Study design
この2群の二重盲検無作為化試験では、カナダBC州バンクーバーに住む19～42歳の妊婦60名を募集します。 参加者は、葉酸0.6 mg/日または(6S)-5-メチルテトラヒドロ葉酸の等モル量（0.625 mg/日）を毎日16週間補給する方法に無作為に割り付けられる（図2）。 0.6mgの用量は、市販の主要な出生前ビタミンブランド（Materna®）に見られるレベルと一致するため、我々の知見の一般化可能性を高めることができる。 16週間の介入は、赤血球葉酸の推定半減期に基づいており、赤血球の長期的な葉酸の状態（過去12～16週間）を測定できるようにすることを意図したものである。 また、妊娠中に他の栄養素（例えば、鉄分）を十分に摂取できるように、参加者全員に葉酸を含まない出産前のマルチビタミンを投与する予定である。 ベースラインとエンドラインで空腹時静脈血を採取し、血清葉酸、赤血球葉酸、血漿UMFAなどの主要評価項目を測定し、探索的評価項目として血漿S-アデノシルメチオニン、S-アデノシルホモシステイン、総ホモシステイン、総システイン、メチオニン、ビタミンB12、ピリドキサル5リン酸、フリーコリン、ベータインを測定する予定。 MTHFR（677 C > T, rs1801133、および1298 A > C, rs1801131）およびDHFR（rs1643649およびrs70991108）変異体の遺伝子型判定と全血球計算も実施する予定です。 女性は、試験の産後（探索）フェーズを継続するオプションがあり、エンドラインの訪問時に、産後約1週間まで服用するサプリメントが追加で提供されます。 産後5～7日目に、少量の母乳サンプル（3mL）と非絶食の静脈血液サンプルを提供します。 母乳の評価項目は、葉酸の形態（UMFA、THF、5-メチル-THF、5-ホルミル-THF、5,10-メテニル-THF）と牛乳のFBPである。 産後の血液サンプルで評価される結果は、赤血球の葉酸と血漿のUMFAです。 本試験プロトコルは、2013年標準プロトコル項目に従って作成されています。 介入試験のための推奨事項（SPIRIT）ガイドライン（図3） 。 詳細はAdditional file 1（SPIRITチェックリスト）を参照）
参加者フロー図
標準プロトコル項目(Sandard Protocol Items)をご覧ください。 SPIRIT（Recommendation for Interventional Trials）登録、介入、評価のスケジュール
このパイロット試験の主目的は、十分な検出力を持つ確定試験の設計に情報を提供するために、妊娠16週間の（6S）-5メチルテトラヒドロ葉酸と葉酸の補充後の血清葉酸、赤血球葉酸、UMFAにおける変化について推定値を得ることである。 第二の目的は、決定的な試験のデザインと実現可能性を支援するために、募集と参加率を得ることです。 産後段階の探索的な目的は、各群における母乳葉酸全体の葉酸としての割合の定量化、母親の産後血漿UMFAと母乳葉酸との相関の評価、各群における出産後の赤血球葉酸濃度の評価である
参加者、募集およびインフォームドコンセント
包括的な判断基準。 (1)妊婦（単胎妊娠）、(2)グレーターバンクーバー地域に居住、(3)同意時の妊娠21週以下、(4)19～42歳、(5)インフォームドコンセントが可能なこと
Exclusion criteria: (1) 母体の葉酸状態に影響を与えることが知られている既往症（吸収不良性及び炎症性腸疾患、活動性セリアック病、胃バイパス手術、萎縮性胃炎、てんかん、進行性肝臓疾患、腎臓透析、1型又は2型糖尿病、鎌形赤血球症／貧血）。 (2) 母体の葉酸状態に影響を与えることが知られているライフスタイル要因（現在の喫煙、アルコール摂取、娯楽用薬物の使用）; (3) NTDの影響を受けた妊娠の発症リスクが中程度から高い（女性またはその男性パートナーに適用されます。 他の葉酸感受性の先天性異常の個人または家族歴（両親または兄弟姉妹）、個人的なNTD歴またはNTDの影響を受けた妊娠の経験）。 (4) ビタミンB群の代謝を阻害することが知られている薬剤（クロラムフェニコール、メトトレキサート、メトホルミン、スルファサラジン、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、トリアムテレン、バルビツール）; (5) 妊娠前の体格指数（BMI）30kg/㎡以上；または (6) 試験サプリメントの原材料に対するアレルギーがある。
サンプルサイズ
サンプルサイズは、16週間のサプリメント摂取後の主要アウトカム（血清葉酸、RBC葉酸、UMFA）の変化の分布（平均±標準偏差）を推定するという主要目標に基づいて算出されました。 これを達成するために、我々は50人の女性（各群25人）を必要とする。少なくともn = 50のサンプルは、臨床研究のパイロットスタディに適切であると一般に認識されている 。 したがって、合計60人の女性（各グループ30人）が募集されます。
募集
ポスターは、カナダ、BC州バンクーバー市内のBC Women’s Hospital、医療クリニック、妊婦向け小売施設（例：妊婦クラス、フィットネススタジオ、妊婦服店）で掲示されます。 研究の詳細は、医師、助産師、看護師などのスタッフおよび医療関係者に適宜お伝えします。 ソーシャルメディア（Facebook、Instagram）での広告は、グレーターバンクーバー、BC地域の19～42歳の妊婦をターゲットに使用されます。
インフォームドコンセントの取得と適格性の確認
参加を希望する女性は、研究コーディネーター（KMC）に直接連絡してください。 その際、研究の詳細、参加資格、インフォームドコンセントについて説明します。 登録を希望する適格な参加者には、研究IDが与えられ、ベースラインの訪問が予定されます。 参加者は、ベースライン時の診察まで、現在使用している妊婦用マルチビタミン/葉酸サプリメントを継続するように指示されます。
Study visits
Study visitsは、カナダのBC州バンクーバーにあるブリティッシュコロンビア大学の食品・栄養・健康ビルとBC Children and Women’s Hospitalの臨床研究評価ユニットで行われる予定です。 ベースライン（妊娠8～21週）。 参加者と研究コーディネーター（KMC）の両方がインフォームドコンセントフォームに署名する。そのコピーは研究訪問後にスキャンされ参加者にEメールで送信される。 参加者は、病歴、栄養歴および人口統計学的データを収集するためのベースライン調査票を記入する。 DFEを算出するために、有効な食物頻度調査票が使用される。 体重および身長は、電子体重計および身長計を使用して測定され、それぞれ0.1kgおよび0.10m単位で記録される。 12mL、3時間の空腹時静脈血サンプルを採取する。 参加者は試験用のサプリメント（葉酸または(6S)-5-メチルテトラヒドロ葉酸）を受け取り、毎日の摂取量を記録するサプリメント日誌が提供される。 中間点：8週間後、すべての女性に連絡し、遵守状況を確認し、質問や懸念に対処し、エンドラインの訪問を予定する。 エンドライン（妊娠24～37週）：12mL、3時間の空腹時静脈血サンプルを採取し、上記のように体重を測定し、参加者はエンドラインアンケートに答えてベースラインからの健康状態の変化や薬の使用について判断する。 参加者はサプリメント日誌を返却し、残りのカプセルはすべてカウントされる。 産後：エンドライン訪問時に、母乳育児を計画しており、家庭用冷凍庫が稼働している参加者は、試験の産後段階を継続することができる。 2回目のインフォームドコンセントフォームで同意を得た後、産後約1週間まで飲み続けるサプリメントと新しいサプリメント日誌が渡されます。 参加者は、産後5～7日目に自宅で少量（3mL）の母乳サンプルを採取する方法についてトレーニングを受け、必要なすべての用品を与えられる（以下の「母乳の採取と処理」のセクションでより詳細に説明）。 参加者は母乳サンプルを冷凍庫で保管し、受け取りが可能になったら研究コーディネーターに連絡する。 受け取りは通知から4日以内に行われ、この時に12mLの静脈血サンプルが採取される。 血漿中のUMFAのピークを標準化するために、母乳と血液サンプルの両方の採取の2時間前に葉酸サプリメントを摂取するよう女性に指示する（母乳にUMFAが取り込まれる可能性もあるが、このプロセスのタイミングについてはよくわかっていない）
Study Supplements
葉酸と（6S）-5-methyltetrahydrofolic acidは妊婦用のマルチビタミン剤とは別に提供する予定。 この決定は、一部の女性が出産前のマルチビタミンの摂取時に不耐性を報告するために行われた。これは通常、鉄分を多く含むことが原因で、妊娠第1期以降に解消される。 一時的な不耐性が生じた場合、参加者はマルチビタミンをスキップするか半量摂取し、全量の葉酸を引き続き補給することができます。 葉酸と妊婦用マルチビタミンのバルク原料は、Natural Factors社（カナダ、BC州、コキットラム）から提供されたものである。 6S）-5-メチルテトラヒドロ葉酸（Metafolin®）のバルクは、Merck & Cie（スイス、シャフハウゼン）により提供されました。 すべてのバルク成分は、Natural Factors (Coquitlam, BC, Canada) で植物性ゲルカプセルにコンパウンドされました。 葉酸と(6S)-5-メチルテトラヒドロ葉酸のカプセルは、二重盲検化に対応するため、外観が同じになっています。 妊婦用マルチビタミンは、葉酸が取り除かれている以外は、WN Pharmaceuticals Ltd.® Prenatal (NPN 80025456) と同じ微量栄養素が配合されています。 Natural Factors社（カナダ、BC州、コキットラム）により、すべての試験用サプリメントの品質全体の要約が完成し、高性能液体クロマトグラフィーによる葉酸および（6S）-5-メチルテトラヒドロ葉酸の用量が確認され、カナダ保健省により検証された。 2019年7月26日にカナダ保健省天然・非処方保健製品局から臨床試験申請の承認通知（提出番号244456）が提供されました
二重盲検化、無作為化、サプリメントパックの提供
ナチュラルファクターズ社（カナダ、BC州コクイトラム）の独立研究アシスタントが、葉酸および（6S）-5メチルテトラヒドロ葉酸サプリメントの盲検コード（AまたはB）の付与を行う予定です。 葉酸サプリメントのボトルには「A」または「B」のラベルを貼り、”カプセルは葉酸または葉酸 “と表示する。 参加者と主要研究チームの両方がサプリメントの割り当てについて盲検化され、最終的な統計分析が完了した時点で初めてコード化が解除される。 無作為化の順序は、独立した統計学者によりコンピューターで作成され、各サプリメント群につき2人の参加者を含む4つのブロックが使用される。 主要研究チームは、無作為化順序について盲検化される。 各参加者のベースライン訪問時に、研究コーディネーター（KMC）は、割り当てられた試験用サプリメントを提供するために、その試験IDの割り当て（AまたはB）のみ盲検化を解除する。 ベースライン時に、参加者は16週間の介入に必要なすべてのカプセルを含むサプリメントパックを受け取ります。研究の産後段階まで続けることを選択した場合、参加者はエンドライン訪問時にさらにサプリメントを受け取り、産後1週間まで服用を継続することができます。
アドヒアランスを高めるための戦略
妊娠中の女性はモチベーションが高く、一般的に臨床研究への参加に興味がある傾向があります。 カナダ公衆衛生局の調査によると、ブリティッシュコロンビア州の女性の94%が、妊娠中に妊婦用マルチビタミンを補給しているそうです。 従って、参加者は登録時に毎日のサプリメント摂取に慣れている可能性が高い。 研究コーディネーター（KMC）は、中間点（ベースライン訪問の8週間後）に各参加者に連絡し、質問や懸念に対応する。 さらに、サプリメントパックは、自宅でのサプリメントの保管を可能にし、サプリメントダイアリーは、16週間を通してアドヒアランスを高めるために毎日のリマインダーとして機能します。 これらの理由から、試験プロトコルの高い遵守率（> 90%）が期待されます。
血液サンプルの収集と処理
静脈血サンプル（合計12 mL）は、ベースライン、エンドラインおよび産後（該当する場合）の訪問時に、6mLのエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）チューブ、2mLのEDTAチューブおよび4mLの血清チューブ（BD Biosciences、フランクリンレイクス、NJ、アメリカ）に集められます。 ベースラインとエンドラインの採血は、3時間の絶食後に行う。この時間枠は、最近の葉酸摂取が血清濃度に及ぼす交絡の影響を低減するのに十分である。 産後の血液サンプル（産後1週間）は、赤血球葉酸に影響を与えず、参加者の負担を軽減するために、非絶食とする。
全血溶血液の調製では、全血（0.3 mL）を6 mL EDTAチューブから取り出し、1%アスコルビン酸溶液3.0 mLを加えて1/11に希釈し、その後37℃で30分間インキュベートします。 その後、6mL EDTAチューブを3000rpm、15分間、4℃で遠心分離する。 血漿を採取し、（ベースラインおよびエンドラインの試料のみ）6mL EDTAチューブの残りの内容物を、SepMate PBMC分離プロトコル（STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada）を用いて末梢血単核層細胞（PBMC）の分離のために処理する。 2mLのEDTAチューブは全血球計算に使用されます。 4mL血清チューブは室温で30分間放置（凝固するまで）後、3000rpm、4℃で15分間遠心分離し、血清を採取する。
母乳の採取と処理
女性は、産後5-7日目の13時から14時50分（この時間の平均葉酸濃度は24時間の平均葉酸濃度を代表していると考えられるため）、最後の完全発現から2-3時間後に母乳を採取するように指示される。 参加者は、右乳房から母乳を完全に搾乳する（手動または電動ポンプで）。 母乳を搾乳した後、女性は母乳を軽く振って混ぜるように指示され、その後、滅菌されたファルコンピペットを用いて、0.5 mLを2つの琥珀色のクライオチューブ（それぞれ1％希釈用の0.005 gアスコルビン酸含有）に、1 mLを2つの琥珀色のクライオチューブに移します。 すべてのクライオチューブに0.5mLと1mLの目印をつける。 女性はすべてのバイアルを冷凍ボックスに入れ、冷凍庫で最大4日間保存する。
Laboratory analyses
Serum folate (nmol/L) and RBC folate (nmol/L) will be analyzed by microbiological assay, as globally recommended, using the microtiter plate method outlined by Molloy et.al .血清葉酸と赤血球葉酸は、Molloyらが概説したマイクロタイタープレート法を用いて、微生物学的分析によって分析される。 RBC folate (nmol/L) は以下の式で算出される：
Plasma biomarkers including UMFA (nmol/L)、S-adenosyl-methionine (μmol/L)、S-adenosyl homocysteine (μmol/L)↘Sadmosine (μmol/L), 総ホモシステイン（μmol/L）、総システイン（μmol/L）、メチオニン（μmol/L）、フリーコリン（μmol/L）、ベタイン（μmol/L）は、液体クロマトグラフィー質量分析計で分析されます。 ビタミンB12（pmol/L）はイムノアナライザーを用いて分析する。 ピリドキサール-5-リン酸（nmol/L）は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計で分析されます。 遺伝子変異は、TaqMan SNP ジェノタイピングアッセイを使用してジェノタイピングします。 全血球数は自動血球計数装置（Sysmex XNL-550）を用いて実施する。 母乳葉酸形態（UMFA、THF、5-メチル-THF、5-ホルミル-THF、5,10-メテニル-THFを含む）は、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析で定量され、総葉酸は、これらの形態の合計を表す. 母乳中のFBP濃度は、競合結合ラジオアッセイ法（Selhubらによる）を用いて測定される。
収集するデータの概要
構造化質問票による人口統計学、医療および栄養データ
ベースラインのデータ収集には、年齢、民族、妊娠期間、教育、職業、世帯収入、医療および投薬歴、報告された妊娠前の体重、一般的な食事（ビーガン、ベジタリアン、ケトン、グルテンフリー食品の摂取、何らかの理由で避けている食品/食品群など）およびサプリメントの利用が含まれる。
Anthropometrics
妊娠前のBMIは、自己申告の妊娠前の体重と測定した身長から算出される。 介入期間中の妊娠体重増加および妊娠中の総体重増加（自己申告の妊娠前体重と測定した最終体重を使用）を計算するために、ベースライン（体重と身長）およびエンドライン（体重のみ）で参加者の測定が行われる。
食事評価
食品葉酸とサプリメント葉酸からの総DFE（μg/日）は、有効な食品頻度アンケートであるブロック葉酸/食事葉酸相当量スクリーナー（NutritionQuest、バークレー、カリフォルニア、米国）を使用して計算される.また、食品葉酸相当量スクリーナー（Dietary Folic Aid Screener）は、食品葉酸（Folicates）と栄養葉酸（Equivalents）の両方を含む。
産後のデータ
サプリメントの総週数、出産時の妊娠週数、母乳収集プロトコルの遵守、母乳および産後の血液サンプル収集前の葉酸サプリメントのタイミングが記録されます。
Withdrawal criteria
Withdrawal criteriaには、自然または計画的な妊娠終了、葉酸/葉酸含有栄養サプリメントの追加使用、サプリメント/試験介入に関連する有害/重大な有害事象（資格を有する治験責任医師（CM）が決定）に従った場合などが含まれます。 また、参加者はいつでも自己退会することができ、それ以上の情報は収集されない。 中止の理由にかかわらず、以前に収集されたすべてのデータは解析のために保持されます。
データの取り扱いとプライバシー
すべてのデータと生物学的サンプルは、各参加者の研究IDを使用して識別されます。 個人を特定できるデータは、BC Children’s Hospital Research Instituteの安全なサーバースペースにある、暗号化されパスワードで保護されたコンピューターに保存されます。 個人識別情報を削除したデータは、クリーンアップされ、研究コーディネーター（KMC）と独立した研究アシスタントが、BC小児病院研究所がホストするREDCap（研究用電子データキャプチャ）に二重入力する。 KMC、JAH、CDK は最終データセットにアクセスすることができる。 紙媒体は鍵のかかる書類棚に、生物試料はブリティッシュコロンビア大学の研究代表者（CDK）の研究室内にある鍵のかかる冷凍庫に保管される。 参加者には、最終的な統計解析が完了した後に、葉酸サプリメントの割り当てと血液／母乳（該当する場合）の葉酸結果（ベースライン、エンドライン、産後のDFE、血清およびRBC葉酸、母乳の総葉酸濃度を含む）を伝える場合がある
データおよび統計解析
参加者のベースラインデータには記述統計学を使用する。 連続変数は平均値±標準偏差（正規分布でない場合は中央値および四分位範囲）、カテゴリー変数はグループごとの絶対数およびパーセントで報告される。 カプセルの数は参加者の服薬状況を計算するために使用し、サプリメント日記は服薬障害に関する記述的な洞察を提供するために使用する。 データは正規性を評価し、データが正規分布に従わない場合は、変換または同等のノンパラメトリック検定の使用を検討する。 統計解析はStata (StataCorp, College Station, TX, USA)を用いて行う。 すべての解析は、ベースライン時の最初のグループ分けに従ってintention-to-treatベースで行われ、欠損データの補正は行われない。 二次的なプロトコルごとの解析は、試験を完全に終了し、試験プロトコルを遵守した患者を含めて実施される。 5191>
一次解析
ベースラインとエンドラインにおける各群の主要アウトカム（血清葉酸、赤血球葉酸、血漿UMFA）の平均±標準偏差、および各群のこれらのアウトカムにおける女性内の変化の平均±標準偏差を算出する。 これらの推定値は、確定試験のサンプルサイズ算出に用いられる。
二次解析
主要アウトカムの探索的解析は、多重線形回帰モデルを用いて、ベースライン値および説明変数（DFE、探索的バイオマーカー、サプリメント開始時の妊娠週数）を調整し、治療状況によってベースラインからエンドラインへの変化が異なるかを調べるために実施する予定である。 また、ベースラインとエンドラインでUMFA≧0.2nmol/L（検出可能な濃度と考えられる）の女性の割合も各群で算出します。 副次的な目的に資するため、登録された女性の総数を参加希望者の総数で割ることにより、全体の試験参加率を推定する。 週次募集率は、登録された女性の総数を募集に要した総週数で割ることによって推定される。 参加者維持率は、全試験を完了した女性の数を登録された女性の総数で割ることによって推定される。 各募集戦略（ポスター、ソーシャルメディア、口コミなど）について、総リーチ数（ソーシャルメディアのみ）、問い合わせ数、登録者数、コストを評価する。 各募集戦略における問い合わせ後の登録のオッズは、オッズ比で評価される。 5191>
産後分析
母乳中の葉酸の割合（母乳葉酸の濃度を母乳の全葉酸の合計で割る）および産後の母親のRBC葉酸についての平均±標準偏差を計算する。 母乳葉酸濃度と母親の産後血漿UMFAとの関連を推定するために線形回帰を使用する。 産後のアウトカムはさらに、エンドライン値および説明変数（DFE、サプリメントの総週数、母乳収集プロトコルの遵守）を調整した多重線形回帰を用いて分析される予定です。 (6S)-5-メチルテトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は安全性が認められており、カナダの妊婦用マルチビタミン剤に配合されていますが、耐容上限量は設定されていません（現在のところ有害性のリスクは知られていません）。 無作為化は妊娠8週から21週（神経管閉鎖後）の間に行われる予定です。 このパイロット試験のリスクが低いことを考慮し、データモニタリング委員会の設置は必要ないと判断した。 安全性に関するすべての懸念、および必要な場合には試験の中止の決定は、研究責任者（CDKとJAH）および資格を有する研究者（CM）が行い、研究倫理委員会およびカナダ保健省に報告される予定です。 参加者の安全性監視のために必要と判断された場合、介入コードの盲検化はいつでも行われる可能性がある
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