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Main Points:

  • 目的の組織を採取したら、劣化を防ぐためにすぐに固定する。

  • 10%中性緩衝ホルマリン(NBF)または4%パラフォルムアルデヒド溶液(PFA)は、組織学によく使われます。 これらはH&Eや免疫組織化学(IHC)マーカー、特殊染色に有効な固定化剤です。

  • 最適な固定は、最良の病理組織学的結果を得るための鍵である。

組織固定への導入

解剖病理学および組織の顕微鏡検査における基本検査では、組織の最適な固定、処理、切片作成、染色を行う必要があります。 固定は、組織検査の重要な初期段階です。 固定が不十分だと、特殊染色、免疫組織化学、その他の組織学的手法を含め、不正確な結果を何度も招くことになります。 よく保存された組織は、その構造と、特殊染色、免疫組織化学の抗体、in situハイブリダイゼーションアッセイの核酸プローブなどの試薬に対する反応性を保持します。 固定不足も固定過多も組織学上大きな問題となりますが、固定不足は固定過多よりも大きな問題であり、避けなければなりません。 ヒト、ラット、マウスの脳組織のような脂肪組織の固定には、特別な注意が必要な場合があります。 最適な組織固定は、薄切片作成、最適な組織化学染色、長期保存やアーカイヴ化を実現するために、細胞や細胞外構造の保存を保証するものである。 ここでは、ヒトと動物組織の両方で最適な固定を実現するための重要な要因について簡単に説明します。

組織固定とは

固定とは、生体組織がサンプルの生体内の状態をできる限り表現できるように保存する化学プロセスです。 組織サンプルをできるだけ生体に近い状態で保存するためには、死後のプロセスである自己分解(タンパク質分解酵素による自己分解)および腐敗(微生物の働きによる有機物の腐敗)を止める必要があります。 細胞や細胞外の形態が保たれ、病理組織学的な分析に重要なタンパク質を変性させない固定剤である。

組織学用の一般的な固定剤

多くの固定剤が存在し、特定のタイプの使用は下流の分析により決定される。 組織学では、最も効果的で一般的に使用されている固定剤はアルデヒド系です。 H&E染色、およびほとんどのIHCマーカーと特殊染色には、以下の固定剤が推奨されます:

  1. Neutral Buffered Formalin (NBF)。 10%ホルムアルデヒド緩衝液、pH7.0-7.4は、ほとんどの研究室で一般的に使用されている。 手術直後、組織を10%NBF溶液に完全に浸し、時間を計る。 米国では様々な業者からすぐに使える溶液が販売されている。 固定するタイミングによって、さらに議論されるように最適な固定が決定される。

  2. パラホルムアルデヒド(PFA)溶液。 4%PFA溶液:新鮮な4%PFA溶液で同様の結果が得られ、費用対効果も高い。 分解が早いため、この溶液は使用前に毎回新しく調製する。

作用機序と両溶液のホルムアルデヒド量は同じです。

作用機序

固定の作用機序は、内在する生体分子を変性させ、進行中のすべての酵素反応と代謝活動を速やかに停止させることであります。 この際、自己分解によって組織サンプルを消化するはずのタンパク質分解酵素は変性され、自己分解プロセスが停止される。 また、固定化剤は、組織試料に付着する微生物(特にバクテリア)に対して毒性があるため、外部からのダメージから試料を保護することができる。 さらに、多くの固定剤は、処理された組織を日和見微生物が食べにくいように化学的に変化させ、腐敗のプロセスを防止する。

ホルムアルデヒドの固定化のメカニズムは、アミノ酸残基、主にアミノ酸リジン残基(リジンの側鎖アミノ基)間の架橋、または共有化学結合の生成によって、メチレンブリッジが形成されることである。 ホルムアルデヒドの架橋は、アミノメチロール基とフェノール、インドール、イミダゾール側鎖の間でも起こり得ます。 さらに、ホルムアルデヒドは、リジン、アルギニン、チロシン、アスパラギン、ヒスチジン、グルタミン、セリンなど様々なアミノ酸に作用する。 架橋固定剤は、試料の内部構造を維持し、タンパク質の構造を大きく損なわない。 ホルムアルデヒドの使用は、組織試料の形態を維持し、タンパク質の二次構造および三次構造に影響を与えず、したがって保存されるという点で有利である。 ホルムアルデヒドは浸透速度が速いため、効果的な固定剤であることが提唱されている。

固定の方法

組織を固定するには、浸漬と経心筋灌流の2つの方法がある。 浸漬固定では、採取したばかりの組織を十分な量の固定液に浸す。 これは最も単純で、最も一般的な固定方法である。 一方、経心筋灌流は、循環系を利用して固定液を行き渡らせる方法であり、巧みに行えば、迅速かつ効果的に固定することができる。 この方法は、一般に、自己分解や腐敗による劣化が少なく、形態がよく保存される。

げっ歯類やその他の小動物では、最良の結果を得るために経心筋灌流が強く推奨される。 経心筋灌流後、採取した臓器を固定液に浸し、完全に固定することができます。

固定期間

固定剤は、溶液がサンプルに完全に浸透するために必要な時間だけ組織サンプルに接触させる必要があります。 浸漬固定の場合、組織サンプルの密度、浸透速度、温度などの特定の要因を考慮する必要があります。 浸透速度と固定速度は固定剤のプロセスとして全く異なるものであり、後者は前者に比べてゆっくりと進行することに留意することが重要である。 浸透速度の目安は1mm/時です。 NBF処理した試料は、24時間の固定時間を推奨します。

過少固定(処理した組織から固定剤を早く抜く)は形態学的保存性の低下につながり、過大固定(処理した組織から固定剤を遅く抜く)は固定アーチファクト、シグナルの損失、非特異バックグラウンドシグナル(「ノイズ」)の増加につながる可能性がある。 一般に、過固定を避けるため、組織を36時間以上固定することは推奨されない。 どちらも独自の解決策を必要とする問題であり、組織サンプルを固定する際には避けなければならない。 したがって、サンプルを固定剤にさらす時間は、慎重に調整しなければならない非常に重要な問題です。

固定のプロセスの後、サンプルが乾燥すると、アーチファクトが発生することがあります。 これらのアーチファクトは、オルガネラの損失、核の収縮、およびアーチファクト的な塊の形で起こり得るので、サンプルを正確に保存し続けるためには、処理したサンプルをリン酸緩衝液/食塩水で湿らせておくことが不可欠である。

組織の大きさと固定液の量

固定液は緩衝性が低いため、固定の過程で溶液のpHが変化する傾向があります。 大量の固定剤を使用することで、最適な固定が可能となる。 使用する固定液の量は、組織の体積の約15~20倍が望ましい。 試薬の安定性を保ちつつ、十分な固定を行うには、大量の固定液を使用することが望ましい。 最良の結果を得るためには、組織は一辺の厚さが4~5mm以下になるように切断する必要があります。

概要

  • 固定は手術/解剖後すぐに行う必要があります。

  • 組織は10%中性緩衝ホルムアルデヒド(NBF)溶液または新たに調製した4%パラホルムアルデヒド溶液で固定します。 ホルムアルデヒド系固定剤は、組織の長期保存に好ましく、切片作成、形態学(H&E)、特殊染色、免疫組織化学に最良の結果をもたらすことが知られています。

  • 組織を小さく切り分け(最大4-5mm)、十分な量の固定液を使用し、組織が完全に固定液に浸かっていることを確認します。

  • 固定は、組織の大きさに応じて24~36時間以内に行う必要があります。 固定剤にサンプルをさらすタイミングは重要であり、較正する必要があります。

  • 固定した組織はPBSまたは70%エタノールに移し、組織ブロックを作成するための処理に回さなければなりません。

固定した組織を長期間保存する必要がある場合、または固定や組織サンプルの発送について追加のアドバイスが必要な場合は、ラボスタッフに相談してください。 質問は [email protected]

までメールにてお願いします。 Hannah Bashar

Edited by: Rajni Sharma, Ph.D.