DR. EDWIN B. ASTWOOD è stato un visionario della moderna endocrinologia. La memoria biografica di Roy Greep e Monte Greer termina così: “Oltre ai suoi specifici contributi di ricerca, il Dr. Edwin B. Astwood è riuscito in una misura raggiunta da pochi nell’abbracciare la vasta area tra le scienze naturali e la medicina clinica”. Per me, questa è la più alta vocazione in endocrinologia.

La fine degli anni ’60 e l’inizio degli anni ’70 sono stati segnati dagli incredibili risultati di due gruppi, quelli dei dottori Andrew Schally e Roger Guillemin, che hanno isolato, caratterizzato e sequenziato gli ormoni regolatori ipotalamici. Il primo ormone regolatore ipotalamico ad essere sequenziato fu il TRH (un tripeptide), il secondo fu l’ormone di rilascio delle gonadotropine (un decapeptide), e il terzo fu la somatostatina con 14 aminoacidi. L’esistenza del GHRH era stata suggerita nei primi anni ’60 da alcuni esperimenti classici di Reichlin (1); egli fece delle lesioni nell’ipotalamo e dimostrò che il contenuto di GH nell’ipofisi diminuiva. Sulla base di questi dati, ha suggerito che ci deve essere un GHRH nell’ipotalamo.

Ho fatto la mia formazione medica a Londra, in Inghilterra, con la mia formazione endocrina sotto il Prof. G. Michael Besser. Una delle conferenze più divertenti a cui partecipavamo regolarmente era la presentazione di casi clinici alla Royal Society of Medicine. Nella mia mente è rimasto impresso il fatto che ogni volta che veniva presentato un paziente con acromegalia, il Prof. Peter Sonksen chiedeva se il paziente avesse o meno prove di un tumore carcinoide. La percezione nel pubblico era “Perché quest’uomo fa sempre questa domanda?” perché tali casi probabilmente non esistono o, se sì, molto raramente!

Nel 1977, mi sono trasferito dal St. Bartholomew’s Hospital (Londra, Inghilterra) all’Università della Virginia. Il mio interesse principale a quel tempo era i tumori ipofisari secernenti PRL e il loro trattamento medico.

Nell’ottobre 1980, una paziente di 21 anni mi è stata indirizzata dalla dottoressa Ann Johanson. Questa paziente aveva amenorrea e galattorrea mentre prendeva un contraccettivo orale per la sostituzione degli steroidi gonadici. Aveva agenesia gonadica dalla sindrome di Turner.

La sua valutazione ha rivelato una fossa pituitaria allargata sulla radiografia del cranio, una massa pituitaria con modesta estensione soprasellare sulla scansione della tomografia computerizzata, e un PRL sierico elevato di 68 μg/L. Il suo GH sierico elevato di 95 μg/L non si è soppresso con il glucosio orale, è aumentato con il TRH e si è soppresso con un’infusione di dopamina. Il suo livello sierico del fattore di crescita insulino-simile (IGF)-I era elevato a 11 U/mL (normale, 0.41-2.2 U/mL).

In base a questi risultati, la diagnosi di acromegalia era chiara. È interessante il fatto che l’altezza della paziente era di 5’3″, che è molto alta per una paziente con la sindrome di Turner. A questo proposito, è stata una fortuna che i sieri siano stati salvati dai precedenti 7 anni. Le sue concentrazioni sieriche di GH erano state elevate per tutto quel periodo di tempo (Tabella 1).

La paziente è stata sottoposta a un intervento chirurgico transfenoidale, che è stato eseguito il 15 gennaio 1981. Sette settimane dopo l’intervento, è stato dimostrato di avere ancora acromegalia; GH sierico era 52 μg/L, e IGF-I era ancora elevato a 7,7 U/mL.

Come parte di una collaborazione in corso, i campioni di patologia ipofisaria era stato inviato al Dr. Kalman Kovacs (St. Michael’s Hospital, Toronto, Canada). Qualche tempo dopo, il dottor Kovacs ha chiamato per darmi i risultati del suo esame del tessuto. Il suo rapporto indicava che questo paziente aveva un’iperplasia somatotrofica e non un tumore ipofisario. Le ragioni che hanno portato a questa diagnosi sono state: 1) il pattern reticulinico era conservato (viene distrutto nei tumori) (Fig. 1); 2) i somatotrofi predominavano, anche se tireotrofi, gonadotrofi e corticotrofi erano intervallati; e 3) la microscopia elettronica dei somatotrofi rivelava un reticolo endoplasmatico ben sviluppato e l’apparato di Golgi, suggestivo di una sintesi ormonale attiva (Fig. 2). Poiché i somatotrofi erano densamente imballati con granuli secretori, questo mi ha suggerito che questo rifletteva l’inibizione del rilascio di ormoni a causa del feedback del GH secreto, presumibilmente aumentando la secrezione di somatostatina (e/o IGF-I).

In base all’istologia ipofisaria, era chiaro che l’ipofisi era stimolata da un fattore estrinseco. Era improbabile che questo fosse dovuto a una mutazione nel recettore GHRH o a un’attivazione costitutiva della proteina G accoppiata al recettore GHRH, perché questo probabilmente si sarebbe verificato in una singola cellula, portando allo sviluppo del tumore e alla rottura del modello reticolare. Pertanto, era molto più probabile che l’ipofisi fosse stimolata da un fattore estrinseco, sia GHRH proveniente dall’ipotalamo che dalla periferia. In secondo luogo, l’acromegalia persistente ha reso imperativo trovare la causa dell’acromegalia di questo paziente. In quel periodo un articolo di Frohman et al. (2) riportava la purificazione parziale e la caratterizzazione di un peptide con attività di rilascio di GH da tumori extrapituitari di pazienti acromegalici.

Una tomografia computerizzata addominale ha dimostrato un tumore di 5 cm di diametro nella coda del pancreas. Il 26 agosto 1981, il tumore è stato rimosso. Era ben incapsulato e all’istologia è stato determinato essere un tumore delle cellule delle isole. Tuttavia, il tumore non era né un tumore a cellule β né a cellule α. Era fortemente positivo per l’enolasi neurone-specifica, e su immunostaining era negativo per GH, insulina, glucagone, calcitonina e ACTH, con colorazione equivoca per la somatostatina.

Il tumore non conteneva GH da immunocitochimica. Nelle prime 2 ore dopo la rimozione del tumore c’è stata una rapida caduta dei livelli sierici di GH da 70 μg/L a 3 μg/L (Fig. 3) (3). La paziente è stata seguita per 18 anni e rimane guarita dall’acromegalia.

La domanda successiva era cosa fare con il tumore pancreatico. A quel tempo avevo la fortuna di avere il defunto Dr. Michael Cronin come collega all’Università della Virginia. Michael venne in sala operatoria con me per aiutarmi ad attuare la nostra strategia attentamente elaborata per gestire il tumore. Metà del tumore fu tagliato a dadini e messo immediatamente in azoto liquido, e l’altra metà fu preparata per la coltura dei tessuti. Quest’ultima è stata inviata a diversi gruppi esperti nello stabilire linee cellulari stabili. Michael Cronin fu in grado di dimostrare che il mezzo che bagnava questo tumore conteneva attività GHRH e stimolava l’adenilato ciclasi (4). Il tumore fu inizialmente fornito al Dr. Wylie Vale al Salk Institute (La Jolla, CA), che successivamente ne diede una parte al Dr. Guillemin. I due gruppi hanno scoperto indipendentemente che conteneva un’elevata attività di GHRH e sono stati in grado di isolare il GHRH dal tumore, caratterizzarlo e sequenziarlo (5-8). GHRH da questo tumore era un peptide di 40 aminoacidi, che ha omologia con i membri della famiglia di peptidi glucagone/secretina/VIP.

Ho scelto l’endocrinologia come mia specialità perché i miei mentori mi hanno inculcato l’importanza dell’applicazione della fisiologia alla comprensione della fisiopatologia e della terapia dei pazienti con malattie endocrine.

Ogni paziente che si vede è un esperimento della natura. Sono stato molto fortunato a ricevere questo paziente che ha permesso a me e ai miei colleghi di fornire il tumore a due gruppi leader che sono stati poi in grado di isolare, caratterizzare e sequenziare il GHRH a lungo cercato. In effetti, il GHRH è stato uno dei primi ormoni ipotalamici ad essere ricercato, ma c’erano state molte false partenze.

C’erano diverse ragioni per cui è stato possibile nel 1982 caratterizzare e sequenziare con successo il GHRH. In primo luogo, i metodi per valutare l’attività degli estratti tumorali erano stati raffinati ed erano molto più sensibili. In secondo luogo, i metodi per il microsequenziamento erano molto migliorati rispetto ai precedenti 10 anni. Ma la terza, e probabilmente la più importante, ragione era che questo tumore conteneva alte concentrazioni di GHRH e pochissima somatostatina. La somatostatina inibisce il rilascio di GH nel biotest, quindi la sua presenza confondeva il controllo della purificazione del GHRH. L’estratto di questo tumore ha notevolmente semplificato il processo (perché aveva alte concentrazioni di GHRH e poca somatostatina era presente), rispetto ai tentativi precedenti utilizzando centinaia di migliaia di ipotalami animali che erano ricchi di somatostatina e avevano concentrazioni molto piccole di GHRH. Questo è stato il primo esempio di un singolo tumore umano utilizzato per identificare e isolare un ormone. La proteina legata al PTH è stata isolata con una tecnica simile utilizzando una linea cellulare tumorale umana.

Come clinici abbiamo tutti la responsabilità di identificare gli esperimenti della natura e cogliere le opportunità di porre domande che sarebbero molto difficili da rispondere in qualsiasi altro modo. Gli esperimenti della natura sono spesso unici, e certamente i 15 o 20 pazienti che sono venuti prima di questo hanno fornito indizi che un tumore da un paziente con secrezione ectopica di GHRH potrebbe rispondere alla domanda sulla natura e la struttura del GHRH. In effetti, il gruppo del Dr. Guillemin successivamente è venuto a conoscenza di un altro tumore del Dr. Genevieve Sassolas (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lione, Francia), e poiché avevano più tessuto da quel tumore, lo hanno studiato più aggressivamente di quello di Charlottesville. Tuttavia, è stato il tumore originale di Charlottesville che ha suggerito che tale tumore potrebbe offrire la chiave per la ricerca di GHRH.

Il successivo studio della fisiologia di GHRH e il suo potenziale terapeutico come trattamento per la carenza di GH nei bambini è stato al centro del lavoro del nostro gruppo negli ultimi 17 anni (9, 10). Inizialmente, abbiamo somministrato GHRH a volontari normali e abbiamo dimostrato la sua efficacia e specificità nell’aumentare le concentrazioni di GH nel siero (11). Abbiamo poi determinato la risposta di GH a un’iniezione acuta di GHRH in bambini con carenza idiopatica di GH (Fig. 4). Molti dei bambini hanno avuto un aumento molto robusto del GH, mentre in alcuni c’è stato un piccolo o nessun aumento (12); la risposta al GHRH è stata maggiore rispetto all’arginina e alla l-dopa. Sulla base di questi risultati, abbiamo proposto che molti bambini con carenza idiopatica di GH soffrono davvero di carenza di GHRH.

Si iniziò quindi una sperimentazione multicentrica del trattamento con GHRH. Questo sembrava particolarmente appropriato perché il GH usato per trattare la carenza di GH era derivato da cadaveri ed era stato implicato nella trasmissione della malattia di Jacob Creutzfeld. Un totale di 24 bambini sono stati trattati; in 10 bambini è stata usata una pompa per somministrare un bolo di GHRH ogni 3 ore. Questa via e questa dose sono state scelte per imitare la normale fisiologia di circa un impulso di GH ogni 3 ore nei bambini in crescita. Inoltre, 10 bambini sono stati trattati con la pompa ogni 3 ore solo durante la notte, e 4 bambini hanno ricevuto due volte al giorno iniezioni sc di GHRH. Le velocità di crescita nei bambini prima e a 6 mesi di trattamento sono mostrate in Fig. 5 (13).

Sulla base dei risultati di questo studio, Serono Laboratories, Inc. ha iniziato uno studio multicentrico di 12 mesi con GHRH(1-29)-NH2 somministrato sc una volta al giorno (14). I bambini che stavano crescendo più lentamente hanno avuto il più grande aumento della velocità di crescita (Fig. 6). Questo suggerisce che GHRH può ripristinare la secrezione fisiologica di GH. GHRH è approvato dalla Food and Drug Administration per uso diagnostico, così come per il trattamento della carenza di GH nei bambini. GHRH è sicuro e accelera efficacemente la velocità di crescita nella maggior parte dei pazienti con deficit di GH.

Al momento della sintesi di GHRH c’era un grande interesse nella down-regolazione della risposta gonadotropinica all’ormone di rilascio delle gonadotropine. Siamo stati incuriositi da un’osservazione in un altro paziente con secrezione ectopica di GHRH da un tumore carcinoide metastatico che ha dato origine all’acromegalia. Nonostante i livelli di GHRH persistentemente elevati per tutto il periodo di 24 ore, il modello di rilascio di GH era ancora pulsatile, indicando che ci sono presumibilmente altri fattori che sono coinvolti nella regolazione del modello pulsatile della secrezione di GH (15). È stato suggerito che questo può essere dovuto al ritiro della somatostatina. Quindi, la secrezione ectopica di GHRH dimostra inequivocabilmente che un agonista GHRH a lunga durata d’azione può aumentare la secrezione pulsatile di GH. Studi di infusione continua di GHRH in iv in soggetti normali dimostrano lo stesso fenomeno e, quindi, è chiaro che una preparazione depot di GHRH può essere un utile agente terapeutico.

Il nostro gruppo (16) e Mayo (17) hanno clonato il recettore GHRH. È interessante che il recettore GHRH è un membro della classe B dei recettori accoppiati alla proteina G, che comprende i recettori per la famiglia di peptidi glucagone/secretina, così come CRH, calcitonina e ormone paratiroideo. La loro struttura è totalmente diversa da quella dei recettori più grandi della rodopsina (famiglia A). Tuttavia, anche in questa famiglia di recettori ci sono sette domini transmembrana-spanning.

Il ruolo critico del GHRH è dimostrato dal topo nano lit che ha una mutazione puntiforme nel recettore GHRH (18, 19). Wajnrajch et al. (20) hanno descritto una mutazione senza senso (Glu 72stop) nel recettore umano di GHRH che provoca il fallimento della crescita e la carenza di GH in due bambini della stessa famiglia musulmana indiana. Maheshwari et al. (21) hanno descritto una parentela nella valle di Sindh in Pakistan con la stessa mutazione. I membri di questo gruppo sono di statura estremamente bassa. Un’altra mutazione nel recettore è stata descritta in una grande famiglia brasiliana che comprende oltre 110 individui affetti da grave carenza di GH e da statura estremamente bassa (22). Questi esperimenti della natura dimostrano che un difetto nel recettore GHRH compromette la crescita normale e sottolinea l’importanza vitale di GHRH.

Una vignetta del recettore GHRH è mostrato in Fig. 7 (10). L’acido aspartico in posizione 60 dal codone di inizio è il sito della mutazione del topo acceso. Western blotting utilizzando un antisiero del recettore GHRH C-terminale che è stato sollevato ad un peptide basato sulla sequenza del recettore GHRH umano è stato utilizzato per studiare le membrane da cellule HEK293 trasfettate con DNA complementare per il recettore GHRH. Gli studi indicano che il recettore del topo acceso viene tradotto in proteina ed è effettivamente presente nella membrana delle cellule ipofisarie del topo acceso. Abbiamo proposto che questa mutazione porta ad un cambiamento nella struttura terziaria del recettore, che impedisce il legame (23). Utilizzando foto sonde di affinità, la nostra prova suggerisce che altri siti sono in prossimità di legato GHRH, indicando che diversi siti di interazione sono probabilmente richiesti per la trasduzione del segnale. La disponibilità di recettore ricombinante rende la ricerca di agonisti non peptidici GHRH fattibile.

In conclusione, la conoscenza raccolta da un’attenta osservazione di un singolo paziente con acromegalia ha portato all’isolamento, caratterizzazione e sintesi di GHRH. Ulteriori studi hanno portato all’introduzione del trattamento della carenza di GHRH. Successivamente, noi e altri siamo stati in grado di clonare il recettore per il GHRH. Gli studi con GHRH hanno confermato che è essenziale per la sintesi di GH e la crescita normale. Questa posizione è ora convalidata dalle osservazioni che le mutazioni del recettore GHRH, che risultano nella sua inattivazione, portano a profonda carenza di GH e grave bassa statura e completano il cerchio della nostra comprensione della regolazione GH da GHRH.

Acknowledgements

Ringrazio i miei molti colleghi che hanno dato importanti contributi a questo lavoro, così come la signora Suzan Pezzoli per l’assistenza nella preparazione di questo manoscritto.

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni NIH HD-13197, DK-32632, e DK-45350 (a M.O.T.) e dalla sovvenzione RR-00847 (al General Clinical Research Center e al CDMAS Laboratory dell’Università della Virginia.