A Biology of p38 Kinase
La via di segnalazione p38 MAPK è stata uno degli argomenti più intensamente studiati in biologia dalla sua identificazione iniziale più di 10 anni fa. Il livello di interesse in questo percorso è stato principalmente guidato da due fattori. In primo luogo, questa via di segnalazione è attivata da una vasta gamma di stimoli ed è implicata in numerose malattie, in particolare l’infiammazione. In secondo luogo, la precoce disponibilità di inibitori selettivi della p38 ha fornito gli strumenti critici necessari per delineare ulteriormente il ruolo delle protein chinasi nelle vie di segnalazione e i mezzi per perseguire il potenziale terapeutico dell’inibizione della p38. Infatti, durante gli ultimi 5 anni, un gran numero di inibitori di p38 sono entrati in studi clinici.
Al momento della scoperta della p38 MAP chinasi, il primo membro della famiglia delle MAP chinasi, la chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK), era già stato identificato. Non si sapeva, tuttavia, che esistevano altre due sottofamiglie di treonine/tirosine chinasi a doppia specificità (p38 e JNK). Nel 1994, diversi gruppi di ricerca hanno identificato indipendentemente una nuova attività chinasica (Freshney et al., 1994; Han et al., 1994; Rouse et al., 1994;) e successivamente, la clonazione del cDNA umano ha portato all’identificazione della p38 α (Lee et al., 1994). Poco dopo, sono state identificate altre tre varianti di splice della famiglia p38, p38β, P38y e p38h (Jiang et al., 1996, Jiang et al., 1997, Kumar et al., 1997). Due membri della famiglia, p38α e β, sono espressi ubiquitariamente ma regolati in modo differenziato in diversi tipi di cellule, mentre gli altri due sono più limitati nella distribuzione dei tessuti. Ad oggi, la p38α, che è stata implicata in una serie di malattie, è il membro meglio compreso della famiglia (rivista in Kumar et al., 2003 e Saklatvala, 2004).
L’attivazione della p38 è stata osservata in vari organismi come risposta a molti stimoli. Gli omologhi di p38α nel lievito, nel verme e nella rana sono stati implicati nell’osmoregolazione, nelle risposte allo stress e nella regolazione del ciclo cellulare. Anche la regolazione di p38α nelle cellule dei mammiferi è stata ben studiata (rivista in Zarubin e Han, 2005). È ormai chiaro che la via di segnalazione di p38α è complessa, influenzata non solo dagli stimoli e dal tipo di cellule, ma anche da vari regolatori e combinazioni di chinasi attivanti a monte. È ben noto che ci sono due principali chinasi attivanti a monte per p38α, MKK3 e MKK6. Inoltre, esiste un meccanismo di attivazione di p38α indipendente da MKK che coinvolge la proteina legante (TAB) del fattore di crescita trasformante attivato 1 (TAK1) (Ge et al., 2002). L’attivazione di p38α può essere ottenuta tramite autofosforilazione dopo l’interazione con TAB1. Si suggerisce anche che p38 regoli negativamente la segnalazione di TAK1 fosforilando TAB1 (Cheung et al., 2003). A valle della segnalazione di TAK1 c’è IKK, che serve come fase di attivazione essenziale della chinasi Tpl2 e dei suoi obiettivi a valle, MEK1 e ERK (Waterfield et al., 2004). Così, l’inibizione di p38 provoca l’upregolazione di TAK1, che porta all’attivazione di ERK. Questo spiega perché l’attivazione di ERK è frequentemente osservata in cellule trattate con inibitori di p38α. Questa scoperta evidenzia la necessità di comprendere il potenziale crosstalk non lineare tra le vie di segnalazione delle chinasi. Oltre a TAK1, altre chinasi a monte (MAP3K) sono implicate nell’attivazione di p38α e del suo vicino, JNK. Contribuiscono al processo di attivazione anche piccole proteine leganti GTP come Rac1 e Cdc42 e la loro interazione con PAK (p21-activated kinases) e MLK1.
I substrati a valle delle p38 MAP chinasi sono MAPKAPK2 (Kotlyarov et al., 2002) e MAPKAPK3 (McLaughlin et al., 1996), che fosforilano vari substrati, tra cui la piccola heat shock protein 27 (HSP27), la lymphocyte-specific protein 1 (LSP1), la cAMP response element-binding protein (CREB), il fattore di trascrizione (ATF1), SRF e la tirosina idrossilasi. Di particolare interesse è il substrato di MAPKAPK2 tritetraprolina, una proteina che destabilizza l’mRNA (Tchen et al., 2004). MNK è un altro substrato di p38 che sembra essere coinvolto nell’iniziazione traslazionale, poiché fosforila eIF-4E (Waskewicz et al., 1997). Inoltre, la p38 kinasi attivata (PRAK) e la mitogen and stress-activated protein kinase (MSK1) sono anche note per essere attivate da p38α, sebbene MSK1 sia attivata anche da ERK (Deak et al., 1998). Non sorprende che ci sia un gran numero di fattori di trascrizione che sono regolati da p38 (rivisto in Zarubin e Han, 2005). Alcuni esempi includono i fattori di trascrizione attivanti 1, 2 e 6, la proteina accessoria SRF (Sap1), GADD153, p53, c/EBPb, il fattore di potenziamento dei miociti 2C (MEF2C), MEF2A, DIT3, ELK1, NFAT e la proteina high mobility group-box (HBP1). Altre proteine non correlate, come cPLA1, Na+/H+ exchanger isoform-1 (NHE-1), tau, cheratina 8, e stathmin hanno anche dimostrato di essere substrati per p38α.
Il meccanismo con cui gli inibitori della p38 MAP kinasi sopprimono l’espressione delle citochine infiammatorie è stato sfuggente. L’espressione dei geni infiammatori è altamente regolata sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale. I primi studi che hanno esaminato gli effetti degli inibitori della p38 nei monociti umani hanno suggerito che la regolazione della biosintesi delle citochine infiammatorie (principalmente IL-1 e TNF) avveniva a livello post-trascrizionale. Successivamente, è diventato evidente che la stabilità dell’mRNA può essere influenzata negativamente dall’inibizione della via p38 (Frevel et al., 2003). Questa osservazione ha spinto ulteriori studi a dimostrare che altre proteine della risposta infiammatoria, come la COX-2, erano influenzate in modo simile (Lasa et al., 2000). Altri mRNA che sono stabilizzati da p38 includono MIP-1a, gm-CSF, VEGF, e MMP-1 e -3 (Dean et al., 2004). È interessante notare che anche MAPKAPK-2, un substrato di p38, è coinvolto nella stabilizzazione di mRNA da parte di p38. Forme cataliticamente attive di MAPKAPK-2 stabilizzano l’mRNA reporter, mentre il MAPKAPK-2 dominante negativo ne blocca l’espressione (Winzen et al., 1999).
Una caratteristica comune delle caratteristiche strutturali che influenzano la stabilità dell’mRNA è il motivo ricco di AU nella 3′UTR estesa. Questo motivo è stato descritto per la prima volta da Shaw e Kamen (1986). Ci sono tre classi distinte di tali elementi ricchi di AU (AREs): una contiene un piccolo numero di AREs (come c-Fos), la seconda contiene un numero maggiore di AREs che possiedono pentameri multipli (come TNFα, COX-2, ecc.), e la terza classe contiene AREs senza pentameri, ma contenenti regioni ricche di U. Le ARE mirano all’mRNA per una rapida deadenilazione nelle cellule. In generale, le ARE regolate dalla p38 hanno motivi strutturali simili con pentameri multipli e sovrapposti nelle 3′UTR. Ci sono eccezioni, tuttavia, come MMP-1 e -3 (Reunanen et al., 2002) e tristetraprolin (Mahtani et al., 2001, Tchen et al., 2004), mRNA che contengono almeno un pentamero e sequenze ricche di U. Il meccanismo preciso con cui la p38 regola la stabilità dell’mRNA rimane poco chiaro. Si pensa che la chinasi a valle MAPKAPK-2 sia coinvolta, così come una proteina elusiva ARE-binding. Ci sono diversi candidati (Dean et al., 2004), ma nessuno soddisfa tutti i criteri per essere la proteina che collega le vie p38 e l’mRNA contenente ARE. Tra queste, la tristetraprolina è una possibilità interessante, anche se serve principalmente come “off-switch” nella stabilizzazione dell’mRNA.
Un ampio corpo di dati da studi preclinici indica un ruolo centrale della p38 nelle risposte immunologiche e infiammatorie (Dong et al., 2002; Kracht e Saklatvala, 2002; Kumar et al., 2003). È ormai noto che la via p38 è attivata selettivamente nelle cellule T effettrici Th1 in risposta a IL-12 e IL-18. La produzione di citochine Th1, come l’interferone gamma, è inibita dagli inibitori p38, mentre la produzione di IL-4, una citochina Th2, no. Nei macrofagi, un certo numero di citochine infiammatorie – come TNF, IL-1, IL-6 e IL-8 – sono regolate attraverso le vie p38. Il fibroblasto embrione di topo knock-out MKK3 risponde al TNF, ma non a IL-1, UV, o sorbitolo, indicando così un ruolo per MKK3 in TNF, ma non IL-1 azione. Nei fibroblasti embrionali di topo knock-out p38α, tuttavia, la produzione di IL-6 indotta da IL-1 è gravemente compromessa. Questi dati suggeriscono che diversi ligandi stimolano la funzione di diverse chinasi nel percorso p38. Insieme a un ampio corpo di prove genetiche e farmacologiche in vivo, questi risultati supportano la p38 come un bersaglio valido, la cui inibizione potrebbe fornire un beneficio terapeutico in una varietà di malattie infiammatorie, in particolare l’artrite reumatoide (Foster et al., 2000). Altre possibilità di intervento farmacologico includono l’ipertrofia cardiaca, il morbo di Alzheimer, le lesioni vascolari, la psoriasi e le malattie infiammatorie intestinali.