動物からB. pseudomalleiが回収された。 ハムスターにおける2種類の抗菌薬の薬物動態の類似性が，B. malleiに対するdoxycyclineとciprofloxacinの効力の違いを説明した． 使用した菌株は両抗菌薬に感受性があり，ciprofloxacinのMICは試験菌株の50％に相当したが，doxycyclineのMICは最も低い値の1つであった。 ciprofloxacinの血清中濃度のピークは2.3 mg/Lであり，MICを超えた時間は1時間であった。脾臓中濃度は最大20 mg/kgに達し，少なくとも12時間1 mg/kgを超えた。 鼻疽は非常に稀な疾患であるため、B. mallei の病原メカニズムおよび病原因子は B. pseudomallei のものと同程度には精査されていない。 しかし、この2つの菌の類似点は、再発の原因となる細胞内への侵入と生存に及ぶと思われる。 これらの類似性を考えると、メリオイデス症の治療における臨床経験は、腺病に対する抗菌レジメンの可能性に対する警告として役立つ。特に、好ましい薬物動態と明らかな感受性にもかかわらず、再発感染が起こる可能性がある。

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