Il Limulus Amebocyte Lysate Test (LAL) è un metodo per la rilevazione e la quantificazione di endotossine batteriche ampiamente utilizzato dall’industria farmaceutica e biotecnologica. Il principio biochimico del test si basa sulla reazione di coagulazione dell’emolinfa del Limulus polyphemus, comunemente noto come granchio a ferro di cavallo dell’Atlantico, in presenza di antigeni con superficie microbica, come lipopolisaccaridi o endotossine batteriche.

La società “Wako Chemicals” è tra le aziende che producono reagenti LAL a livello internazionale grazie alla sua formula unica di un reagente LAL specifico per le endotossine batteriche senza l’interferenza dei beta glucani nei campioni, grazie all’aggiunta di Curdlan carbossimetilato (CMC) coliofilizzato con LAL. Con il marchio PYROSTAR™, questa azienda distributrice di reagenti per la ricerca produce e commercializza reagenti e accessori LAL che rispettano tutte le norme, i regolamenti e gli standard di qualità stabiliti dalla FDA degli USA.

Ora parleremo dei diversi reagenti e accessori con cui Wako contribuisce allo studio delle endotossine batteriche:

In primo luogo, abbiamo il kit Limulus PS Simple Test, che permette di rilevare e quantificare le endotossine senza l’interferenza di altre sostanze coesistenti con l’uso di un adsorbente di affinità per endotossine chiamato Pyrosep™. Con questo metodo, possiamo misurare l’endotossina in un campione lipofilo a condizione che possa essere disciolto in etanolo, come vitamine liposolubili, oli e grassi, albumine, ecc. che normalmente non possono essere misurate con un test Limulus convenzionale. Inoltre, nessun reagente LAL viene sprecato in quanto viene applicato singolarmente nelle fiale del semplice test e può essere utilizzato nella quantità esatta richiesta per la misurazione.

La serie PYROSTAR™ ES-F è una formulazione unica contenente Curdlan carbossimetilato (CMC) coliofilizzato con LAL con l’obiettivo di eliminare l’interferenza con i β-glucani. Il tampone ES sviluppato da Wako contiene alte concentrazioni di CMC, trasformandosi in un reagente LAL specifico per le endotossine. Questo reagente è progettato per essere utilizzato sia nella rilevazione qualitativa delle endotossine attraverso il metodo del gel-clot che per la loro rilevazione quantitativa attraverso i metodi turbidimetrici cinetici (KTA). Uno strumento fotometrico chiamato Toxinometer®, sviluppato da Wako Pure Chemical Industries, Ltd., viene utilizzato per misurare la velocità di variazione della torbidità. I kit PYROSTAR™ ES-F sono disponibili con e senza l’endotossina di controllo standard (SCE): un reagente liofilizzato raffinato da E.coli e utilizzato per confermare la sensibilità del reagente LAL, convalidare i metodi di test del prodotto e preparare controlli di inibizione.

A supporto di questi reagenti, Wako sta anche sviluppando una soluzione di estrazione di endotossine in grado di estrarre le endotossine dalle superfici dove non possono essere estratte con acqua o sale. Il suo uso è raccomandato nei campioni di endotossine su attrezzature e dispositivi che potrebbero essere in contatto con liquidi contenenti sangue o proteine.

Toxinometer® ET-6000 è un lettore computerizzato di incubazione cinetica che può incorporare 3 metodi di test: gel-clot, KTA e KCA (test cinetico cromogenico). Questa apparecchiatura permette di ottenere risultati di gel-clot e KTA dallo stesso campione. Misura simultaneamente fino a 16 campioni con un rischio di contaminazione molto inferiore alla micropiastra e ci permette di archiviare le curve standard. Toximaster® QC7 è il software che fornisce tutte le funzioni per l’elaborazione dei dati e la preparazione dei rapporti per il test LAL con il Toxinometer® ET-6000.

Inoltre, tra gli accessori dei cataloghi LAL di Wako, vediamo anche provette con e senza coperchio in alluminio. Queste provette sono prodotte senza endotossine, in vetro borosilicato e progettate per il metodo del gel-clot. Lo spessore del vetro può essere calibrato specificamente al Tossinometro per un’intensità luminosa e una trasmittanza stabili.

Un altro reagente LAL commercializzato da Wako è il kit KY Color Limulus. Questo reagente è stato progettato per il metodo KCA e può essere utilizzato sia nel lettore cinetico che in un lettore di micropiastre. Comprende un kit multi-test e un kit semplice, ciascuno progettato per un’analisi colorimetrica basata sul tempo, utilizzando un substrato sintetico che genera un colore giallo e che può rilevare specificamente l’endotossina con alta sensibilità.

Bibliografia:

1) Iwanaga, S. Principio biochimico del test Limulus per rilevare le endotossine batteriche. Atti dell’Accademia del Giappone, serie B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, dicembre (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 44 (1994), 21st Annual Meeting of the Society for Antibacterial and Antifungal Agents.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discriminazione tra endotossina e (1-3) beta-D-glucano usando il saggio cinetico turbidimetrico con lisato di amebociti Limulus. Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). 2523. (1990).

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