Figura 2

Struttura di uno strumento di immunodosaggio a microlenti. Include l’irradiazione di luce parallela, l’autofocus, l’imaging ad alta risoluzione, il software di analisi intelligente, i sistemi di controllo della temperatura, una piastra di test con micro-lenti a più pozzetti.

3.1. Sistema di irradiazione a luce parallela

LED come fonte di luce parallela produce un’area cilindrica di illuminazione parallela, che è simile a un condensatore originale con i vantaggi di basso costo, lungo ciclo di vita, perfetta prestazione luminosa e piccola scala. Come mostrato nella figura 3, la luce parallela effettiva può essere ricevuta a causa della rifrazione della lente. Nell’area di irradiazione del LED, la lente può cambiare la direzione e la distribuzione della luce configurando la lente pertinente in modo da ottenere la luce parallela effettiva (Figura 3).

Figura 3

Principio del sistema di irradiazione della luce parallela. La lente 1 e la lente 2 focalizzano la luce emessa dal LED. Poi, la luce focalizzata passa attraverso il tunnel ottico e l’apertura per essere proiettata alla lente 3. Infine, la luce parallela effettiva viene acquisita dalla lente.

3.2. Sistema di imaging autofocus ad alta risoluzione

Questo sistema consiste in una fotocamera digitale ad alta velocità e un sistema autofocus. Attualmente, la velocità di imaging di alcune fotocamere digitali commerciali ha superato i 10.000 fotogrammi al secondo. Pertanto, il sistema di imaging ad alta risoluzione può raggiungere il monitoraggio in tempo reale sui cambiamenti dinamici del RI nella soluzione. Una telecamera CCD ad alto pixel svolge un ruolo importante per ottenere un’immagine ad alta risoluzione dei microlenti. I nuclei del sistema di autofocus sono costituiti da identificazione dell’immagine, elaborazione dell’immagine e parti di controllo. Le immagini raccolte dal sistema della telecamera vengono analizzate e viene mostrata la valutazione della chiarezza. Secondo questa valutazione, il sistema viene automaticamente guidato verso un’area o una direzione appropriata fino a quando la risoluzione delle immagini acquisite soddisfa il requisito preimpostato.

3.3. Sistema automatico intelligente di riconoscimento e analisi dell’immagine

Il sistema automatico di analisi intelligente conduce principalmente il riconoscimento dell’immagine e l’analisi dei dati sull’immagine delle microlenti in modo da monitorare la variazione istantanea della sua immagine e quindi dedurre il cambiamento dell’indice di rifrazione della soluzione campione durante il processo di reazione antigene-anticorpo. La sua precisione è strettamente legata alla qualità dell’immagine, e parametri come il pixel, la dimensione del pixel e la risoluzione influenzano direttamente la misurazione dell’RI. Se si sfrutta la telecamera digitale CCD con ≥10 milioni di pixel e piccole dimensioni dei pixel che raggiungono meno di 3 nm e una microlente con raggio di 600 μm, il cambiamento dell’indice di rifrazione è determinato dai cambiamenti del rapporto del punto luminoso centrale e il rapporto del raggio dell’anello esterno in modo che il cambiamento dell’indice di rifrazione misurato possa raggiungere 10-6 .

3.4. Sistema di controllo della temperatura

Il sistema di controllo della temperatura è un pannello di vetro temperato trasparente con una pellicola sottile di ossido di indio-stagno e controllato da un’alta precisione di un regolatore di temperatura PID (proporzionale-integrale-derivativo). Consente alla temperatura del campione nella piastra di prova multipozzetto microlenti di raggiungere rapidamente un valore impostato in 2 min e di essere mantenuto entro la gamma di cambiamento di 0,1 ° C per rendere efficace la reazione antigene-anticorpo .

3.5. Piastra di prova microlens

Una piastra microlens multiwell è appositamente progettata per uno strumento di immunodosaggio microlens. È fatta di materiale polimetilmetacrilato (PMMA) ed è generalmente preparata come 2 o 16 pozzetti trapezoidali per soddisfare diversi requisiti di rilevamento. All’interno di ogni pozzetto, c’è una microlente con un raggio di alcune centinaia di micron sul fondo. L’applicazione della piastra microlente fornisce una condizione oggettiva per il rilevamento multicanale. Poiché il diametro della parte inferiore del pozzetto è di circa 2 mm, diversi microlitri di soluzione campione sono sufficienti per annegare la microlente per la rilevazione dell’antigene-anticorpo.

4. Applicazione del sistema di imaging della microsfera immunitaria

4.1. Misura della reazione antigene-anticorpo

Huang e i suoi colleghi hanno rilevato vari tipi di reazioni antigene-anticorpo e hanno scoperto le loro caratteristiche regolari. In primo luogo, l’indice di rifrazione cambiava con il tempo di reazione nel processo di reazione antigene (Ag)-anticorpo (Ab). In secondo luogo, c’erano tre fasi nella variazione di RI con il tempo di reazione, compresi i periodi rapidamente crescente, relativamente stabile e lentamente decrescente. La prima fase era legata alla combinazione di Ag e Ab in modo che il RI aumentasse improvvisamente con la combinazione rapida di Ag e Ab per formare complessi. Il massimo di RI è nella seconda fase. In terzo luogo, la concentrazione di Ag o Ab ha avuto una grande influenza sul RI. Quindi, ottenendo il cambiamento di RI in funzione della concentrazione di Ag o Ab, il loro contenuto nei campioni testati può essere calcolato mediante una curva di adattamento. In quarto luogo, diversi anticorpi, come l’Ab di cattura e l’Ab di sondaggio, influenzano anche la variazione di RI. Utilizzando questa tecnica per misurare le reazioni antigene-anticorpo da diversi sistemi Ag-Ab, le relazioni tra la variazione dell’indice di rifrazione e le concentrazioni di diversi tipi di soluzioni antigene-anticorpo (interferone-γ (IFN-γ) Ag-Ab, fosfatasi alcalina placentare (PAP) Ag-Ab, callicreina 6 (KLK6) Ag-Ab, gonadotropina corionica umana (HCG) Ag-Ab, troponina cardiaca (cTnI) Ag-Ab, proteine leganti gli acidi grassi (FABP) Ag-Ab, e proteina C-reattiva (CRP) Ag-Ab soluzioni) potrebbe essere ottenuto (Figura 4). Poiché sappiamo che l’associazione e la dissociazione del complesso antigene-anticorpo è un processo dinamico, sulla base della curva di RI vs. tempo e calcolo della derivata di con il tempo, si può anche ottenere informazioni circa le costanti di velocità di associazione e dissociazione e (Figura 4 (a)) e altri parametri termodinamici utilizzando la seguente equazione:

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 4

L’indice di rifrazione cambia con reazioni antigene-reazioni antigene-anticorpo. (a) Relazioni tra l’indice di rifrazione della reazione antigene-anticorpo IFN-γ o PAP e il suo tempo. (b) Le relazioni tra e KLK6 o le concentrazioni dell’antigene CRP sono state determinate, rispettivamente, quando il suo Ab monoclonale o Ab policlonale è stato aggiunto all’antigene corrispondente. (c) Le relazioni tra le concentrazioni dell’antigene e HCG e cTnI o FABP sono state analizzate, rispettivamente, quando il suo Ab di cattura o Ab di sondaggio è stato aggiunto all’antigene corrispondente. Ag: antigene; Ab: anticorpo; : cambiamento dell’indice di rifrazione; IFN-γ: interferone-γ; PAP: fosfatasi alcalina placentare; KLK6: callicreina 6; HCG: gonadotropina corionica umana; cTnI: troponina cardiaca; FABP: proteine leganti gli acidi grassi; CRP: proteina C reattiva.

4.2. Misurazione di campioni clinici

La tecnica di imaging con microsfere immunitarie è stata ulteriormente utilizzata per analizzare campioni clinici. 36 campioni clinici sono stati rilevati da questa per le concentrazioni di CRP Ag. La sua deviazione standard relativa è di circa il 2-10% rispetto all’immunocromatografia, e il coefficiente di correlazione tra i risultati acquisiti con i due metodi raggiunge lo 0,989 (Figura 5). È noto che i campioni di siero clinicamente emolizzati possono influire notevolmente sull’accuratezza dei risultati rilevati con i metodi tradizionali. Al contrario, le immagini della microlente nei campioni emolizzati sono ancora chiare attraverso questa tecnica. Gli errori relativi tra i valori di antigene rilevati nei campioni con emolisi e quelli senza emolisi sono solo circa il 2%, indicando la minore influenza dei campioni di siero emolizzati sulla precisione dei risultati.

Figura 5

Misurazione di 36 campioni clinici per l’antigene della proteina C-reattiva usando l’immunomicroscopia a confronto con l’immunocromatografia.

5. Fattibilità della microsfera immunitaria per la rilevazione di antigeni e anticorpi

La maggior parte degli antigeni sono proteine mentre alcuni sono polisaccaridi, acidi nucleici e altre sostanze, e tutti gli anticorpi sono proteine. Poiché la proteina contiene una grande quantità di amido e carbossile, questi gruppi polari fanno sì che le particelle colloidali producano una carica elettrica dovuta all’azione elettrostatica, e le particelle con la stessa carica si respingono a vicenda. Allo stesso tempo, i gruppi polari che sono fortemente idrofili reagiscono con le molecole d’acqua e formano uno strato di idratazione per produrre un colloide idrofilo, garantendo che la proteina non si agglomeri per formare un precipitato in modo che le particelle colloidali siano uniformemente disperse in una soluzione .

Quando l’antigene è combinato con l’anticorpo, la carica elettrica delle particelle colloidali si riduce o scompare, e lo strato di idratazione anche scompare o diventa sottile. La proteina cambia da colloide idrofilo a colloide idrofobo. Nell’ambiente dell’elettrolita, le particelle colloidali si agglomerano ulteriormente per formare i complessi antigene-anticorpo che possono essere realizzati dagli occhi. Gli indici di rifrazione del colloide idrofilo e idrofobo sono notevolmente diversi. Pertanto, questa tecnica può monitorare i cambiamenti dinamici dell’indice di rifrazione per giudicare se ci sono reazioni di antigene e anticorpo in una soluzione. Una curva standard può essere stabilita secondo una relazione tra la concentrazione di antigene e anticorpo e il loro tempo di reazione. Il complesso diventa più grande con il processo di reazione antigene-anticorpo, e anche il cambiamento dell’indice di rifrazione diventa più evidente. Utilizzando la curva standard, è facile quantificare la concentrazione dell’anticorpo o dell’antigene rilevato.

È stato dimostrato che un anticorpo complementare agli epitopi di diversi antigeni indurrebbe effettivamente un aumento simile dell’RI nella reazione Ag-Ab con il test immunoenzimatico con microlenti. Come mostrato nelle figure 4(b) e 4(c), le misurazioni dell’antigene sono state eseguite utilizzando Ab di cattura e Ab di sondaggio o Ab monoclonale e Ab policlonale per un certo antigene. Dalle curve, possiamo vedere che non c’era alcuna differenza significativa tra i due tipi di anticorpi nell’indurre il cambiamento durante la reazione Ag-Ab, indicando che l’immunoassay di imaging microlenti può utilizzare diversi tipi di anticorpi, sia cattura o sondaggio Ab e monoclonale o policlonale Ab per la rilevazione. Tuttavia, Ab monoclonale è preferito per microlens imaging immunoassay, per esso non solo indurre maggiore in reazione dalla sua maggiore affinità per l’antigene, ma anche ridurre la possibilità di cross-reazione falso positivo, in modo che gli antigeni possono essere rilevati a concentrazioni inferiori. Nel complesso, la reazione incrociata è teoricamente inevitabile per questa tecnica come altri mezzi coinvolti nel test immunologico. In altre parole, la specificità dell’immunomicroscopia dipende completamente da quella degli anticorpi selezionati contro l’antigene bersaglio. Pertanto, è molto importante selezionare gli anticorpi appropriati e ottimizzare il sistema di reazione Ag-Ab.

6. Conclusioni

Questa tecnica di immunomicroscopia può misurare rapidamente e accuratamente il RI di diversi campioni e monitorare in tempo reale i cambiamenti del RI nel processo di reazione di antigene e anticorpo. Il RI si altera con i cambiamenti della concentrazione di Ag o Ab. Quindi, secondo il cambiamento di RI in funzione della concentrazione di Ag o Ab, il contenuto dei campioni può essere calcolato qualitativamente e quantitativamente senza alcuna etichettatura, premodifica, postlavaggio e costosi enzimi. Rispetto ai metodi di rilevamento convenzionali, i vantaggi di questo metodo sono accurati, affidabili, veloci (finiti entro alcuni minuti) e semplici senza inquinamento. Inoltre, il suo limite di rilevamento è basso come pg/ml, che richiede solo alcuni μl abbastanza per eseguire la rilevazione ed è anche adatto per i campioni clinici emolizzati che sono difficili da rilevare con i metodi tradizionali. Inoltre, non è intrusivo per i campioni. Il sistema di irradiazione della luce parallela, il sistema della telecamera ad alta risoluzione, il sistema automatico di analisi intelligente, il sistema di messa a fuoco automatica, il sistema di controllo della temperatura e la scheda di rilevazione porosa con microlenti compongono lo strumento di immunodosaggio della microsfera. È piccolo e facile da trasportare.

È noto che la reazione antigene-anticorpo è notevolmente influenzata dalla propria concentrazione, temperatura, pH e soluzione elettrolitica. Per questo motivo, questi fattori sono presi in considerazione nel sistema di imaging con microlenti per mantenere i dati stabili attraverso il bilanciamento dei loro cambiamenti. Per esempio, questo sistema può essere ottimizzato selezionando materiali adatti per una piastra di test che offra un sito di reazione antigene-anticorpo e rendendo la piastra idrofila per evitare interferenze idrofobiche. La precisione di rilevamento può essere ulteriormente migliorata regolando la proporzione antigene-anticorpo, selezionando un diluente adeguato, modificandoli con ioni metallici, e così via.

Il rilevamento dell’antigene e dell’anticorpo è relativamente significativo nei campi di indagine biomedica, diagnosi clinica, analisi dei farmaci, sicurezza alimentare e monitoraggio ambientale. Con le preoccupazioni della gente sulla salute ambientale, la sicurezza alimentare e l’assistenza sanitaria, lo sviluppo di uno strumento sensibile con basso costo, alta precisione, piccole dimensioni, portabilità e funzionamento semplice è diventato un bisogno sociale pressante. Così, questa tecnica di imaging con microlenti immunitarie è promettente per essere ampiamente applicata a vari campi e appropriata per essere particolarmente diffusa nella comunità e nella campagna.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano che non c’è alcun conflitto di interessi riguardo alla pubblicazione di questo articolo.

Contributi degli autori

Jiahui Liang e Xiaotian Ye hanno contribuito equamente a questo lavoro.

Riconoscimenti

Siamo grati al Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (numero di borsa: 201604020146) e alla National Natural Science Foundation of China (numeri di borsa: 81172824 e 30971465) per il loro supporto finanziario.