PARADIGMI DEL RUOLO DELLE INTERAZIONI CD40-CD40L NELLA MALATTIA

Trapianto. La chirurgia dei trapianti non avrebbe raggiunto il grado di successo visto negli ultimi decenni senza lo sviluppo di agenti immunosoppressivi efficienti che minimizzano il rischio di rigetto del trapianto. L’anticorpo monoclonale (MAb) contro CD40L è stato usato come trattamento immunosoppressivo in molti modelli di trapianto animale. Nei primati, la somministrazione di MAb anti-CD40L ritarda il rigetto del trapianto, mentre la combinazione con CTLA4Ig, una proteina chimerica composta dal dominio extracellulare della molecola di superficie cellulare CTLA-4 e dalla regione Fc delle IgG1 umane che blocca il percorso CD28-B7, ha effetti additivi e sinergici. Questo trattamento combinato sostiene la sopravvivenza dell’allotrapianto di rene nei primati e aumenta la sopravvivenza del trapianto di pelle nei topi (53, 69). Il passaggio alla terapia anti-CD40L MAb, dopo 60 giorni di immunosoppressione convenzionale con CsA, è stato un trattamento efficace in un modello di allotrapianto renale nelle scimmie, anche se la CsA è nota per downregolare l’espressione CD40L sulle cellule T (7). È stato dimostrato che l’espressione del gene CD40L aumenta di quattro volte nei casi di rigetto acuto. Questo potrebbe servire come metodo non invasivo per monitorare la funzione dell’allotrapianto e anche per determinare la risposta biologica agli agenti immunosoppressivi classici come CsA e tacrolimus, entrambi noti per inibire l’induzione di CD40L (54). In modelli di trapianto animale, gli inibitori della calcineurina sopprimono l’espressione di CD40L sulle cellule T in vitro ma non nel tessuto linfoide, indicando che il percorso CD40-CD40L rimane funzionale durante il trattamento con questi agenti, il che può contribuire al rigetto del trapianto nel contesto clinico (63).

Aterosclerosi. La visione attuale dell’aterosclerosi, la malattia mortale più diffusa nel mondo occidentale, è quella di una malattia cronica, degenerativa e infiammatoria in cui si pensa che il sistema immunitario abbia un ruolo importante. CD40 e CD40L sono sovraespressi nelle lesioni aterosclerotiche sperimentali e umane. La legatura di CD40 su tipi di cellule associate all’ateroma, come le cellule endoteliali, le cellule muscolari lisce e i macrofagi, porta all’aumento dell’espressione di mediatori per lo sviluppo dell’aterosclerosi, come citochine, chemochine, fattori di crescita e metalloproteinasi. Bloccando le interazioni CD40-CD40L con MAb anti-CD40L nei topi si ottiene una diminuzione della formazione e della progressione dell’ateroma del topo, ma si favoriscono anche tali cambiamenti nella biologia e nella struttura della lesione, che possono essere importanti nella stabilizzazione della placca nella malattia umana (52).

Le piastrine esprimono anche CD40L e si pensa che contribuiscano significativamente al reclutamento di cellule infiammatorie nell’endotelio danneggiato in vivo (5). Le cellule T attivate che esprimono CD40L si trovano all’interno della parete dei vasi aterosclerotici, un fatto che supporta l’ipotesi che le cellule T CD4+ attivate possano orchestrare il processo aterosclerotico (43).

Altre malattie in cui la coppia CD40-CD40L può giocare un ruolo sono brevemente descritte nella tabella 1. Una breve discussione del ruolo di questa interazione nelle malattie autoimmuni lupus eritematoso sistemico (SLE), artrite reumatoide (RA), e polimiosite segue sotto.

SLE. (i) Espressione di CD40L nel LES umano (Tabella 2). Desai-Mehta et al. hanno riportato che le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di pazienti con lupus attivo mostrano un aumento di 21 volte della percentuale di cellule CD40L+ CD4+ rispetto ai soggetti sani. Dopo un’ulteriore stimolazione delle PBMC con MAb anti-CD3, la percentuale di cellule CD40L+ CD4+ è aumentata di cinque volte nei soggetti sani ma solo di 1,4 volte nei pazienti con LES attivo. Tuttavia, la percentuale di cellule T CD40L+ è rimasta più alta nel gruppo con LES attivo. I PBMC dei pazienti con il LES in remissione si sono comportati in modo simile a quelli del gruppo di controllo. Osservazioni simili sono state fatte riguardo all’espressione di CD40L da parte delle cellule T CD8+ appena isolate da pazienti con LES attivo (espressione 22 volte più alta rispetto al gruppo di controllo). Le cellule B sovraesprimono il CD40L nei pazienti con LES attivo a livelli paragonabili a quelli osservati nelle cellule T attivate. Le cellule B umane normali esprimono livelli molto bassi di CD40L e solo quando vengono manipolate, in contrasto con le cellule B del LES attivo che esprimono CD40L spontaneamente (12).

In uno studio pubblicato da Koshy et al., le PBMC attivate da soggetti sani o da pazienti di controllo della malattia hanno mostrato un’espressione ad alta intensità di CD40L con una graduale diminuzione fino a valori vicini al basale a 48 ore, mentre le PBMC di lupus hanno continuato a dimostrare livelli significativamente più alti di CD40L a questo punto temporale. Nessuna correlazione apparente dell’espressione di CD40L con l’attività della malattia è stata trovata in questo studio (33).

Higuchi et al. hanno confermato questi risultati sia nel LES che nel lupus murino, suggerendo che l’espressione ectopica di CD40L nelle cellule B del lupus può giocare un ruolo cruciale nello sviluppo del LES. I topi transgenici lupus-prone, che esprimono CD40L sulle cellule B, producono spontaneamente autoanticorpi, e inoltre la metà di questi topi sviluppa una glomerulonefrite con deposito di immunocomplessi (22). Devi et al. hanno anche confermato l’alta espressione di CD40L sulle cellule T e B del lupus. Più specificamente, il 45% delle cellule T dei pazienti con il LES esprimono il CD40L rispetto a solo l’8-18% delle cellule T dei soggetti sani o dei pazienti con RA. Inoltre, il 30% dei 48 pazienti di LES esaminati aveva un’aumentata espressione di CD40L anche sulle cellule B (13). Tuttavia, in contrasto con i risultati di cui sopra, c’è un rapporto in cui non sono stati trovati cambiamenti nell’espressione del CD40L nei linfociti del lupus. Invece, questi autori hanno riportato un’alta espressione di CD86 sulle cellule B del LES, che è anche un’importante molecola costimolatoria (3). Un altro studio ha riportato che i monociti di pazienti con LES attivo esprimono CD40L in modo aberrante. Ventitré pazienti con LES attivo sono stati studiati e confrontati con 16 individui sani. I risultati hanno mostrato un aumento di sette volte nella frequenza di monociti periferici che esprimono CD40L dai pazienti con LES rispetto ai soggetti sani. L’espressione di CD40L è stata verificata sia a livello di mRNA che di proteina e correlata significativamente con l’attività della malattia (28).

CD40L viene scisso dalla superficie cellulare delle cellule T attivate, da una metalloproteinasi di matrice, rilasciando sCD40L, una molecola di circa 18-20 kDa, che forma omotrimeri. Un rapporto che studia il ruolo funzionale di sCD40L ha concluso che sCD40L può indurre l’attivazione e la differenziazione delle cellule B. I livelli plasmatici di sCD40L erano significativamente più alti nei pazienti con LES attivo che nei donatori sani. Questi livelli erano correlati all’attività della malattia, valutata da SLEDAI, e ai titoli autoanticorpali circolanti di DNA a doppio filamento (dsDNA). È stato ipotizzato che gli alti livelli di sCD40L trovati nei pazienti con LES attivo possano avere un ruolo patogeno nella vasculite e nella nefrite che si verifica nel lupus attivo. Gli autori hanno proposto che i livelli di sCD40L potrebbero servire in futuro come un marcatore predittivo di flares della malattia di SLE (27). Vakkalanka et al. hanno anche mostrato concentrazioni medie significativamente più alte di sCD40L nei pazienti con lupus rispetto ai controlli della malattia e ai soggetti sani. Più specificamente, 66 pazienti con SLE sono stati studiati e confrontati con 30 pazienti di controllo della malattia e 23 soggetti sani. Nei soggetti sani, la sCD40L non era quasi rilevabile, mentre 38 pazienti con il LES avevano un livello di sCD40L superiore a 2 ng/ml (con una concentrazione media di 2,61 ± 2,15 ng/ml) e solo 7 pazienti di controllo avevano un livello di sCD40l superiore a 1 ng/ml. I pazienti sono stati divisi in tre gruppi, grave, moderato e lieve, secondo le manifestazioni cliniche. I pazienti con LES grave avevano una concentrazione media di sCD40L di 3,93 ± 2,86 ng/ml, quelli con LES moderato avevano una concentrazione media di sCD40L di 2,81 ± 1,57 ng/ml, e infine quelli con malattia lieve avevano una concentrazione media di sCD40L di 1,52 ± 1.06 ng/ml, indicando una correlazione tra il livello di sCD40L e l’attività della malattia (62).

Mentre l’induzione di CD40L sulle cellule T normali attivate è inibita in presenza di CsA, è interessante che questo effetto non si applica alle cellule T del LES. Uno studio sull’espressione di CD40L nel lupus umano ha concluso che la CsA non è riuscita a inibire l’espressione prolungata e potenziata di CD40L, osservata in vitro sulle cellule T del lupus attivate da MAb anti-CD3. La resistenza alla CsA era indipendente dall’attività della malattia. I monociti di lupus circolanti mostrano anche una resistenza prominente agli effetti inibitori di CsA sull’espressione di CD40L. Questi risultati indicano che l’induzione di CD40L sulle cellule T del LES può essere regolata da un percorso indipendente dal calcio/calcineurina (29).

Non è chiaro perché l’espressione di CD40L sia più alta nei pazienti con LES e se questa sovraespressione abbia implicazioni patogenetiche. È stato proposto che i linfociti T del LES, quando vengono attivati dall’impegno del TCR, favoriscono un profilo dominante di NFAT invece di un profilo equilibrato di fattori di trascrizione NFAT-AP-1. Questo pannello di mediatori intracellulari promuove la trascrizione e la stabilità dell’mRNA di alcuni geni, compreso il gene CD40L. L’espressione precoce del CD40L sulle cellule T del LES richiede la via NFAT sensibile alla CsA, ma l’espressione prolungata è più dipendente da una MAP chinasi specifica, cioè la chinasi regolata dal segnale extracellulare. Una maggiore e persistente attività della chinasi regolata dal segnale extracellulare nelle cellule T del lupus potrebbe contribuire alla sovraespressione del CD40L attraverso l’attivazione del fattore di trascrizione AP-1 e possibilmente stabilizzando l’mRNA del CD40L (10, 68). I flussi citoplasmatici di Ca2+ sono sopranormali nelle cellule T e B circolanti dei pazienti con LES, ed è stato proposto che questa anomalia possa rappresentare lo sfondo molecolare per l’espressione anormale di CD40L nel lupus (38, 40, 64). C’è anche l’evidenza che la deficienza della catena TCR ζ, che è stata descritta nei pazienti con il LES, può essere in parte responsabile della risposta sopranormale di Ca2+ menzionata sopra (39, 61). Questa correlazione è stata rafforzata dal recente rapporto che la correzione trasfezionale del deficit della catena TCR ζ nelle cellule T del lupus porta alla normalizzazione dei flussi citoplasmatici di Ca2+ (48).

(ii) Uso del MAb anti-CD40L in modelli di lupus e nel LES. Le molteplici funzioni di CD40/CD40L nella risposta immunitaria lo hanno reso un bersaglio attraente per l’intervento terapeutico nelle malattie autoimmuni. I MAb contro CD40L sono stati testati inizialmente in modelli di lupus murino. Il trattamento di topi F1 New Zealand Black × New Zealand White (NZB×NZW) con infusioni continue di MAb anti-CD40L ha prodotto un ritardo dell’insorgenza della malattia per una media di 4 mesi, una diminuzione dei livelli di autoanticorpi IgG anti-dsDNA, un ritardo nell’accumulo di cellule T con fenotipo di memoria attivato, una diminuzione del numero di cellule B nella milza e una soppressione del cambio di classe Ig e delle mutazioni somatiche. I livelli sierici di anticorpi IgG anti-dsDNA erano da 4 a 10 volte inferiori a quelli dei controlli non trattati e di pari età. Alla cessazione del trattamento, il fenotipo delle cellule T dei topi trattati è diventato indistinguibile da quello dei controlli e le cellule B hanno raggiunto un fenotipo completamente attivato con elevazione dei titoli IgG anti-dsDNA e sviluppo di proteinuria e malattia renale progressiva (65).

Un altro studio ha impiegato un trattamento combinato con anticorpo anti-CD40L e CTLA4Ig. Il trattamento combinato a breve termine di topi prenefritici NZB×NZW F1 ha portato a un’insorgenza ritardata della disfunzione renale per circa 6 mesi. Dopo l’insorgenza della proteinuria, un ciclo ripetuto di trattamento è stato in grado di indurre la remissione nei topi precedentemente trattati ma non nei topi precedentemente non trattati. C’è stata una diminuzione del livello di autoanticorpi IgG anti-dsDNA, e le milze dei topi erano marcatamente impoverite di cellule B, anche 16-20 settimane dopo l’infusione. È stato postulato che il trattamento con CTLA4Ig e MAb anti-CD40L può agire sinergicamente per bloccare i segnali antiapoptotici e, quindi, facilitare l’apoptosi delle cellule B durante la prima attivazione delle cellule B. Questo trattamento non ha causato immunosoppressione globale a lungo termine (66).

I risultati promettenti ottenuti negli studi sperimentali sugli animali non sono stati confermati nel LES. Nel lupus umano, la ciclofosfamide rimane il “gold standard” per il trattamento del coinvolgimento degli organi principali. La ciclofosfamide è un agente alchilante che causa un’inibizione non specifica della risposta immunitaria e un’immunosoppressione clinicamente significativa. Ha effetti collaterali significativi, tra cui il cancro alla vescica e l’insufficienza gonadica, rendendo così necessaria la necessità di nuovi interventi terapeutici. La somministrazione di ciclofosfamide è stato un trattamento consolidato per la nefrite lupica, una complicazione comune e temibile del LES e una delle principali cause di morbilità e mortalità.

Sono stati pubblicati due studi sulla somministrazione di MAb anti-CD40L nel lupus umano. Nel primo, uno studio multicentrico di fase 2, in doppio cieco, controllato con placebo, sono stati arruolati 85 pazienti con LES da lieve a moderatamente attivo e hanno ricevuto 6 iniezioni di IDEC-1 (MAb anti-CD40L) o placebo nel corso di 16 settimane. L’efficacia è stata valutata alla settimana 20, principalmente utilizzando SLEDAI. I risultati hanno mostrato che il trattamento con IDEC-1 era sicuro e ben tollerato, ma non è riuscito a dimostrare l’efficacia rispetto al placebo (19, 26).

Il secondo studio ha valutato i pazienti con nefrite lupica proliferativa provata dalla biopsia utilizzando BG9588 (anti-CD40L MAb). Ventotto pazienti con nefrite lupica proliferativa attiva sono stati arruolati e hanno ricevuto 20 mg di BG9588/kg di peso corporeo a intervalli bisettimanali per le prime tre dosi e a intervalli mensili per altre quattro dosi. I risultati hanno mostrato una riduzione del 50% della proteinuria (dove presente) senza peggioramento della funzione renale, la scomparsa dell’ematuria e un aumento della concentrazione di C3 nel siero. I titoli autoanticorpali anti-dsDNA sono diminuiti dopo la terapia, con riduzioni medie del 38,8, 50,1 e 25,3% a 1, 2 e 3 mesi dopo il trattamento, rispettivamente (4). Questo studio è stato interrotto prematuramente a causa di complicazioni tromboemboliche. Più specificamente, sono stati riportati due casi di infarto miocardico. Gli effetti trombotici che complicano questo regime di trattamento hanno sollevato questioni importanti per quanto riguarda gli studi futuri con gli esseri umani. Va notato che nessuno dei pazienti che hanno subito un evento trombotico aveva anticorpi antifosfolipidi dimostrabili. Il ruolo dell’interazione CD40-CD40L in queste complicazioni trombotiche rimane poco chiaro e ipotetico.

Uno studio su 5 pazienti con nefrite lupica che hanno ricevuto una terapia anti-CD40L ha mostrato che un breve corso di questo trattamento porta a una riduzione del numero di cellule B produttrici di anticorpi IgG anti-DNA. Questi cambiamenti persistevano per diversi mesi dopo la cessazione del trattamento (25). Uno studio simile su quattro pazienti con nefrite lupica attiva che hanno ricevuto un trattamento anti-CD40L (BG9588) ha mostrato che le cellule B che esprimono CD38, CD5 e CD27, che sono considerate marcatori di differenziazione delle cellule B, sono scomparse dalla periferia durante il trattamento anti-CD40L. Questi cambiamenti erano associati a una diminuzione dei livelli di anticorpi anti-dsDNA, della proteinuria e dell’indice di attività della malattia del LES (20).

RA. (i) Espressione di CD40L nella RA (Tabella 2). L’AR è una comune malattia reumatica sistemica autoimmune caratterizzata da un processo distruttivo cronico dei tessuti attribuito a una possibile risposta immunitaria in corso guidata dall’antigene. Poiché si pensa che le cellule T attivate giochino un ruolo chiave, non è sorprendente che le interazioni CD40-CD40L siano state studiate nel contesto dell’RA.

Berner et al. hanno studiato l’espressione di CD40L sulle cellule T di pazienti con RA. Sono stati studiati 62 pazienti con RA e 20 soggetti sani. CD40L era fortemente espresso su >10% delle cellule T nel 29% dei pazienti con RA ma sullo 0% delle cellule T nei controlli sani. I pazienti RA con >10% di cellule T CD4+ CD40L+ avevano una malattia più attiva. L’83% dei pazienti di questo gruppo aveva aumentato i livelli di proteina C-reattiva, l’89% era positivo al fattore reumatoide (RF) e nessuno di loro soddisfaceva i criteri dell’American College of Rheumatology per la remissione clinica completa, suggerendo una forte correlazione tra attività della malattia ed espressione di CD40L (2). L’espressione del CD40L a livelli elevati può riflettere un’attivazione aumentata e prolungata dei linfociti con conseguente attività infiammatoria aumentata e prolungata. L’espressione di CD40L funzionale ad alti livelli sulle cellule T di pazienti con RA è stata dimostrata anche da MacDonald et al. (42).

Un altro studio ha affrontato il ruolo della segnalazione CD40-CD40L nella produzione di RF. Nel sistema immunitario sano, le cellule B autoreattive ad alta affinità sono eliminate. Negli individui sani, le cellule B che producono RF a bassa affinità esistono nei linfonodi, ma il RF ad alta affinità non è rilevabile. Nell’AR, le cellule B ad alta affinità produttrici di RF si accumulano nella sinovia infiammata. I risultati di questo studio hanno indicato che l’interazione tra il CD40L sulle cellule T attivate e il CD40 sulle cellule B produttrici di RF è cruciale, non solo per la sopravvivenza di queste cellule B autoreattive ma anche per la sintesi di RF. I due segnali necessari e sufficienti per l’induzione della sintesi di RF ad alta affinità in vivo sono risultati essere l’interazione IgG e CD40-CD40L. In assenza di interazione CD40-CD40L, le cellule B RF sono state eliminate (35).

Cho et al. hanno studiato il ruolo dell’interazione CD40-CD40L nella produzione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Nell’AR, la sinovia infiammata ha caratteristiche tumorali. La perpetuazione e l’espansione del pannicolo reumatoide dipendono dalla neovascolarizzazione, poiché l’ampia migrazione delle cellule mononucleate nella sinovia e la crescita eccessiva del pannicolo dipendono dall’esistenza di un ricco letto vascolare. Il VEGF, una glicoproteina dimerica legata all’eparina, è un mediatore centrale dell’angiogenesi e induce la proliferazione delle cellule endoteliali e la permeabilità capillare. È stato dimostrato che la legatura del CD40 sui fibroblasti sinoviali da parte del CD40L sulle cellule T attivate ha portato ad un aumento della produzione di VEGF, che è ulteriormente aumentata in presenza di IL-1, TNF-α e fattore di crescita trasformante β (8). La legatura di CD40 sui sinoviociti RA da parte di CD40L sulle cellule T attivate all’interno della sinovia aumenta significativamente la produzione di TNF-α in modo dose-dipendente (21). Il TNF-α è una citochina chiave nella patogenesi dell’AR. Oltre al TNF-α, la produzione di IL-10 è anche aumentata attraverso le interazioni CD40-CD40L (15). Le cellule T del liquido sinoviale di pazienti con RA esprimono alti livelli di CD40L rispetto alle cellule T del sangue periferico di donatori sani e, dopo l’attivazione in vitro, mostrano un’espressione prolungata e di alto livello di CD40L. I risultati hanno mostrato che l’8,71% delle cellule T del liquido sinoviale di pazienti affetti da RA sono CD40L+ contro l’1,74% del gruppo di controllo (41). Il ruolo potenziale dell’interazione CD40-CD40L nella patogenesi dell’RA ha portato a sforzi di manipolazione farmacologica di questo asse come approccio terapeutico nei pazienti con RA.

(ii) Uso di anti-CD40L MAb in modelli animali di RA. Il trattamento con anti-CD40L MAb sopprime lo sviluppo dell’artrite indotta da collagene, che è un modello animale di RA. Più specificamente, lo sviluppo dell’infiammazione articolare è stato bloccato e l’infiltrazione di cellule infiammatorie del tessuto subsinoviale e l’erosione della cartilagine sono diminuite (14). Nei topi transgenici K/B×N, un modello di artrite Ig-mediata, il trattamento con MAb anti-CD40L diminuiva significativamente lo sviluppo dell’artrite quando veniva somministrato una settimana prima dell’inizio della malattia clinicamente evidente, ma il trattamento non aveva successo quando veniva somministrato nella malattia consolidata (36).

Dermatomiosite/polimiosite. In uno studio che ha analizzato 9 pazienti con polimiosite e dermatomiosite, è stato osservato che le cellule T infiltranti il muscolo erano CD40L+ in tutti e 9 i casi, suggerendo un ruolo potenziale delle interazioni CD40-CD40L nelle suddette entità cliniche (58).

Dermatomiosite