3 Amylase Inhibitors

α-Amylase (1,4-α-d-glucan-glucanohydrolase, EC3.2.1.1) はでんぷんや関連多糖のエンド型α-（1，4）グリコシド結合を加水分解するエンドグルカナーゼであり、その作用は、でんぷんの糖質分解を触媒していると考えられている。 デンプンの加水分解は、まずヒトの唾液中に存在するα-アミラーゼによって触媒され、続いて十二指腸で膵臓アミラーゼによって触媒される。 ヒト膵臓α-アミラーゼ（HPA）は、2型糖尿病の治療薬として重要な薬理学的標的である。 しかし、ヒト膵臓アミラーゼは研究用として比較的高価である。 そこで、豚膵臓α-アミラーゼ(PPA)を用いて、試験管内消化を測定しています。 PPAは496アミノ酸残基からなり、ヒトのHPAと83%の相同性を示す（Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986）。 PPAはエンド型アミラーゼで、アミロースやアミロペクチンの内部α-(1,4)グリコシド結合を非還元末端に向かって多重攻撃することにより加水分解を触媒する（Robyt & French,1970)。 ブタ膵臓α-アミラーゼの加水分解産物は主にマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースである（Yook & Robyt, 2002）。 PPAには2つの異性体PPA isozyme-I (PPA-I) とPPA-IIがあり、これらは同じ分子量であるがアミノ酸組成と等電点がわずかに異なる（Pasero et al., 1986）。

天然由来のα-アミラーゼ阻害剤にはタンパク質系のものと二次代謝産物が存在する。 前者は熱処理や酸性（胃酸）処理で変性しやすく、小腸に到達すると活性を失うため、本稿の対象外である。 ここでは、α-アミラーゼ阻害剤に関する最新の文献をまとめた。 また、阻害活性の測定方法が異なれば、IC50値も異なる可能性があるため、その測定方法も記載した。 4994>

スペイン針（Bidens bipinnata）から単離されたイソカニン（57）（図3.8）は、ヨード測定法を用いてHPAに対して中程度の阻害活性（IC50 0.447 mg/mL or 156 μM）を示した（Yang et al.、2012）。 なお、イソオカニンはカテコールユニットを2つ含むため、良好な還元剤となることが予想され、ヨウ素を還元して偽陽性を引き起こす可能性がある。

図3.8。 アミラーゼ阻害剤である化合物57〜59、5-カフェオイルキナ酸、4,5-ジカフェオイルキナ酸の化学構造

水干の葉からミリセチン-3-O-ラムノサイド（9）、ユーロペチン-3-O-ラムノサイド（10）（図3.8）を採取し、その化学構造からアミラーゼ阻害剤である化合物57、19、5、10-カフェオイルキナ酸、5-ジカフェオイルキナ酸（5）を合成した。 3.2）を単離し、DNSAアッセイを用いてα-アミラーゼ阻害活性を測定したところ、アカルボース（EC50 19μM）の10倍（EC50〜2.0μM）強い阻害活性を示した。 このような高い活性は、ポリフェノール化合物ではほとんど見られず、特にこれらの化合物が複雑な食品マトリックスに挑戦する際の阻害メカニズムや選択性について、さらなる調査が必要である。 ミリセチンは強力なラジカル捕捉剤であるため、9と10の安定性も気になるところである。 著者らは，ケルセチンのEC50（17 μM）はアカルボースのEC50（19 μM）と同程度であると報告している． 当研究室で開発した濁度測定法を用いたところ、アカルボースを参照標準としてケルセチンの膵臓α-アミラーゼに対する阻害活性は検出できなかった（Huangら、未発表の結果）。 したがって、報告されたEC50が方法依存性であるかどうかを検証し、潜在的なアーチファクトを排除する必要がある（Manaharanら、2012）。 また，Cleistocalyx operculatus もフトモモ科に属する。 Hu, Luo, Li, Joshi, and Lu (2012) は、C. operculatusの乾燥花蕾から2′4′-dihydroxy-6′methoxy-3′5′-dimethylchalcone (DMC) を単離・精製し、このDMCを使用した。 この化合物はPPAに対して非競合的な阻害機構を示した(Hu et al., 2012)。

Tiliroside (58) (Fig. 3.8) はイヌバラ Rosa canina L. 種子から分離され，IC50が280 mMでPPAを阻害し，動力学研究の結果，PNPα-dペンタグルコシドの基質に定量したKi値が84.2 μMで非競合阻害剤となった． チリロシドはアカルボースと異なり、α-グルコシダーゼに対して阻害活性を示さない。 動物モデルでは、α-アミラーゼ阻害活性が弱いためか、デンプンを2g/kg投与したマウスの食後血糖値を下げるには高用量（600mg/kg）のチリロシドが必要である。 チリロシドは、腸細胞におけるナトリウム依存性グルコーストランスポーター1およびグルコーストランスポーター2を介したグルコース取り込みの両方を阻害することにより、抗高血糖を示す可能性がある（Goto et al. デンプンの消化速度を緩和するための潜在的な薬剤として、Curcuma longaの根茎からのbisdemethoxycurcumin（59）（図3.8）は、DNSAアッセイを用いて約25μMのIC50値でHPAおよびPPA阻害活性を有しています。 キネティック研究により、見かけのKiが3.0μMでHPAの非競合的阻害剤であることが示されている(Ponnusamy et al., 2012)

一置換および二置換カフェオイルキン酸はコーヒー生豆に含まれる主要ポリフェノール化合物である。 キナ酸環に3つの二級水酸基が存在するため、コーヒー生豆から精製した一置換カフェオイルキナ酸には3つの相互変換位置異性体が存在し、ジカフェオイルキナ酸は3つ存在することが確認された。 加水分解によりp-ニトロフェノールとマルトースを生成するp-ニトロフェニルジグルコシドを用いてPPA-I (Narita & Inouye, 2011) に対するそれらの阻害活性を測定したところ、p-ニトロフェニルジグルコシドを加水分解することにより、PPA-Iの阻害活性は減少した。 その結果、阻害活性はモノカフェオイルキナ酸のカフェオイル基の位置に大きく依存することが明らかとなった。 5-カフェオイルキナ酸（通称クロロゲン酸）（図3.8）のIC50は80μMで、4-カフェオイルキナ酸（120μM）および3-カフェオイルキナ酸（230μM）と比べて高い阻害活性を持っている。 3つのジカフェオイルキナ酸異性体については、3,4-および4,5-ジカフェオイルキナ酸（図3.8）のIC50値は同じ（20 mM）であり、4,5-ジカフェオイルキナ酸は30 μMであるので阻害活性はより高く、エステルの位置にはあまり敏感ではない（成田 & Inouye, 2011）

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