抗原・抗体検出のための新規免疫マイクロレンズイメージング

要旨

抗原抗体反応の検出・解析は、医学、生物学、環境科学、食品安全などの分野で最も重要な検出技術の一つである。 しかし、抗原や抗体を検出するための従来の古典的な方法は、時間がかかる、コストが高い、精度が低いなど多くの問題を抱えている。 マイクロレンズを用いた新しい免疫微小球のイメージング技術は、抗原抗体反応前後の屈折率変化を検査するために使用されます。 標識、前処理、後洗浄、高価な酵素を必要とせず、抗原抗体反応の定性・定量判定を迅速に行うことができます。 ここでは、その原理と利点、マイクロレンズ免疫測定装置の構造、臨床検体の測定における可能性について特集を組み、議論する。 5372>

1. はじめに

現在、抗原や抗体の検出には、酵素免疫吸着法(ELISA)、表面プラズモン共鳴法(SPR)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、コロイド金免疫クロマトグラフィー法(GICT)、間接免疫蛍光法(IFA)、化学発光免疫法(CLIA)および粒子増強比濁免疫法(PETIA)などが一般的である。 ELISAは、酵素触媒反応の増幅と抗原・抗体の特異反応を組み合わせたもので、高精度かつ安価であるが、条件管理が厳しく手順が複雑である。 SPR は、生体分子と他の分子との相互作用を検出するために 1990 年代に開発されたもので、標識を必要とせず、迅速に結果が得られるが、装置が高価で、大量の試料が必要である . RIAは、高感度で信頼性が高く、必要なサンプル量が少ないという特徴があります。 しかし、放射性核種は健康に有害であり、また試料の生物学的活性を変化させるため、実験誤差の原因となる。 GICTは新しいタイプのイムノアッセイ技術であり、抗原や抗体を検出する最も一般的な方法の1つで、簡単、単純、迅速、低コストですが、サンプルサイズに制限があり、感度が低くなっています . また、CLIA、IFA、PETIAも抗原・抗体の検出に広く用いられています。

屈折率の変化を検査する免疫マイクロレンズイメージング法は、上記の方法の限界を打破することができます。 迅速、高感度、簡便、無公害、低コストで検出が可能であり、一次医療機関への幅広い応用が期待される。 本技術は、平行光照射、高解像度カメラ、インテリジェント解析ソフトウェア、オートフォーカス、温度制御システム、マルチウェルマイクロレンズサンプルテストプレートで構成されており、抗原と抗体のマルチパス検出を実現することが可能です。 高解像度カメラシステムは、マイクロレンズイメージングの要件を満たすことができ、温度コントローラ、オートフォーカス、および自動インテリジェント解析システムの使用は非常に正確な測定のための実験の誤差を減らすことができます。

2 マイクロレンズ免疫測定の原理

マイクロレンズは球面の一端と他の端が平面の円柱レンズであります。 強力な増幅効果を持ち、従来の光学顕微鏡のイメージング能力を大幅に向上させます。 半径が0.5mm、屈折率(RI)が0のマイクロレンズを()の溶液に浸し、平面光で照明すると、屈折の効果により、その像は縁に暗色のリングを持つ丸いものになる。 この像の輝点の半径と、マイクロレンズの円柱の高さなどのパラメータとの関係は、次のように表される:ここで、マイクロレンズの球面頂部への光の入射角は、. この式に基づいて、イメージングにおける輝点の半径とマイクロレンズの半径を測定することにより、媒質の瞬間的な変化を決定することができる。 光の屈折は光速で起こるので、マイクロレンズの周囲の媒質の瞬間的なRI変化は、直ちに中央の輝点の半径の変化を誘発することができる。 したがって、この方法では、高速度カメラによる撮像で、瞬時のRI/濃度変化をモニターすることができる(図1)。

(a)
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(b)
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(c)
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(e)
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(f)
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(a)
(a)(b)
(b)(c)
(c)(d)
(d)(e)
(e)(f)
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図1
マイクロレンズによる様々な溶液中の免疫微小球のイメージング。 (a)免疫微小球のイメージングの基本原理。 それぞれ、波長532nmの水中(25℃)、波長532nmの水中(37℃)、波長633nmの水中(25℃)、波長532nmのエタノール中(25℃)、または波長633nmの血清中(37℃)でのマイクロレンズの画像を示す

3. マイクロレンズ免疫測定装置の構造と機能

図2に示すように、平行光源、高解像度イメージング、自動インテリジェント分析、オートフォーカスおよび温度制御システム、およびマルチウェルマイクロレンズ試験板は、マイクロスフィア免疫測定装置を構成する。 平行光源がマイクロレンズに平行光を照射すると、高解像度オートフォーカスイメージングシステムが数ミリ秒で焦点の合った画像を取得する。 そして、免疫微小球の画像は、インテリジェントな解析ソフトウェアシステムによって解析され、抗原/抗体の濃度およびその値を推論することができる。 温度制御システムの機能は、異なる抗原抗体反応に要求される異なる温度を調整することである。

図2
マイクロレンズ免疫測定器の構造。 平行光照射、オートフォーカス、高解像度イメージング、インテリジェント解析ソフトウェア、温度制御システム、マルチウェルマイクロレンズテストプレートが含まれる。

3.1. 平行光照射システム

LED を平行光源として、円筒形の平行光照射エリアを作り出し、本来のコンデンサーと同様、低コスト、長寿命、完璧な発光性能、小型化という利点を備えている。 図3に示すように、レンズの屈折により、実際の平行光を受光することができる。 LEDの照射領域では、実際の平行光が得られるように、関連するレンズを構成して、光の方向と分布を変えることができる(図3)

図3
平行光照射システムの原理 LEDから発せられた光をレンズ1とレンズ2が集光する。 そして、集光された光は光トンネルと絞りを通り、レンズ3へ投影される。 最後に、実際の平行光をレンズで取得する。

3.2. 高解像度オートフォーカスイメージングシステム

このシステムは高速デジタルカメラとオートフォーカスシステムで構成されている。 現在、市販のデジタルカメラの撮像速度は1秒間に1万コマを超えるものもあります。 このため、溶液中のRIの動的な変化をリアルタイムでモニタリングすることが可能である。 高画素CCDカメラは、高解像度のマイクロレンズイメージングを実現するために重要な役割を担っています。 オートフォーカスシステムのコアは、画像識別部、画像処理部、制御部で構成されています。 カメラシステムによって収集された画像は分析され、鮮明度の評価が示される。 この評価に従って、取得した画像の解像度が事前に設定した要件を満たすまで、システムは自動的に適切な領域または方向に駆動されます。 自動画像認識・解析システム

自動画像認識・解析システムは、主にマイクロレンズの画像認識とデータ解析を行い、その画像の瞬時変化を監視し、それによって抗原抗体反応過程でのサンプル溶液の屈折率変化を推測する。 その精度は画質と密接に関係しており、画素、画素サイズ、解像度などのパラメータがRI測定に直接影響する。 1000万画素以上のCCDデジタルカメラと3nm以下の小さな画素サイズ、半径600μmのマイクロレンズを使用すれば、中心輝点比率と外輪半径比率の変化により屈折率変化を測定し、屈折率変化の測定値が10-6となる。 温度制御システム

温度制御システムは、酸化インジウムスズ薄膜を形成した透明強化ガラス基板を、高精度PID(比例積分微分)温度制御装置で制御しています。 これにより、マルチウェルマイクロレンズテストプレート内の試料温度を2分間で設定値まで急速に到達させ、0.1℃の変化範囲に維持し、抗原抗体反応を効果的に行うことができます。 マイクロレンズテストプレート

マイクロレンズ免疫測定装置用に特別に設計されたマルチウェルマイクロレンズプレートです。 ポリメチルメタクリレート(PMMA)材料でできており、一般に異なる検出要件を満たすために2または16の台形ウェルとして準備されています。 各ウェルの内部には、半径数百ミクロンのマイクロレンズが底面に配置されています。 このマイクロレンズ・プレートを適用することで、マルチチャンネル検出のための客観的条件が得られる。 ウェル下面の直径は2mm程度であるため、抗原抗体検出のためのマイクロレンズは数マイクロリットルの試料液で十分である。

4 免疫微粒子イメージングシステムの応用

4.1. 抗原抗体反応の測定

Huang たちは、さまざまなタイプの抗原抗体反応を検出し、その規則的な特徴を見いだした。 まず、抗原(Ag)-抗体(Ab)反応の過程では、屈折率が反応時間によって変化することがわかりました。 第二に、反応時間によるRIの変化には、急激に増加する時期、比較的安定な時期、緩やかに減少する時期の3つの段階が存在した。 第一段階は、AgとAbの結合に関連しており、AgとAbが素早く結合して複合体を形成すると、RIは急激に増加した。 RIが最大になるのは第2段階である。 第三に、AgやAbの濃度はRIに大きな影響を与える。 したがって、AgやAbの濃度の関数としてRIの変化を得ることにより、検体中のそれらの含有量をフィッティングカーブにより算出することができる。 第四に、捕捉抗体とプロービング抗体の違いも、RIの変動に影響を与える。 本手法を用いて、数種のAg-Ab系による抗原抗体反応を測定したところ、数種の抗原抗体溶液(インターフェロン-γ(IFN-γ)Ag-Ab.Ag-Ab)の濃度と屈折率変化との関係が明らかになった。 プラセンタアルカリホスファターゼ(PAP)Ag-AB、カリクレイン6(KLK6)Ag-AB、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)Ag-AB、心臓トロポニン(cTnI)Ag-AB、脂肪酸結合蛋白(FABP)Ag-AB、CRP(creactive protein) Ag-AB溶液) が得られた(図4参照)。 抗原抗体複合体の会合と解離は動的なプロセスであることが知られているため、RI vs. RIの曲線に基づき、抗原抗体複合体の会合と解離の様子を観察した。 の曲線と時間による微分の計算から、以下の式を用いて、会合・解離速度定数や(図4(a))、その他の熱力学的パラメータについての情報を得ることもできる。

(a)
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(b)
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(c)
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(a)(b)
(b)(c)
(c)
図4
抗原による屈折率変動抗体反応。 (a) IFN-γまたはPAPの抗原抗体反応の屈折率とその時間との関係。 (b)KLK6抗原、CRP抗原にそれぞれモノクローナルAb、ポリクローナルAbを添加し、抗原濃度を測定した結果。 (c) HCGとcTnIまたはFABP抗原の濃度との関係を、それぞれ対応する抗原にそのキャプチャAbまたはプロービングAbを添加した場合について解析した。 Ag:抗原、Ab:抗体、:屈折率変化、IFN-γ:インターフェロンγ、PAP:胎盤アルカリフォスファターゼ、KLK6:カリクレイン6、HCG:ヒト絨毛性ゴナドトロピン、cTnI:心臓トロポニン、FABP:脂肪酸結合蛋白、CRP:C反応蛋白
4.2. 臨床サンプルの測定

免疫マイクロスフィアイメージング技術は、さらに臨床サンプルの検査に活用された。 36の臨床サンプルは、CRP Agの濃度をこの1つで検出した。 イムノクロマト法と比較して相対標準偏差は2-10%程度であり、2つの方法で得られた結果の相関係数は0.989と高い値に達している(図5)。 臨床的に溶血した血清試料は、従来の方法で検出した結果の精度に大きな影響を与えることがよく知られています。 しかし、本手法では、溶血したサンプルでもマイクロレンズの画像は鮮明である。 溶血したサンプルと溶血していないサンプルの抗原検出値の相対誤差は2%程度であり、溶血した血清サンプルは結果精度にあまり影響を与えないことがわかります。

図5
36検体のCRP抗原の免疫顕微鏡イメージングによる測定とイムノクロマトグラフィーによる測定比較

5. 抗原および抗体検出のための免疫微小球イメージングの可能性

抗原のほとんどはタンパク質であるが、一部は多糖類、核酸、その他の物質であり、抗体はすべてタンパク質である。 タンパク質はアミド基やカルボキシル基を多く含むため、これらの極性基が静電気作用によりコロイド粒子に電荷を発生させ、同じ電荷を持つ粒子同士は反発し合っていた。 同時に、親水性の強い極性基は水分子と反応して水和層を形成し、親水性コロイドを生成し、タンパク質が凝集して沈殿を形成しないようにして、コロイド粒子が溶液中に均一に分散される。 タンパク質は親水性コロイドから疎水性コロイドに変化する。 電解質環境下では、コロイド粒子はさらに凝集し、抗原抗体複合体を形成し、目で見ることができるようになる。 親水性コロイドと疎水性コロイドは屈折率が大きく異なるため、親水性コロイドを疎水性コロイドに変換することで、親水性コロイドと疎水性コロイドの屈折率差を検出することができます。 このため、屈折率の動的な変化を観察することで、溶液中の抗原抗体反応の有無を判断することができます。 抗原・抗体濃度と反応時間の関係から、標準曲線を作成することができます。 抗原抗体反応の過程で複合体は大きくなり、屈折率の変化も顕著になります。 標準曲線を用いることで、検出された抗体や抗原の濃度を容易に定量することができます。

マイクロレンズイメージング免疫測定法では、異なる抗原のエピトープに相補的な抗体であれば、確かに抗原-抗体反応で同様のRI増加を引き起こすことが証明されました。 図4(b)、(c)に示すように、ある抗原に対してキャプチャーAbとプロービングAb、あるいはモノクローナルAbとポリクローナルAbを用いて抗原測定を行った。 この曲線から、Ag-Ab反応時の変化誘導に2種類の抗体で大きな差がないことがわかり、マイクロレンズイメージングイムノアッセイは、検出のために、キャプチャまたはプロービングAbとモノクローナルまたはポリクローナルAbという異なる種類の抗体を使用できることがわかる。 しかし、モノクローナルAbは、抗原に対する親和性が高いため、より大きな反応を引き起こすだけでなく、交差反応の偽陽性の可能性を低減し、より低濃度の抗原を検出することができるため、マイクロレンズイメージング免疫測定法ではモノクローナルAbが好まれる。 つまり、イムノアッセイの他の手法と同様に、交差反応は理論的に避けられないと言えます。 言い換えれば、免疫マイクロレンズイメージングの特異性は、ターゲット抗原に対する選択された抗体の特異性に完全に依存します。 したがって、適切な抗体のスクリーニングと抗原抗体反応系の最適化が非常に重要である。 結論

この免疫顕微鏡イメージング技術は、異なる試料のRIを迅速かつ正確に測定し、抗原と抗体の反応過程におけるRIの変化をリアルタイムにモニターすることができる。 RIは抗原やAbの濃度変化により変化する。 従って、AgやAbの濃度変化に伴うRIの変化から、標識、前処理、後洗浄、高価な酵素などを必要とせず、試料の含有量を定性・定量的に算出することが可能です。 従来の検出方法と比較して、正確で信頼性が高く、短時間(数分以内)で終了し、汚染もなく簡便であるという利点があります。 また、検出限界はpg/mlと低く、数μlで十分な検出が可能であり、従来の方法では検出が困難な溶血した臨床試料にも適しています。 しかも、試料に負担をかけずに検出できます。 平行光照射システム、高解像度カメラシステム、自動インテリジェント解析システム、オートフォーカスシステム、温度制御システム、マイクロレンズ多孔体検出ボードでマイクロスフィアイムノアッセイ装置を構成しています。 小型で持ち運びも簡単です。

抗原抗体反応は、それ自体の濃度、温度、pH、電解質溶液の影響を大きく受けることがよく知られています。 このため、マイクロレンズイメージングシステムでは、これらの要因を考慮し、その変化のバランスをとることでデータを安定に保つようにしている。 例えば、抗原抗体反応部位を提供するテストプレートには適切な材料を選択し、疎水性の干渉を避けるために親水性にすることで本システムを最適化することができる。 5372>

抗原や抗体の検出は、生物医学の調査、臨床診断、医薬品分析、食品安全、環境モニタリングなどの分野で比較的重要な役割を担っています。 環境衛生、食の安全、医療への関心が高まる中、低コスト、高精度、小型、携帯性、簡単操作の高感度装置の開発は、社会的に急務となっている。

Conflicts of Interest

The authors declare that no conflicts of interests regarding the publication of this paper.

Authors’ Contributions

梁佳慧と葉暁天はこの仕事に等しく貢献した。

Acknowledgements

我々は、広州市科学技術プログラム相乗イノベーション主要プロジェクト(助成番号:201604020146)と中国国家自然科学基金(助成番号:81172824および30971465)から資金支援を得たことに感謝している。