Di Elizabeth Burke

Martedì 9 agosto 2016

Gli scienziati usano una varietà di tecniche di laboratorio per studiare la causa genetica delle malattie umane. La ricerca spesso utilizza cellule o campioni di tessuto dei pazienti, ma per determinare se una mutazione in un gene specifico può causare i sintomi di un paziente, abbiamo spesso bisogno di modelli animali sperimentali.

Mentre i topi e i ratti sono stati scelte comuni per modellare le malattie umane in passato, l’uso del pesce zebra sta rapidamente guadagnando popolarità. Questo vi sorprende? Lasciami spiegare.

Che cosa sono i pesci zebra?

I pesci zebra sono pesci tropicali d’acqua dolce della famiglia dei pesciolini. In natura, si trovano nei fiumi e negli stagni dell’India, ma ora sono spesso disponibili nei negozi di animali. Il nome “pesce zebra” deriva dalle strisce blu orizzontali su ogni lato del loro corpo.

I pesci zebra, così chiamati per le loro strisce, preferiscono vivere in grandi gruppi chiamati banchi.

Come si può modellare una malattia umana nei pesci?

Anche se gli umani possono sembrare estremamente diversi dai pesci zebra, in realtà siamo molto più simili a loro di quanto si possa pensare. Infatti, il 70% dei geni umani si trovano nei pesci zebra.

Inoltre, i pesci zebra hanno due occhi, una bocca, cervello, midollo spinale, intestino, pancreas, fegato, dotti biliari, reni, esofago, cuore, orecchio, naso, muscoli, sangue, ossa, cartilagine e denti. Molti dei geni e dei percorsi critici che sono necessari per far crescere queste caratteristiche sono altamente conservati tra gli esseri umani e il pesce zebra. Quindi, qualsiasi tipo di malattia che causa cambiamenti in queste parti del corpo negli esseri umani potrebbe teoricamente essere modellata nei pesci zebra.

Perché usare i pesci zebra quando si potrebbero usare i topi?

Mentre i topi sono evolutivamente più simili agli umani perché sono mammiferi, i pesci zebra hanno diversi vantaggi rispetto ai loro concorrenti pelosi.

Un importante vantaggio dei pesci zebra è che gli adulti sono piccoli e preferiscono essere alloggiati in grandi gruppi, o “branchi”. Di conseguenza, richiedono molto meno spazio e sono più economici da mantenere rispetto ai topi.

Il NIH Zebrafish Core ospita centinaia di migliaia di pesci zebra in una struttura all’avanguardia.

Un altro vantaggio è che i pesci zebra adulti si riproducono facilmente (circa ogni 10 giorni) e possono produrre da 50 a 300 uova alla volta. Questo è molto diverso dai topi che generalmente producono cucciolate da uno a 10 cuccioli e possono partorire solo circa tre cucciolate nella loro vita. Gli esperimenti scientifici sono generalmente ripetuti più volte al fine di dimostrare che i risultati sono accurati, quindi avere un animale che può produrre un gran numero di figli più e più volte è utile.

Gli embrioni di zebrafish sono anche deposti e fecondati esternamente, il che permette loro di essere facilmente manipolati in una varietà di modi. La fecondazione in vitro può essere eseguita se necessario. Le uova fecondate ad una cellula possono essere facilmente iniettate con DNA o RNA per modificare permanentemente il loro patrimonio genetico al fine di generare linee di zebrafish transgeniche o knock-out. Lavorare con i topi in questo modo è molto più complicato. Gli embrioni di topo si sviluppano all’interno della madre, e per accedervi e manipolarli la madre dovrebbe essere sacrificata. Per mantenere gli embrioni vivi dopo la fecondazione o l’iniezione, avrebbero bisogno di essere trapiantati in un altro topo femmina, pure.

La larva di zebrafish, lo stadio di sviluppo da tre a trenta giorni dopo la fecondazione, cresce in lunghezza da circa 3,5 a 8 millimetri.

Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono chiari, che permette agli scienziati di guardare le uova fecondate crescere in pesciolini completamente formati sotto un microscopio. La loro trasparenza permette anche la visualizzazione di tessuti etichettati in modo fluorescente negli embrioni transgenici di pesce zebra. Gli embrioni di topo non sono trasparenti e si sviluppano all’interno della madre, quindi l’osservazione dello sviluppo embrionale dal vivo come quello del pesce zebra non è possibile.

Tuttavia, c’è un limite su quali tipi di malattie possono essere studiate nel pesce zebra. Le malattie umane causate da geni che non esistono nel pesce zebra richiedono un modello animale diverso. Inoltre, i pesci zebra non sono modelli utili per le malattie umane che hanno luogo principalmente in un tipo di tessuto o in una parte del corpo che i pesci zebra non hanno (ad esempio, prostata, ghiandole mammarie, polmoni).

Come si usa esattamente il pesce zebra per studiare le malattie umane?

Spesso il DNA di un paziente viene sequenziato per trovare una mutazione in un gene che potrebbe potenzialmente causare i sintomi della sua malattia. Per determinare se la perdita di funzione di quel gene potrebbe causare i sintomi visti nel paziente, lo stesso gene è mutato o “knocked-out” in zebrafish, e poi i pesci sono esaminati per sintomi simili. Anche se è molto più difficile da fare, l’esatta mutazione che il paziente ha può essere introdotta anche nel pesce zebra, questo è chiamato un “knock-in”.

Se uno o più dei sintomi del paziente sono osservati nel modello knock-out o knock-in del pesce zebra, il pesce zebra può essere utilizzato per ulteriori studi per aiutare a determinare perché la mutazione in quel gene causa la malattia. Per esempio, la struttura delle fibre muscolari può essere esaminata per anomalie al microscopio se il paziente ha una malattia muscolare. O se i sintomi della malattia del paziente sono iniziati durante lo sviluppo in utero, gli embrioni di zebrafish knock-out o knock-in possono essere esaminati per i cambiamenti di espressione genica (rispetto agli embrioni senza la mutazione) che potrebbero portare ad uno sviluppo anormale. Per un paziente con una malattia neurologica, i neuroni degli embrioni knock-out possono essere etichettati con fluorescenza per vedere se si formano in modo scorretto.

Oltre a utilizzare modelli di malattia di zebrafish per caratterizzare le malattie umane, i ricercatori possono anche identificare e testare nuovi farmaci per trattare le malattie che vengono modellate. La capacità dei pesci zebra di generare molti embrioni ogni volta che si riproducono li rende particolarmente utili per lo screening di farmaci ad alta produttività.

Quali sono alcuni esempi di malattie umane che sono state modellate con successo nei pesci zebra?

La generazione di un knock-out del gene della distrofina nei pesci zebra ha dimostrato di assomigliare molto alla gravità e alla progressione della malattia umana della distrofia muscolare di Duchenne. I pazienti con la distrofia muscolare di Duchenne sono risultati portatori di mutazioni nella distrofina e dimostrano una debolezza muscolare infantile che peggiora progressivamente. Sia negli esseri umani che nel modello di zebrafish, la perdita di distrofina porta gradualmente a fibre muscolari necrotiche che vengono sostituite da cellule infiammatorie, fibrosi e fibre muscolari di dimensioni anormali.

Questa figura mostra le differenze visive nel muscolo tra larva di zebrafish wild-type (A, B, C) e larva distrofica (A’, B’, C’). Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3484855/

Il melanoma umano è stato anche modellato con successo nello zebrafish. La mutazione più comunemente identificata nei melanomi umani – un singolo cambiamento di aminoacido nel gene BRAF – è stato creato nel pesce zebra per fare un modello knock-in. Poiché i tumori sono causati da una combinazione di diverse alterazioni genetiche, questa linea di zebrafish knock-in è stata utilizzata per lo screening di altre potenziali mutazioni che causano il cancro. Quando un’altra mutazione comunemente osservata nel melanoma del gene SETDB1 è stata aggiunta al pesce zebra knock-in BRAF, si è sviluppato rapidamente un melanoma. Questi risultati hanno contribuito a stabilire che SETDB1 è un gene importante nella crescita del melanoma.

Questi esempi di come gli esseri umani e il pesce zebra possono manifestare la stessa malattia nonostante quanto sembriamo diversi rendono facile capire perché il pesce zebra sta diventando un modello animale ben accettato. Qui nel programma NIH Undiagnosed Diseases, eseguiamo studi utilizzando il pesce zebra come uno dei diversi approcci per indagare il potenziale coinvolgimento di geni alterati nelle malattie estremamente rare dei nostri pazienti. Mentre i topi sono stati il ponte animale predominante tra il banco e il capezzale in passato, studi recenti hanno dimostrato il potenziale di zebrafish per servire come un’alternativa trattabile ai topi. La tempistica dell’adozione del pesce zebra come organismo modello emergente non potrebbe essere migliore, dato che gli studi sui topi spesso non si traducono in esseri umani. Anche se nessun animale può modellare perfettamente una malattia umana, credo che questi piccoli nuotatori a strisce abbiano un grande potenziale per far progredire la ricerca medica in futuro.

Per saperne di più su come i pesci zebra contribuiscono alla scienza biomedica e alla salute umana, visita i siti web del Trans-NIH Zebrafish Initiative e il NICHD Zebrafish Core.