Test di amplificazione dell’acido nucleico & Le loro prestazioni

I test diagnostici convenzionali, come la coltura e il test immunoenzimatico precedentemente utilizzati per la rilevazione della clamidia mancavano di sensibilità, richiedevano organismi vitali, attrezzature sterili, condizioni di trasporto fastidiose e un campionamento invasivo, compreso l’esame dello speculum nelle donne e i tamponi uretrali negli uomini, che richiedevano un operatore sanitario addestrato e un ambiente clinico con una sala d’esame. Con l’avvento delle tecnologie di test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) per il test della clamidia, ora abbiamo accesso a test più sensibili che possono generalmente consentire l’uso di campioni auto-raccolti da materiale raccolto più lontano dal sito originale dell’infezione (ad esempio, l’urina per un’infezione cervicale), che può di conseguenza contenere meno organismi rispetto ai tamponi raccolti dal medico. Inoltre, le condizioni di trasporto sono meno critiche per le prestazioni del test, il che significa che questi campioni possono essere raccolti al di fuori di un ambiente clinico tradizionale e, in alcuni casi, possono anche essere spediti al laboratorio diagnostico.

Mentre l’avvento dei test NAAT ha rivoluzionato il test della clamidia, ci sono una serie di fattori che dovrebbero essere considerati quando si interpretano i risultati di uno studio o si seleziona un test da utilizzare. Questo include la comprensione di come il test è stato originariamente valutato per l’uso, essere consapevoli di cosa significa un risultato positivo o negativo e quanto è affidabile, e apprezzare come le prestazioni del test possono differire in altri gruppi di popolazione.

Come è stato valutato il test per l’uso?

Sensibilità e specificità sono le due statistiche chiave utilizzate per valutare le prestazioni di un test di screening rispetto a un metodo gold-standard. La sensibilità è la probabilità che un test diagnostico sia positivo, dato che la vera diagnosi è positiva; e la specificità è la probabilità che il test diagnostico sia negativo, dato che la vera diagnosi è negativa. I migliori test di screening hanno un’alta sensibilità e un’alta specificità. Una bassa sensibilità porta ad alti risultati falsi negativi e una bassa specificità porta ad alti risultati falsi positivi. Sono state espresse preoccupazioni riguardo alla validità delle sensibilità e specificità pubblicate dei NAAT per la clamidia, poiché non esiste un test gold standard attuale. Tradizionalmente, la coltura della clamidia è servita come gold standard e si ritiene che abbia quasi il 100% di specificità; tuttavia, se confrontata con le NAAT, la coltura ha dimostrato di avere una sensibilità molto più bassa, poiché rileva solo gli organismi vivi. Di conseguenza, stimare la sensibilità e la specificità di un nuovo test confrontando le sue prestazioni con la cultura, può portare a stime distorte di sensibilità e specificità del nuovo test. Nel tentativo di minimizzare questa distorsione, l’approccio dell’analisi discrepante è stato inizialmente proposto per la valutazione dei NAAT per la clamidia, eseguendo un altro NAAT sul campione per giudicare i risultati “veri”. Se questo test aggiuntivo era positivo, allora il risultato positivo veniva considerato un vero positivo. Sono state sollevate preoccupazioni perché questo metodo può portare a sovrastimare la sensibilità e la specificità; tuttavia, il suo uso è diminuito. Al suo posto, è stato proposto un altro approccio di stima, l’algoritmo dello stato del paziente-infetto (PISA). Sono state proposte diverse versioni di PISA, ma essenzialmente, PISA comporta l’utilizzo di più test per definire il “gold standard”, e la sensibilità e la specificità di un nuovo test viene poi confrontata con questo. Tuttavia, è stato dimostrato che PISA può anche produrre stime distorte dei parametri di performance dei test. In una serie di scenari simulati condotti da Hadgu e colleghi, nessuno degli IC al 95% per le stime di sensibilità e prevalenza basate su PISA conteneva i valori reali. Inoltre, le stime di sensibilità e specificità basate su PISA cambiano notevolmente al variare della vera prevalenza. Tecniche di modellazione statistica più avanzate, come la modellazione a classi latenti, sono state proposte come alternativa per valutare le prestazioni del test. Mentre il PISA è approvato dalla FDA statunitense per la valutazione dei test diagnostici per la clamidia, sia il PISA che la modellazione a classi latenti sono ora utilizzati per la valutazione dei test.

Quanto è affidabile un risultato positivo?

La riproducibilità delle NAAT, una misura del grado in cui i risultati di un test rimangono coerenti su test ripetuti dello stesso campione nelle stesse condizioni di un test diagnostico o di screening, è di primaria importanza. I NAAT hanno avuto notevoli problemi di riproducibilità in passato. Circa un decennio fa, la reazione a catena della ligasi degli Abbott Laboratories (IL, USA) ha avuto problemi molto pubblicizzati che alla fine hanno portato al ritiro del test dal mercato. In una revisione della riproducibilità della clamidia NAAT, Hadgu et al. hanno trovato che, per gli studi che hanno utilizzato la PCR, tra il 37,5 e il 96,7% dei risultati positivi sono stati confermati; e per l’amplificazione a spostamento di filo (SDA), tra il 79,3 e il 93,7% dei risultati positivi sono stati confermati. Un altro studio di Schachter e colleghi ha valutato la riproducibilità e ha trovato che il 96,7% dei risultati positivi usando la PCR, l’83,8% della SDA e il 97,7% della TMA erano confermati. Hadgu et al. hanno osservato che molti dei problemi di riproducibilità nelle NAAT sembrano verificarsi in campioni di basso livello di positività e, di conseguenza, alcuni autori raccomandano di ritestare i campioni con risultati positivi di basso livello come mezzo per ridurre il numero di potenziali risultati falsi positivi. Altri trattano questi campioni positivi di basso livello come veri positivi e non ritengono necessario ripetere il test, perché sostengono che “la mancata ripetizione di un test positivo non significa che il risultato iniziale fosse un falso positivo”. Tuttavia, dato il potenziale impatto di un test positivo per la clamidia su un individuo e il potenziale impatto che una diagnosi positiva può avere sulle relazioni, i risultati positivi dovrebbero essere interpretati prendendo in considerazione la storia sessuale e il quadro clinico dell’individuo e, quando c’è qualche dubbio, dovrebbe essere considerato un nuovo test.

Si dovrebbe anche ricordare che, quando si interpreta un risultato positivo, le NAAT non richiedono organismi vitali. Le NAAT hanno una sensibilità analitica superiore in quanto possono potenzialmente produrre un segnale positivo a partire da una sola copia del DNA o RNA bersaglio nella reazione. Tuttavia, questo alto livello di sensibilità può creare problemi perché, anche se un risultato NAAT positivo potrebbe riflettere un’infezione clinica, il test potrebbe anche amplificare organismi morti o essere positivo come risultato di una contaminazione superficiale (compresa la contaminazione del contenitore nel caso di campioni auto-raccolti) e quindi, produrre una diagnosi falso-positiva. Di conseguenza, è importante che un individuo non venga ritestato troppo rapidamente dopo il trattamento dell’infezione. Alcuni studi hanno esaminato la dinamica della clearance del DNA o dell’RNA della clamidia dopo il trattamento dell’infezione da clamidia. Uno studio su 115 donne con diagnosi di clamidia ha scoperto che, 7 e 14 giorni dopo il trattamento, il 54 e il 21% delle donne, rispettivamente, avevano ancora rRNA rilevabile nei loro tamponi vaginali auto-raccolti. Un altro studio recente ha seguito prospetticamente 59 infezioni cervicali e/o rettali trattate in 52 donne e uomini, e ha valutato la presenza di DNA plasmidico e di rRNA della clamidia in modo sistematico mediante misurazioni sequenziali a tempo multiplo per un periodo di 8 settimane. Questo studio ha rilevato che un’alta percentuale (42%) di infezioni da clamidia è risultata positiva su almeno uno dei campioni prelevati dopo 3 settimane e frequenti risultati positivi intermittenti di clamidia nel tempo. Mentre la possibilità di una nuova infezione non può essere esclusa in nessuno di questi studi, i loro risultati suggeriscono che ripetere il test troppo presto dopo il trattamento può portare a una diagnosi falsamente positiva. Le attuali linee guida del CDC sul trattamento delle malattie sessualmente trasmissibili sconsigliano un test di guarigione a 3-4 settimane dopo il trattamento, e ora raccomandano che le donne non incinte e gli uomini con diagnosi di clamidia debbano essere ritestati 3 mesi dopo una diagnosi positiva.

Quanto è affidabile un risultato negativo?

I risultati falsi negativi dovuti a mutazioni nel gene bersaglio dei test commerciali è un altro problema che può avere un impatto sulle prestazioni del test e sottolinea l’importanza della sorveglianza continua per garantire che qualsiasi calo nei tassi di diagnosi di clamidia non sia dovuto all’introduzione di mutazioni nei ceppi attualmente in circolazione nella popolazione. Un esempio di questo è la variante di clamidia identificata in Svezia nel 2006, con una delezione di 377 paia di basi nel plasmide criptico. Questa scoperta è arrivata dopo l’inaspettata diminuzione del 25% delle infezioni da clamidia tra novembre 2005 e agosto 2006 nella contea di Halland, nel sud-ovest della Svezia. Questo ha avuto importanti ramificazioni nelle diagnosi di infezioni da clamidia, dato che diversi saggi di clamidia disponibili in commercio sono stati colpiti.

Le prestazioni dei test cambiano in diversi gruppi di popolazione?

Un’altra importante statistica usata per descrivere le prestazioni di un test diagnostico è il valore predittivo positivo (PPV). Il PPV è la proporzione di persone che risultano positive al test e che hanno effettivamente la malattia. È legato alla prevalenza della malattia nella popolazione e, all’aumentare della prevalenza, il PPV del test aumenta. A bassa prevalenza, il PPV diminuisce e la percentuale di risultati falsi positivi del test aumenta. La figura 2 qui sotto mostra l’associazione tra PPV e prevalenza per un NAAT con una sensibilità del 90% e diversi livelli di specificità. Vale la pena notare che a basse stime di prevalenza, c’è una brusca diminuzione del PPV, il che significa alti tassi di diagnosi false positive. Questa figura mostra che, al 4% di prevalenza e al 97% di specificità, il PPV è approssimativamente del 50%, il che significa che la metà dei risultati positivi del test NAAT rappresenterà dei falsi positivi, mentre al 99,5% di specificità, la percentuale di test positivi che sono falsamente positivi scende al 12%.

Ci sono implicazioni significative per la salute pubblica dei risultati falsi positivi della clamidia. In primo luogo, le diagnosi falso-positive possono avere un considerevole danno sociale e psicologico su un individuo, così come la sua relazione, un fattore che non dovrebbe essere sottovalutato. In secondo luogo, le stime di incidenza e prevalenza saranno sovrastimate, portando a distorsioni nel monitoraggio della sorveglianza e nei risultati della ricerca; questo ha anche implicazioni per le analisi di costo-efficacia. Infine, risultati falsi positivi porteranno inevitabilmente a un sovratrattamento degli individui.