Abstract

Questo articolo riporta un caso di miasi causata da Hypoderma sinense in un uomo europeo di ritorno da un viaggio attraverso l’India settentrionale. Il paziente mostrava eosinofilia, segni sistemici di infiammazione e gonfiori dolorosi in diverse parti del corpo. La diagnosi è stata confermata dalla sierologia specifica e dall’identificazione molecolare del parassita.

Il genere Hypoderma (Diptera: Oestridae) comprende sette specie di mosche che, allo stadio larvale, possono causare miasi interna. Nei ruminanti domestici e selvatici, la malattia è caratterizzata dalla presenza di gorgheggi sottocutanei nelle regioni dorsale e lombare. 1 Casi umani di ipodermosi sono stati associati a miasi strisciante sottocutanea, 2 oftalmomiasi, 3 e meningite, 4 sebbene i sintomi più comuni siano allergie cutanee accompagnate da eosinofilia. 5,6 In Cina, l’ipodermosi è una delle più importanti infezioni da artropodi nei bovini e negli yak, soprattutto nelle regioni settentrionali del paese 7 dove la sua prevalenza può raggiungere il 90% – 100%. In alcuni casi, ci possono essere 400 larve che colpiscono un singolo animale. 8 Le più alte prevalenze conosciute di ipodermosi umana (0,4%-7%, negli agricoltori) sono state riportate nelle stesse zone. 9 In diversi paesi europei, i trattamenti con formulazioni di ivermectina iniettabili o a spruzzo sono stati utilizzati per il controllo a livello nazionale dell’ipodermosi del bestiame (rivisto da Boulard et al. 10 ), con la conseguente riduzione della prevalenza dell’infezione ad appena lo 0,5%. In effetti, nel Regno Unito, in Irlanda e in Danimarca l’ipodermosi del bestiame è stata eradicata. Di conseguenza, il numero di segnalazioni di infestazioni umane da Hypoderma spp. è stato notevolmente ridotto. 11 Tuttavia, il crescente movimento di persone nel mondo, in particolare da e verso i paesi in via di sviluppo, può esporre i viaggiatori a questi patogeni “esotici” ora.

Questo articolo riporta un caso di ipodermosi umana importata in un uomo europeo di ritorno dall’India settentrionale. Il paziente ha mostrato sintomi gravi che clinicamente assomigliavano a quelli di altre parassitosi, portando a diagnosi iniziali errate di filariosi linfatica, gnatostomiasi e sparganosi. L’estrazione chirurgica delle larve ha suggerito la diagnosi di una probabile miasi, anche se la diagnosi è stata confermata solo quando è stato eseguito un test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) anti-Hypoderma. L’agente causale è stato identificato come Hypoderma sinense con metodi molecolari.

Relazione del caso

Il paziente era un uomo spagnolo di 34 anni che aveva viaggiato a Ladakh, una zona montagnosa nel nord dell’India, come guida turistica nell’agosto 2006. Nella zona si allevano capre e yak. Nell’ottobre 2006, il paziente ha iniziato a notare disagio e dolore addominale. Un mese dopo ha iniziato a soffrire di un’infiammazione dolorosa nella regione inguinale e testicolare destra. Il paziente è stato inizialmente curato in un ospedale di Madrid, dove è stato sottoposto a ecografia, tomografia computerizzata (TC) e risonanza magnetica (RM). Questi hanno rivelato un’infiammazione del midollo spermatico destro più un’adenopatia iliaca e inguinale. Il paziente ha anche mostrato una notevole eosinofilia (5.100 eosinofili/µL, 31,2%). I test del livello di microfilarie nel sangue diurno e notturno hanno dato risultati negativi, come eseguito dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) specifica per la filaria, i test per i parassiti fecali e urinari, e i test sierologici parassitari (filariosi, trichinellosi, toxocariasi, anisakiasi, strongiloidosi), batterici (brucellosi, salmonellosi, tubercolina, micobatterio urinario) e virali. Nonostante i risultati di laboratorio, si sospettava una filariosi linfatica e il paziente è stato trattato con albendazolo (una dose singola di 400 mg) e dietilcarbamazina (6 mg/kg/d/15 d) più prednisone (60 mg/d/5 d). Dopo aver iniziato il trattamento con prednisone, la conta degli eosinofili è diminuita significativamente a 100/µL (0,4%), per poi aumentare nuovamente a 2.590/µL (21,1%) una volta sospeso il trattamento.

Nel gennaio 2007, il paziente è stato inviato all’Ospedale Carlos III di Madrid, questa volta con una coscia sinistra gonfia. All’anamnesi, ha riferito di aver notato gonfiori cutanei leggermente dolorosi, transitori (della durata di 2-7 giorni), eritematosi in diversi punti durante il suo viaggio estivo. All’esame, le tumefazioni sono state rilevate nel midollo spermatico destro, nel terzo superiore della coscia sinistra e nel fianco sinistro (Figura 1). Il paziente non ha mai sofferto di febbre. Al momento della consultazione, il trattamento con prednisone era stato sospeso per 2 settimane e la conta degli eosinofili aveva raggiunto 7.000/µL (41%). Sono stati eseguiti test diretti (cioè, livelli di microfilarie nel sangue e parassiti fecali), sierologici (cioè, anisakiasis, filariasis, schistosomiasis, trichinellosis, toxocariasis, fasciolasis, echinoccocosis, e gnathostomiasis), e parassitologici. Per l’ultimo di questi test, il campione è stato inviato al Centro Internazionale di Riferimento per la Gnatostomiasi in Thailandia. Poiché si sospettava una gnatostomiasi, il paziente è stato ricoverato e trattato con albendazolo (400 mg/12 h/3 settimane). Per evitare di mascherare l’eosinofilia, non sono stati somministrati corticoidi. Il paziente è stato informato che il trattamento sverminante potrebbe mobilitare i parassiti verso la superficie del corpo, consentendo loro di essere rimossi chirurgicamente e identificati, permettendo così di determinare un appropriato ciclo di trattamento. Cinque giorni dopo il trattamento, i gonfiori cutanei del paziente sono diventati estremamente dolorosi e sono apparse due lesioni nodulari, una nella regione glutea e un’altra sulla schiena. L’ecografia ha rivelato un parassita simile a un verme all’interno di ogni gonfiore. Questi due parassiti biancastri di forma ovale (rispettivamente 10 × 3 mm e 6 × 2 mm) sono stati rimossi chirurgicamente. L’analisi morfologica di un frammento di uno dei parassiti ha suggerito che potrebbe essere una larva di mosca (Figura 1). L’altro campione è stato sottoposto ad esame istologico, ma questo non ha fornito risultati utili. Cinque giorni dopo l’inizio del trattamento con albendazolo, la conta degli eosinofili ha raggiunto 29.800/µL (78%), in coincidenza con l’inizio del dolore estremo dovuto ai gonfiori cutanei. Alla fine del trattamento con albendazolo, la conta degli eosinofili è scesa a 18.897/µL (67%). Il trattamento con ivermectina (12 mg/d/2 d) è stato quindi somministrato, a partire dall’8 febbraio 2007. La conta degli eosinofili è diminuita a 2.900/µL (30%), e il paziente è rimasto asintomatico per alcuni giorni, dopo i quali è apparso un altro gonfiore doloroso sulla gamba destra e la conta degli eosinofili è salita a 3.100/µL (34%). Il trattamento con ivermectina è stato ripetuto il 3 marzo 2007, e pochi giorni dopo la conta degli eosinofili era scesa a 1.600/µL (20,6%). Nel frattempo, è stata confermata la sierologia negativa per lo Gnatostoma. Cinque giorni dopo il secondo trattamento con ivermectina, sono ricomparse tumefazioni cutanee molto dolorose in varie parti del corpo che hanno impedito al paziente di svolgere la sua normale routine. Si è quindi deciso di somministrare un trattamento empirico per una potenziale sparganosi basato su casi clinici simili descritti in letteratura. 12 Il trattamento con praziquantel è iniziato il 22 marzo 2007 alla dose di 75 mg/kg/die/3 giorni, ma non sono stati osservati cambiamenti clinici significativi né è stata ridotta la conta degli eosinofili. Alcuni giorni dopo l’inizio di questo trattamento, è stato ricevuto un risultato sierologico negativo per la sparganosi. Poiché il paziente continuava a soffrire di gravi gonfiori cutanei dolorosi e di ipereosinofilia, fu somministrato un terzo ciclo di ivermectina (12 mg/d/3 d). Dopo quest’ultimo trattamento, il paziente è diventato rapidamente asintomatico. Nessun gonfiore cutaneo è ricomparso e la conta degli eosinofili si è rapidamente normalizzata. Il paziente è rimasto asintomatico fino ad oggi, 2 anni dopo.

Rilevamento di anticorpi Anti-Hypoderma spp. Igg Antibodies

Siccome né i molteplici test sierologici né la microscopia eseguiti erano conclusivi, e poiché l’analisi morfologica del frammento larvale suggeriva la miasi (Figura 2), sono stati eseguiti test immunodiagnostici per l’ipodermosi utilizzando sieri retrospettivi e di tracciamento del paziente. Tre campioni di siero consecutivi sono stati inviati al laboratorio della Scuola Veterinaria di Lugo. Gli anticorpi anti-Hypoderma sono stati ricercati tramite ELISA indiretto utilizzando un estratto grezzo ottenuto dai primi istari di Hypoderma lineatum, come descritto da Panadero et al. 13 Sono state testate diverse diluizioni dell’antigene, dei sieri e dell’immunoconiugato seguendo un protocollo precedentemente descritto. 14 La specificità della procedura è stata valutata testando tre sieri umani positivi per lo Gnathostoma. Titoli elevati di anticorpi anti-Hypoderma sono stati rilevati durante il corso della malattia (OD 4,359 il 24 novembre 2006), a 3 mesi post-infezione (p.i.) (il 24 novembre 2006), e dopo il trattamento (OD 3,977 a 7 mesi p.i. e 4,044 a 15 mesi p.i.). Questi alti livelli di anticorpi contro gli antigeni di H lineatum hanno confermato la diagnosi di un’infestazione da larve di estridi.

Identificazione molecolare del parassita

Il DNA genomico è stato estratto dai tessuti del parassita larvale usando il Quantum Prep AquaPure Genomic DNA Kit (BioRad, Hercules, CA, USA). La sequenza ipervariabile del citocromo ossidasi I (cox1) gene che codifica per la regione dal loop esterno 4 (E4) al carbossi-terminale (COOH) della proteina (688 bp) è stato amplificato mediante PCR come precedentemente descritto. 15 I prodotti di PCR sono stati rilevati su 1,6% agarosio-Tris-acetato-EDTA (TAE) gel, purificato utilizzando Ultrafree-DA colonne (Amicon, Billerica, MA, USA), e poi direttamente sequenziato in un ABI-PRISM 377 sequenziatore utilizzando il Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). I frammenti mitocondriali sono stati sequenziati in entrambe le direzioni. Le sequenze sono state allineate usando il programma ClustalX ed esaminate ad occhio. Il confronto a coppie delle sequenze ottenute ha mostrato che sono identiche alla sequenza cox1 di H sinense disponibile nel database GenBank™ (numero di accesso: AY350769).

Discussione

Questa è la prima segnalazione di diagnosi di infestazione umana causata da larve di H sinense in Europa, in un paziente di ritorno dall’India. È molto probabile che l’infestazione sia derivata dal contatto con bovini o yak infestati nella regione – che è endemica per l’ipodermosi – dove il paziente aveva viaggiato. I casi umani di miasi possono verificarsi quando le larve appena schiuse sul manto degli animali infetti entrano in contatto con le mani o le braccia nude. 2

Sulla base dei sintomi clinici del paziente durante la fase iniziale dell’infestazione, e tenendo conto dei risultati ottenuti dai diversi test diagnostici, è stata fatta inizialmente una diagnosi presuntiva di gnatostomiasi, seguita da una di sparganosi. Poiché queste malattie sono molto rare in Spagna, i test sierologici non erano immediatamente disponibili, ma sono stati somministrati trattamenti empirici. Le caratteristiche morfologiche del frammento di larva estratto chirurgicamente suggerivano un’infestazione da Hypoderma spp. L’identificazione delle diverse specie di Hypoderma si basa sull’esame delle caratteristiche morfologiche larvali, 16,17 ma le piccole dimensioni del frammento hanno impedito una completa identificazione. Tuttavia, la presenza di elevati titoli anticorpali anti-H lineatum nel siero del paziente (rilevati con ELISA in tempi diversi) era indicativa dell’infestazione da larve di Hypoderma, a sostegno del precedente sospetto morfologico di miasi. La valutazione della cross-reattività con gli antigeni di altri membri della sottofamiglia Hypodermatinae, cioè Hypoderma bovis, Hypoderma tarandi, Hypoderma diana, e Przhevalskiana silenus (vedi Monfray e Boulard 18 ; Boulard et al. 19 ) è utile quando si esegue l’ELISA preparato con antigeni H lineatum, anche se potrebbero non essere endemici nel paese di origine del paziente.

Il trattamento ripetuto con ivermectina sembrava essere efficace poiché il paziente è diventato rapidamente asintomatico e la conta degli eosinofili si è normalizzata. L’ivermectina è efficace nel trattamento di diverse miasi, ed è una buona alternativa quando la rimozione chirurgica non è fattibile. 20 Questo è importante perché le larve di Hypoderma possono migrare all’interno del corpo per coinvolgere il sistema nervoso centrale 21 o, più spesso, gli occhi, dove causano l’oftalmomiasi. 22 Nel nostro caso, due larve del parassita sono state rimosse chirurgicamente. Considerando che le tumefazioni non avevano alcun foro di respirazione e le dimensioni larvali, è stata fatta una diagnosi di mosca di primo stadio (LI), pronta a mutare in secondo stadio (LII). Inoltre, dopo il primo e il secondo ciclo di trattamento con ivermectina, sono apparse nuove tumefazioni dolorose dovute probabilmente ad altri parassiti non rilevati, e solo al terzo ciclo di ivermectina il paziente è diventato asintomatico. Anche se i casi di miasi umana non sono comuni in Europa, se i sintomi sono indicativi questa malattia dovrebbe essere tenuta presente dai medici che esaminano gli immigrati e i viaggiatori di ritorno da aree endemiche come il Ladakh. Mentre l’analisi sierologica è utile nella diagnosi delle larve Hypoderminae che causano la miasi nei viaggiatori non precedentemente esposti all’infestazione larvale, l’identificazione molecolare è importante. In questo lavoro, il sequenziamento di una sequenza parziale del gene mitocondriale cox1 ha confermato che H sinense è l’agente causale.

Sono stati precedentemente riportati casi umani di infestazione da Hypoderma spp. con H bovis e H lineatum o H tarandi come gli agenti più frequentemente identificati. 2,22 Le segnalazioni di miasi umane associate a H diana o Hypoderma actaeon sono eccezionali. 23,H sinense (Pleske 1926 24 ), è stato a lungo considerato sinonimo di H lineatum. 25-27 Recentemente, la validità di H sinense come specie a sé stante che infetta bovini e yak in Cina è stata dimostrata con metodi molecolari e morfologici. 28 Il suo ciclo di vita endogeno è stato anche descritto. 29 Questa è la prima segnalazione, tuttavia, di H sinense come agente causale dell’ipodermosi umana. Tuttavia, data la difficoltà di stabilire una diagnosi corretta del presente caso, e la scarsità della letteratura, sembra possibile che la diagnosi possa essere stata facilmente mancata in precedenti casi simili. A differenza di altre larve che causano miasi (per esempio, Gasterophilus spp.) Hypoderma spp. può simulare il suo sviluppo larvale (anche se senza raggiungere il terzo stadio completamente maturo) in ospiti umani spesso con gravi conseguenze. La migrazione attraverso l’esofago 29 può aver spiegato il disagio e il dolore addominale inizialmente descritto dal paziente nel presente rapporto.

I casi umani causati dalle specie Hypoderma mostrano spesso una distribuzione stagionale associata al contatto con il bestiame nell’autunno o nell’estate precedente. Miller et al. 30 hanno elencato tre caratteristiche cliniche per aiutare nella diagnosi di infestazione da Hypoderma spp. nell’uomo: (1) comparsa stagionale, (2) aree migratorie transitorie di infiammazione, e (3) elevata eosinofilia. I metodi sierologici sono utili nella diagnosi di casi importati di miasi umana nei viaggiatori di ritorno da aree endemiche. Tuttavia, la conferma è richiesta dall’esame morfologico delle larve recuperate e dalla loro identificazione molecolare.

Gli autori ringraziano il professor Luis Zapatero della Universidad Complutense de Madrid per il suo prezioso aiuto nella caratterizzazione morfologica del frammento di parassita estratto. Si ringrazia anche il Centro Internazionale di Riferimento per la Gnatostomiasi della Tailandia (Università di Mahidol, Bangkok) per aver intrapreso l’analisi sierologica dello Gnatostoma. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e dell’Innovazione spagnolo e dall’Instituto de Salud Carlos III nell’ambito della Rete di Ricerca sulle Malattie Tropicali (RICET RD06/0021/0019).

Dichiarazione di interessi

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da dichiarare.