基本的に、細胞培養は、細胞が成長し増殖するために必要な栄養素、理想的な温度、ガス、pHと湿度で構成されている人工環境（インビトロ）で細胞のdistributionが関与しています。

• In vivo – 生体内の生きた生物体を対象とする研究。

• In vitro – 自然の生物環境から隔離された生物体（細胞、組織など）を使用して研究を行う場合。 例：肝臓や腎臓から分離した組織や細胞。

組織の断片を適切な培養に入れて細胞を作り、それを培養（説明培養）に使用できるのに対し、組織（軟組織）から細胞を得るには酵素を使った反応を使用します。 トリプシンやプロナームなどの酵素を用いて組織を分解し、目的の細胞を取り出す。

酵素的あるいは機械的な手法により、生物・動物組織（あるいは植物組織）から直接細胞を得た場合、そのような細胞は初代細胞と呼ばれる。

これらの細胞は、長期間継代されているため、遺伝子型および表現型が均質（類似）になっている。

Morphology

培養細胞はその外観から、主に3つのグループに分類されます：

• Fibroblastic – これには、細長い形状の双極性/多極性の傾向がある細胞が含まれます。

• 上皮-上皮様細胞は、規則的な寸法の多角形の形状をしている。

• リンパ芽細胞 – これらの細胞は通常球状で、基質の表面には付着しない。

* 固形プレートでは、液体培地を寒天と一緒に使用する場合に固化剤（寒天など）を使用します。

細胞培養の意義

細胞培養は、細胞の正常な生理と生化学を研究するための最良のプラットフォームであることから、細胞生物学と分子生物学の両方において重要な技術であるといえます。 細胞はすべての生物の基本的な構造的、機能的、生物学的単位です。

生物または特定の組織を理解するためには、その細胞がどのように働くかを理解することが重要です。

試験管内の細胞について学んだことは、生体や組織に起こっていることの代表となります。 このため、細胞培養はワクチン開発、スクリーニング（薬物など）、病気や症状の診断に非常に重要です。

異なる種類の細胞が増殖するために異なる環境を必要とすることから、培養に使用する培地には、無血清培地や血清含有培地など、異なる種類の培地が存在します。

一旦適切な条件が提供されれば、細胞は数を増やし、コロニーを形成し、それを簡単に見て識別することができます。

手順が何を達成しようとしているかをよく理解すれば、正しい成分で培養物を準備することが容易になります。

Primary Cell Culture

細胞培養は、細胞（動物または植物細胞）を生物から取り出し、成長に適した条件の人工環境に導入するプロセスである。

細胞培養には大きく分けて3つの種類があります。

• 初代細胞培養
• 二次細胞培養、
• セルライン

ここでは、初代細胞培養について取り上げます。

初代細胞には2つのタイプがあります。

接着細胞-定着依存性細胞とも呼ばれ、増殖のために接着を必要とするタイプの細胞です。

浮遊細胞-増殖のために接着を必要としないタイプの細胞である。

初代細胞培養では、肝臓や腎臓などの親組織（生体組織）から得られた細胞を、増殖に適した培地に導入する。 細胞が得られたら、摘出培養、懸濁培養、単層培養のいずれかを行うことができる。

細胞を培養する前に、まず解離のための酵素処理を行います。 しかし、細胞を傷つけたり殺したりしないように、最小限の時間でなければならない。

初期には、組織から得られたさまざまな種類の細胞で構成されるため、培養は不均一になりがちである。1300>

形質転換プロセスでは、初代細胞を長期間使用し、時間の経過とともに培養物を変化させることができます。 これらの細胞は連続細胞株と呼ばれる。

しかし、初代細胞は、インビボ細胞（生体組織からの細胞）に（生理的に）より似ているという事実から、連続細胞株よりも一般的に好まれる。 また、連続細胞株は、ある種の変化（表現型や遺伝子型の変化）を起こす可能性があり、その結果、解析中に矛盾が生じる。 そのため、in vivoの細胞に何が起こっているのかを判断することはできません。 このため、初代細胞が好まれます。

初代細胞は生きた組織から得られた細胞にかなり似ていることから、その機能、代謝調節、細胞生理学、発生、欠陥、目的の組織に影響を及ぼす状態を研究するために使用できるという点で、研究目的には重要な役割を担っています。

また、ワクチン製造、遺伝子工学による薬剤スクリーニング、毒性試験、出生前診断などの目的にも使用されます。

細胞培養液

細胞培養技術では、細胞（または組織）を植物または動物から取り出し、その増殖（生存と成長）を支援できる新しい人工環境に導入されます。

細胞の増殖のためのこのような環境の要件には、次のようなものがあります。

• 基質（栄養源）
• 最適な温度範囲（制御）
• 成長培地、
• 最適なpHなど

ここでは、このうち、特に、最適なpHについて説明します。 培地（細胞培養液）

培地には様々な種類（細胞の種類）がありますが、一般的には以下のもので構成されています。

• ブドウ糖
• アミノ酸
• ビタミン
• 無機塩
• 付着因子など。

培地には大きく分けて2つの種類があります：

天然培地 – 天然培地は、自然に存在する生物由来の液体で構成されています。

人工培地-合成培地とも呼ばれ、ビタミン、ガス（酸素と二酸化炭素）、タンパク質などの栄養素を加えて作られる培地を指します。 細胞が必要とする有機物や無機物を添加し、細胞の増殖に理想的な環境を提供します。

そのため、以下のようなさまざまな目的に使用することができます。

• 細胞の即時生存を可能にする
• 細胞の長期生存を可能にする
• 細胞の無期限成長を可能にする
• 特殊機能の提供

一方、培養は以下のように分類することもできる。

選択培地-これは、特定の細胞のみを増殖させる特殊な培地である。 例えば、血液寒天培地（Streptococcus & Moraxella speciesの分離に使用）は、抗生物質を加えることで選択培地となる。

Differential media- このタイプの培地は、代謝によって異なるタイプの細胞/微生物が増殖できる。 このため、合成培地は大きく4つに分類される。

これらには以下のものが含まれる：

Serum containing media – これらのタイプの培地では、血清（牛胎児血清）が栄養素や成長因子など水に難溶性のもののキャリアとして使用されています。

無血清培地 – このタイプの培地は、通常、単一細胞の培養をサポートする目的で製造されています。 この培地では、血清はいくつかの欠点があり、免疫学的結果を誤解させる可能性があるため、血清は使用しません。

化学的定義培地 – その名前が示すように、このタイプの培地は、汚染のない純粋な有機および無機成分で構成されています。 このタイプの培地の成分は、通常、細菌/酵母の遺伝子工学によって生産されています。

タンパク質フリー培地-タンパク質フリー培地は、一般的にタンパク質の任意のタイプを欠いている。 細胞の優れた増殖とタンパク質の発現を促進し、さらに発現した産物の精製を容易にするために主に使用される。

細胞培養液の主な成分には以下のようなものがある。

• 栄養素-タンパク質の構成要素であるペプチドやアミノ酸を含む
• エネルギー源となる炭水化物
• カルシウム、マグネシウムなどの必須ミネラル
• 、

  細胞培養液の主な成分には、以下のものがあります。 また、培養液を安定させるために酢酸塩などの緩衝剤を使用します。

• ビタミン類
• フェノールレッドなどのPH変化指標

細胞培養液は細胞の増殖に用いられ、細胞を識別し研究することができる。

Cell Suspension

培養法では、細胞を液体培地に懸濁させるタイプの培養法を指します。

単細胞を得るには、攪拌した液体培地に破砕したカルス（簡単にばらばらになる小さな組織）を入れる（固体培地と違って攪拌によって気体の交換ができる）。 これにより、単細胞が放出され、別の新鮮な培地に移される。

細胞懸濁培養は、細胞を均一に浴びせることができる点で、静止培養よりも大きな利点がある。 さらに、培地が攪拌される傾向があるため、培地のエアレーションが可能になり、細胞にガスを供給することができます。 また、培地が懸濁液であることから、培養の内容物を操作することも容易となる。

他の培養と同様に、浮遊細胞培養は制御された条件下で行う必要があり、細胞が増殖するための理想的な環境を提供する。

* 80%コンフルエンスとは、培養面の80%が増殖中の細胞で覆われている状態を指します。

場合によっては、浮遊細胞が培養フラスのプラスチック面に付着し、塊になっていることがあります。 このような場合、ピペットを使用してこれらの細胞を採取し、フラスコの表面に排出することで、プラスチック表面から遠ざけることができます。

赤血球懸濁液

• （左：溶血なし）赤血球懸濁液（羊赤血球0.5％、食塩水）、赤く、不透明。
• （中央：溶血なし）赤血球は60分間自然に沈降した。 上清は着色していない。
• （右：溶血）S. pyogenesのヘモリシンで37℃、30分間処理した赤血球懸濁液は、溶血により透明になった。

赤血球の詳細を見る

細胞を数える

懸濁液中の細胞の数を数えるには、染色剤を使用する方法がある。 たとえば、トリパンブルーを用いると、死んだ細胞の細胞膜には浸透するが、生きている細胞には浸透しない。

次に、細胞をカバースリップの下のヘモサイトメーター（計数室を含む）に静かに排出し、顕微鏡で観察する。

Significance

This method is largely preferred due that it allows to be suspended in a solution rather than being held in the solid media. したがって、この方法では、内容物を操作することが容易になり、それによって、クラスターが形成されるのを防ぐことができます。 また、細胞懸濁液の場合、顕微鏡で単一細胞を観察することも容易である。

この場合、細胞の構造を調べるだけでなく、死んだ細胞と生きている細胞を顕微鏡で観察し、細胞がどの程度分化したかを知ることができます。

Cell Culture Protocol

細胞培養プロトコルとは、培養手順が必要な基準で実行されることを保証するものです。 これは、細胞の汚染を防ぐためだけでなく、研究者自身がいかなる形の汚染からも保護されることを保証するものです。

さらに、作業の性質上、適切な倫理的ガイドラインに適合することが期待されます。 したがって、何よりもまず、手順全体が医療倫理と動物実験の両方のガイドラインに適合していることを確認することが重要である。

作業を開始する前に、次の手順を実行します。

• 作業場の消毒（70％エタノール使用）を確認する
• 常に新しい手袋を使用する。 もし、別の細胞培養に使用する場合は、70%エタノールで消毒し、自然乾燥させる。
• キャビネットから取り出した器具は、汚染を防ぐために消毒する。
• ピペット、ガラス瓶、プラスチックなど、手順に使用する器具はオートクレーブ滅菌する。 細胞培養、特に一次細胞培養は、未検出のウイルスが含まれる危険性に加え、汚染されやすいことを念頭におくことが重要である。 このため、すべての材料は感染の可能性があるものとして扱い、感染を避けるべきである。

  また、安全のために、細胞培養の作業は、研究者から空気が遠ざかる適切な層流フードの中で行うべきである。

  細胞培養準備のためのプロトコル

  培養する細胞に適した培地を確保するために常に容器に記載されている情報を確認し、

  一度準備したら、その培地は使わない。

  30～48時間ごとに培養を観察し、コンフルエント（細胞が培養物の表面を完全に覆うこと）かどうかを確認する。

  手順が終了し、細胞の分析が終わったら、培養物を適切に廃棄する。 このとき、細胞はすでに増殖して増えているため、十分な注意が必要です。 また、検体が汚染されている可能性も高く、適切に処理されないと研究者に感染症を引き起こす危険性が高くなります。

  廃棄

  • メス、スライドグラス、カバースリップなどの汚染除去には、121℃、15 psi（圧力）で30分以上のオートクレーブが有効である。 しかし、廃棄する場合は、ビニール袋に入れ、適切な容器に入れて焼却することが重要です。
  • 液体廃棄物の場合、化学消毒は、廃棄物を不活性化できる最良の方法のひとつです。
  • 固形廃棄物の場合は、ビニール袋に集めて焼却する。

  まとめ

  一般に細胞培養は、懸濁液であれ固定液であれ、好条件の人工環境下で細胞を増殖させるものである。

  この方法は、単に組織を細かく切り刻み、そこから流出した細胞を回収するものです。 また、一次摘出法も細胞を得るために使用することができます。

  どのような細胞でもその挙動を観察するために培養に使用することができますが、成体細胞に比べて胚組織が（初代細胞のために）好まれます。 培養の成功を高めるためには、細胞の収集と処理の両方で、細胞へのダメージを最小限に抑えることも重要である。

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