Traslocazioni e inversioni sbilanciate semplici (classi A e C): meccanismi di origine

Il risultato immediato di questo studio è che in 20 su 37 delle traslocazioni sbilanciate de novo, la duplicazione ha origine materna (Fig. 1, Risorsa online 1: Tabella S2). Poiché l’indagine dell’origine parentale non era informativa o non era possibile in sei casi (casi 7, 14, 23, 24, 33, e 35), le traslocazioni sbilanciate de novo in cui la regione duplicata è di origine materna rappresentano il 64,5% (20/31) dei casi pienamente informativi. Combinando questi dati con la scoperta che in otto di questi casi (casi 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28, e 32) tre alleli (Fig. 1, Risorsa online 1: Tabella S2), due materni e uno paterno, erano presenti almeno in parte della regione di duplicazione, lo scenario emergente è che in non meno del 25% (8 su 31), il driver primario per il verificarsi di traslocazioni sbilanciate de novo è una non-disgiunzione meiotica materna, seguita da una trisomia parziale di salvataggio del cromosoma materno soprannumerario (Fig. 1a). La spiegazione più probabile per la presenza di tre alleli all’interno della regione duplicata, due materni e uno paterno, sarebbe la non disgiunzione alla meiosi materna I (mat-MI) (Fig. 1A.I). In alternativa, una ricombinazione meiotica prossimale o al breakpoint di traslocazione deve aver preceduto una non-disgiunzione nella meiosi II materna (mat-MII). Al contrario, nei 12 casi (4-6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34, e 37) con lo stesso aplotipo duplicato materno non si possono escludere altri meccanismi (Fig. 1b), anche se potrebbero anche derivare o da una non-disgiunzione mat-MI (Fig. 1A.I), dopo un crossing-over telomerico, secondo l’occorrenza preferenziale di crossover telomerico dimostrato per alcuni cromosomi non disgiunti (Oliver et al. 2014) o una non-disgiunzione materna MII (mat-MII) (Fig. 1A.II), come riportato in diversi casi di trisomia di salvataggio (rivisto in Chantot-Bastaraud et al. 2017).

È noto che il ritardo in anafase del cromosoma soprannumerario seguito dal suo intrappolamento all’interno di un micronucleo è alla base di molti eventi di cromotripsia (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). Di conseguenza, in una cellula figlia, il cromosoma soprannumerario viene eliminato, mentre nell’altra, la frantumazione del materiale genomico micronucleare, seguita dalla ri-incorporazione di tutti o di alcuni frammenti all’interno del nucleo principale può comportare una massiccia riorganizzazione del cromosoma originale che o mantiene la maggior parte del suo materiale sebbene riorganizzato in un nuovo ordine, o perde alcune delle sue porzioni (Fig. 1a), quali porzioni del cromosoma soprannumerario originale si perdono e quali si conservano potrebbe dipendere da eventi stocastici, dalla propensione delle estremità rotte a integrarsi tra loro o con altre parti del genoma, e/o dalla successiva selezione delle cellule che possono sopravvivere e moltiplicarsi in presenza di squilibri segmentali minimi. In teoria, i frammenti centrici possono essere conservati come cromosomi marcatori soprannumerari attraverso la loro circolarizzazione con formazione di cromosomi ad anello, superando così l’assenza di sequenza telomerica alle due estremità. La conservazione dei frammenti acentrici interstiziali soprannumerari richiede anche la formazione di un neocentromero o, in alternativa, la cattura del frammento da parte di un altro cromosoma con la formazione di una traslocazione inserzionale de novo. Infatti, Kato et al. (Kato et al. 2017) hanno recentemente riportato un caso di traslocazione interstiziale de novo derivata dalla cromotripsia di un cromosoma soprannumerario presente in uno zigote trisomico. Infine, la conservazione di frammenti soprannumerari dotati di un telomero ad una estremità richiede o una cattura telomerica, ad esempio un cromosoma marcatore soprannumerario traslocato come riportato in Vetro et al. (2012) (casi 2 e 3) o la sua cattura da un altro cromosoma, quello ricevente, che perde la sua porzione distale formando così una cellula a 46 cromosomi con una traslocazione de novo sbilanciata, come descritto qui. Infatti, il caso 6 con la duplicazione dello stesso aplotipo materno (Fig. 1, Risorsa online 1: Tabella S2) illustra il verificarsi di un evento di cromotripsia (Fig. 1a), come mostrato dalla presenza di due regioni duplicate non contigue separate da ~ 1,3 Mb di cui quella interstiziale ha un orientamento invertito (Risorsa online 2: Figura S15). Gli eventi di cromotripsia sono stati osservati in un certo numero di casi di traslocazioni sbilanciate de novo (Weckselblatt et al. 2015), e la maggior parte di essi sono stati riportati per essere di origine paterna e per coinvolgere più di due cromosomi (Marcozzi et al. 2018). Al contrario, la traslocazione sbilanciata nel nostro caso 6 era di origine materna ed effettivamente de novo, in accordo con le indagini FISH delle metafasi dei genitori. Inoltre, almeno a giudicare dalle indagini aCGH e FISH ad alta risoluzione (1M), ha coinvolto solo due cromosomi, mentre è stato escluso un riarrangiamento più complesso. Pertanto, si è tentati di ipotizzare che lo zigote o il primo embrione fosse trisomico per il cromosoma 8 a causa di una non disgiunzione meiotica o postzigotica materna. La frantumazione del cromosoma 8 soprannumerario è stata seguita dal recupero di due sole porzioni non contigue, compresa quella telomerica che, quando già ricucita, è stata acquisita dalla 18q ricevente (Fig. 1a).

Il modello di formazione delle traslocazioni sbilanciate de novo, partendo da uno zigote trisomico, si adatta anche al caso 24, anche se non abbiamo potuto eseguire alcuna indagine molecolare di supporto. Tuttavia, la presenza di una linea cellulare residua trisomica per il cromosoma 9, insieme ad una principale con un cariotipo normale e una terza con la traslocazione sbilanciata t(14;9) suggerisce come, partendo da uno zigote trisomico, si possano formare varie linee cellulari, alcune con la perdita totale del cromosoma soprannumerario e altre con la perdita di una parte di esso (9p) e la sua porzione residua (l’intero 9q) catturata da un altro cromosoma. Questo tipo di mosaico a tre linee cellulari sono stati raramente documentati (Phillips et al. 1997), ma nella diagnosi prenatale i mosaici con una linea cellulare normale e una seconda con una traslocazione sbilanciata de novo sono relativamente comuni e un aumento dell’età materna può essere rilevato nella maggior parte di essi (Kovaleva e Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).

Un supporto indipendente per l’ipotesi che la non-disgiunzione materna sia un fattore scatenante principale per le traslocazioni sbilanciate de novo, è un aumento dell’età materna. Infatti, nei nostri otto casi (casi 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28, e 32), dove la duplicazione era senza dubbio legata ad una non-disgiunzione meiotica materna (due diversi alleli materni all’interno della regione di duplicazione), è stato documentato un aumento dell’età materna media (34,75 anni, Risorsa online 1: Tabella S1), tenendo conto che l’età materna media in Italia nel 2016 era di 31,8 anni (ISTAT, https://www.istat.it/). Un aumento (33,5 anni) è stato riconosciuto anche nei 12 casi (casi 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34, e 37) con duplicazione dello stesso allele materno, compatibile con una non disgiunzione materna come evento iniziatore. Anche nei casi in cui la duplicazione era paterna, un aumento, anche se molto più limitato, è stato mostrato nell’età media materna (32,6 anni), forse indicando che meccanismi diversi dalla non-disgiunzione materna possono giocare un ruolo nella formazione di queste traslocazioni sbilanciate. Infatti, nei quattro casi (3, 8, 29, e 36) analizzati tramite array SNP non era presente alcuna eteroisodisomia materna nella porzione non duplicata dei cromosomi omologhi (Risorsa online 1: Tabella S2), come ci si sarebbe aspettato per uno zigote trisomico in cui il cromosoma paterno soprannumerario avesse subito una cromotripsia con il salvataggio della sola porzione telomerica. Quindi, prendendo anche in considerazione la trascurabile frequenza di trisomie originate da missegregazione nella meiosi paterna (Nagaoka et al. 2012), il verificarsi di traslocazioni sbilanciate innescate dal parziale salvataggio trisomico di uno zigote trisomico di origine paterna appare altamente improbabile. Invece altri meccanismi, come una rottura paterna ereditata o postzigotica a doppio filamento che richiede di essere riparata dalla cattura dei telomeri, sembrano più plausibili (Fig. 1b). Infatti, il caso 25 che è mosaico per due linee cellulari, presenti nel sangue e nei fibroblasti, con una delezione 2q terminale e un cromosoma derivato der(2)t(2q;14q) di origine paterna (Risorsa online 2:Figura S9), si adatta a questa ipotesi. Così, in presenza di una delezione terminale, diversi meccanismi di riparazione possono verificarsi in tempi diversi in diverse cellule dell’embrione precoce, portando alla fine ad una condizione di mosaico. In questo modello, il cromosoma cancellato inizia l’evento di traslocazione, agendo come ricevente, mentre il duplicato è il donatore, operando come riparatore di lesioni (Fig. 1b). Tuttavia, non è possibile discernere se la delezione sia effettivamente il primo evento che porta alla traslocazione o sia invece secondario alla formazione di un cromosoma dicentrico (Fig. 1BIII e IV) che, a seguito della sua rottura asimmetrica, genera un cromosoma inv-dup del e uno semplicemente cancellato, quest’ultimo poi riparato dalla cattura del telomero (Fig. 1b). È possibile che la persistenza del dicentrico oltre le prime divisioni embrionali si traduca in rotture di dimensioni diverse nelle diverse cellule, ancora una volta riparate o dalla telomerasi o dalla cattura dei telomeri.

Segnatamente, qualunque sia il meccanismo, è stata rilevata un’alta prevalenza di casi in cui entrambi gli squilibri hanno la stessa origine parentale (Fig. 1, Risorsa online 1: Tabella S2), nonostante un’origine biparentale di delezione e duplicazione sarebbe attesa nella metà dei casi, secondo un evento finale postzigote. La dimostrazione di una compartimentazione distinta dei due set di cromosomi parentali negli embrioni di topi fino allo stadio di 8 cellule (Du et al. 2017) può fornire una spiegazione. Poiché questo periodo coincide con un’instabilità cromosomica molto elevata, (McCoy et al. 2017), si è tentati di ipotizzare che un meccanismo come la cattura dei telomeri, necessario per la stabilizzazione di una precedente anomalia strutturale, si verifichi sullo stesso set cromosomico parentale dell’anomalia originale. Al contrario, ci si aspetterebbe che ulteriori riaggiustamenti successivi avvengano in modo casuale, coinvolgendo cromosomi di entrambi i genitori, il che porterebbe ad un cromosoma traslocato sbilanciato di origine biparentale, come in effetti abbiamo trovato in cinque casi (casi 10, 12, 27, 30, e 31; Fig. 1, Risorsa online 1: Tabella S2).

Come per i riarrangiamenti di classe C, non abbiamo trovato alcuna peculiarità ai breakpoints di giunzione che potesse chiarire se la loro stabilizzazione per cattura telomerica della porzione cromosomica opposta a quella cancellata sia dovuta ad un meccanismo diverso rispetto ai casi in cui la cattura del telomero dipende da un altro cromosoma. Tuttavia, questa analisi ha potuto essere fatta solo in due casi. La constatazione che in 4 casi su 5 sia la delezione che la duplicazione erano di origine paterna suggerisce che derivano o da una delezione originale o dalla rottura di un cromosoma dicentrico.

Traslocazioni e inversioni sbilanciate complesse (classi B e D)

C’è accordo generale sul fatto che questi riarrangiamenti derivano da un dicentrico intermedio, dopo la sua rottura asimmetrica che porta a un del inv-dup e a un cromosoma semplicemente cancellato (Fig. 1B.III). L’acquisizione di una sequenza telomerica stabilizzante può avvenire attraverso una serie di modalità: aggiunta mediata dalla telomerasi di sequenze TTAGGG de novo, cattura telomerica della porzione distale di un altro cromosoma (Yu e Graf 2010) o della porzione opposta dello stesso cromosoma (Buysse et al. 2009; Fan e Siu et al. 2001), o anche formazione di un cromosoma ad anello (Rossi et al. 2008). I due casi traslocati inv-dup del(8p) che abbiamo potuto genotipizzare (casi 42 e 44) hanno avuto origine, come previsto (Giglio et al. 2001), da NAHR a mat-MI, come dimostrato dalla presenza di due alleli materni e uno paterno nella regione di duplicazione 8p (Risorsa online 1: Tabella S2). Questa ricombinazione anomala ricorrente è mediata da duplicazioni segmentali altamente identiche situate a 8p23 all’interno di un cromosoma 8 normale e uno invertito (Giglio et al. 2001). Nello zigote, il cromosoma dicentrico risultante probabilmente subirà diversi eventi di rottura in diverse cellule, a volte portando ad una condizione di mosaico con una linea cellulare del(8p) e una seconda con l’inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010), o in casi eccezionali anche una terza con l’inv-dup del(8p) che termina con la regione distale di un altro cromosoma (Pramparo 2004). Questi mosaici sono più frequentemente rilevati nella diagnosi prenatale, mentre nella vita postnatale una singola linea cellulare con l’inv-dup del(8p), traslocata o no, è il reperto più frequente almeno nel sangue. Nei nostri tre casi traslocati (casi 42, 43, e 44), i telomeri sono stati donati da 6q, 17p, e Xq, rispettivamente, tutti di origine materna, e con lo stesso aplotipo di duplicazione dei cromosomi materni 6, 17, e X, come previsto per un evento di stabilizzazione avvenuto postzigotico. Nei restanti tre casi (casi 39, 40, e 45), che, come tutti i riarrangiamenti inv-dup del non coinvolgendo 8p, non sono ricorrenti, l’inv-dup traslocato era di origine paterna con alleli paterni identici nella regione di duplicazione, mentre la cattura del telomero è stata fornita da un cromosoma di derivazione paterna in due casi (casi 39 e 49, Online Resource 2: Figure S3, S4) e uno materno nel terzo caso (caso 45), un feto in cui il cromosoma traslocato t(inv-dup5p;3q) era in mosaico con una linea cellulare contenente un inv-dup non traslocato del(5p) (Risorsa online 2: Figura S12). In particolare, la duplicazione 5p è di dimensioni diverse nelle due linee cellulari (Risorsa online 1: Tabella S1), mostrando effettivamente che il cromosoma dicentrico originale presumibilmente presente nello zigote o nell’embrione molto precoce (Fig. 1b), ha subito diverse rotture nelle diverse cellule, oltre l’embrione allo stadio di clivaggio.

Alleli duplicati identici sono stati riportati in buona fede in tutti i riarrangiamenti inv-dup del non-involgimento di 8p, indicando così un’origine intracromosomica di questi riarrangiamenti (Hermetz et al. 2014). Di conseguenza, questi riarrangiamenti traslocati inv-dup sembrano essere il risultato finale di un evento mitotico iniziale, possibilmente nel primo embrione (Voet 2011), come una rottura del doppio filamento seguita da accoppiamento intrastrand in siti relativamente vicini di sequenze omologhe invertite, portando alla generazione del cromosoma dicentrico con una regione interposta di copia normale (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Come già detto, il prodotto reciproco dell’inv-dup del, cioè un cromosoma cancellato, può essere riparato e stabilizzato dalla cattura della porzione distale di un cromosoma non omologo, o del braccio opposto dello stesso cromosoma, dando luogo a una semplice traslocazione o inversione sbilanciata, rispettivamente, come proponiamo per alcuni dei riarrangiamenti elencati nelle classi A e C (Fig. 1b).

Giunzioni breakpoint

Il sequenziamento della giunzione di traslocazione breakpoint potrebbe essere fatto in 26 casi (Risorsa online 1: Tabella S1, Risorsa online 2: Figura S1) anche se in 4 casi la complessità criptica (casi 4, 10, 28, e 51) ha impedito un sequenziamento fine. Alternative non-homologous end joining (alt-NHEJ) o microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) caratteristiche come microhomologies e templated o non-templated piccole inserzioni sono stati rilevati in 16 casi (casi 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50, e 52) (risorsa online 2: Figura S1). Notevolmente, anche se nei casi 18 e 40 il riarrangiamento è avvenuto all’interno di sequenze Alu, la presenza di 5 bp di inserzione breve templata e 4 bp di microomologia, rispettivamente, ha dimostrato che il riarrangiamento non ha realizzato un meccanismo mediato da NAHR ma piuttosto un alt-NHEJ o MMBIR. La NHEJ canonica (c-NHEJ, blunt ends junctions) si è verificata in quattro casi (casi 26, 29, 31, e 43). Nei casi 2 e 38, le giunzioni breakpoint, erano al bordo del retrotrasposone omologo (Risorsa online 2: Figura S13). Questo risultato suggerisce che in una minoranza di casi, i meccanismi di riparazione come la cattura del telomero sono facilitati da queste sequenze. Anche se Robberecht et al. hanno trovato che la maggior parte delle loro traslocazioni sbilanciate de novo erano mediate da NAHR tra LINE, HERV, o duplicazioni segmentali (Robberecht et al. 2013), possiamo escludere un evento NAHR almeno nel caso 2, dove la presenza di due aplotipi materni duplicati, uno traslocato sul cromosoma ricevente, indica chiaramente una non-disgiunzione mat-MI (Fig. 1, Online Resource 1: Table S2), rendendo così impossibile attribuire la traslocazione ad un evento meiotico. Infatti, gli eventi di retrotrasposizione mediati da LINE-1 hanno dimostrato di verificarsi nelle cellule somatiche dell’embrione umano precoce, nelle cellule staminali embrionali umane, e almeno nei topi principalmente nell’embriogenesi (per una revisione Kazazian e Moran 2017), sostenendo che anche nei nostri casi la formazione della traslocazione era un evento postzigotico.

Combinate, queste caratteristiche indicano che meccanismi basati sulla riparazione (c-NHEJ e alt-NHEJ) e meccanismi di riparazione replicativa (MMBIR) sono responsabili della giunzione del cromosoma donatore con quello ricevente, o della porzione opposta dello stesso cromosoma (Fig. 1).

Rapporto genotipo-fenotipo

Anche se le correlazioni genotipo-fenotipo nei grandi riarrangiamenti sbilanciati, come quelli riportati nel nostro studio, sono in generale piuttosto grossolane, i dati che riportiamo aggiungono alcuni ulteriori dettagli anche in questo contesto.

La forte evidenza che alcune traslocazioni sbilanciate hanno origine da uno zigote con un cromosoma soprannumerario che subisce un evento cromotripico, suggerisce che la regione di duplicazione, sebbene apparentemente composta solo dalla regione distale del cromosoma cromotripico, possa contenere frammenti di altre porzioni, come è il caso del nostro caso 6 e come mostrato da Weckselblatt et al. (2015). In questi casi, se la dimensione dei pezzi frantumati è inferiore a quella rilevabile con l’array CGH, il rischio è quello di attribuire il fenotipo anomalo solo ai geni che appaiono duplicati o cancellati, mentre un’ulteriore morbilità potrebbe essere dovuta all’espressione genica anomala generata dalla rottura del TAD (Fukami et al. 2017).

Inoltre, nelle traslocazioni sbilanciate originate dal salvataggio della trisomia parziale, se la cromotripsia avvenisse sul cromosoma soprannumerario di origine paterna, la seguente etero/isodisomia materna per i due cromosomi rimanenti potrebbe generare ulteriore patogenicità (Niida et al. 2018) sia riducendo allo stato omozigote le varianti causa di malattia presenti nella madre allo stato eterozigote, sia per la presenza di geni imprinted che sono espressi solo dall’allele paterno.

Come ultima considerazione, si è tentati di ipotizzare che la scelta di quale telomero viene catturato per la stabilizzazione del cromosoma rotto, possa non essere casuale ma influenzata dalla deregolazione dei TADs (Topologically Associated Domains) originari, creando a sua volta un substrato favorevole per specifici contatti inter-cromosomici e la compartimentazione spaziale della cromatina 3D (Dekker e Mirny et al. 2016).