Study design

In questo studio a due bracci, in doppio cieco, randomizzato, recluteremo 60 donne incinte di età compresa tra 19 e 42 anni che vivono a Vancouver, BC, Canada. Le partecipanti saranno randomizzate a integrare ogni giorno per 16 settimane con 0,6 mg/giorno di acido folico o una dose equimolare (0,625 mg/giorno) di acido (6S)-5-metiltetraidrofolico (Fig. 2). La dose di 0,6 mg corrisponde ai livelli trovati nelle principali marche commerciali di vitamine prenatali (Materna®), aumentando così la generalizzabilità dei nostri risultati. L’intervento di 16 settimane è stato basato sull’emivita stimata del folato RBC e intende consentire la misurazione dello stato a lungo termine del folato nelle RBC (dopo 12-16 settimane). Tutti i partecipanti riceveranno anche un multivitaminico prenatale non contenente alcun folato, per garantire l’adeguatezza di altri nutrienti (ad esempio, il ferro) durante la gravidanza. Campioni di sangue venoso a digiuno saranno raccolti al basale e alla fine del periodo per misurare le misure di risultato primario, compresi i folati del siero, i folati RBC e l’UMFA del plasma; le misure esplorative includeranno la S-adenosil-metionina del plasma, la S-adenosil-omocisteina, l’omocisteina totale, la cisteina totale, la metionina, la vitamina B12, il piridossal-5-fosfato, la colina libera e la betaina. Verrà anche determinata la genotipizzazione delle varianti MTHFR (677 C > T, rs1801133, e 1298 A > C, rs1801131) e DHFR (rs1643649 e rs70991108) e un emocromo completo. Le donne avranno l’opzione di continuare nella fase postpartum (esplorativa) dello studio, dove alla loro visita finale saranno dati più integratori da prendere fino a circa 1 settimana dopo il parto. Nei giorni 5-7 postpartum, le donne forniranno un piccolo campione di latte materno (3 ml) e un campione di sangue venoso non a digiuno. I risultati valutati nel latte materno includeranno forme di folato (UMFA, THF, 5-metil-THF, 5-formil-THF e 5,10-metenil-THF) e FBP del latte. I risultati valutati nel campione di sangue postpartum comprenderanno folati RBC e plasma UMFA. Il protocollo dello studio è stato sviluppato in conformità con il 2013 Standard Protocol Items: Recommendation for Interventional Trials (SPIRIT) linee guida (Fig. 3) . Vedere il file aggiuntivo 1 (lista di controllo SPIRIT) per ulteriori dettagli.

Diagramma di flusso dei partecipanti

Standard Protocol Items: Recommendation for Interventional Trials (SPIRIT) programma di arruolamento, interventi e valutazioni

L’obiettivo primario di questo studio pilota è quello di ottenere stime per il cambiamento in folati sierici, folati RBC e UMFA dopo la supplementazione con (6S)-5-metiltetraidrofolico e acido folico per 16 settimane di gravidanza per informare il disegno di un trial definitivo adeguatamente alimentato. L’obiettivo secondario è quello di ottenere i tassi di reclutamento e di partecipazione per aiutare nella progettazione e la fattibilità di uno studio definitivo. Gli obiettivi esplorativi della fase postpartum sono di quantificare la proporzione di folato totale del latte materno come acido folico in ciascun gruppo, valutare la correlazione tra l’UMFA plasmatico materno postpartum e l’acido folico del latte materno, e valutare le concentrazioni di folato RBC dopo il parto in ciascun gruppo.

Partecipanti, reclutamento e consenso informato

Criteri di inclusione: (1) donna incinta (gravidanza singola); (2) residente nell’area maggiore di Vancouver; (3) gestazione ≤ 21 settimane al momento del consenso; (4) 19-42 anni di età; e (5) in grado di fornire il consenso informato.

Criteri di esclusione: (1) condizioni mediche preesistenti note per avere un impatto sullo stato materno dei folati (malattie malassorbenti e infiammatorie intestinali, malattia celiaca attiva, chirurgia di bypass gastrico, gastrite atrofica, epilessia, malattia epatica avanzata, dialisi renale, diabete mellito tipo 1 o 2, tratto falciforme/anemia); (2) fattori dello stile di vita noti per avere un impatto sullo stato materno dei folati (fumo attuale, consumo di alcol, uso di droghe ricreative); (3) rischio medio-alto di sviluppare una gravidanza affetta da NTD (si applica alle donne o al loro partner maschile: storia personale o familiare (genitori o fratelli) di altre anomalie congenite sensibili al folato, storia personale di NTD o una precedente gravidanza affetta da NTD); (4) farmaci noti per interferire con il metabolismo delle vitamine B (cloramfenicolo, metotressato, metformina, sulfasalazina, fenobarbital, fenitoina, primidone, triamterene, barbiturici); (5) indice di massa corporea (BMI) pre-gravidanza ≥ 30 kg/m2; o (6) allergia a qualsiasi ingrediente degli integratori dello studio.

Dimensione del campione

La dimensione del campione è stata calcolata in base all’obiettivo primario di stimare la distribuzione (media ± deviazione standard) del cambiamento nei risultati primari (folati sierici, folati RBC e UMFA) dopo 16 settimane di integrazione. Per raggiungere questo obiettivo, avremo bisogno di 50 donne (25 in ogni gruppo); un campione di almeno n = 50 è generalmente riconosciuto come adeguato per gli studi pilota di ricerca clinica. Un’inflazione del 20% sarà aggiunta per tenere conto delle partecipanti che si ritirano o che perdono al follow-up; così, un totale di 60 donne (30 in ogni gruppo) sarà reclutato.

Reclutamento

I manifesti saranno esposti al BC Women’s Hospital, nelle cliniche mediche e prenatali e negli esercizi commerciali per donne incinte (ad esempio, corsi prenatali, studi di fitness, negozi di abbigliamento premaman) in tutta Vancouver, BC, Canada. I dettagli dello studio saranno condivisi con il personale e gli operatori sanitari, tra cui medici, ostetriche, infermieri e altri, a seconda dei casi. La pubblicità sui social media (Facebook e Instagram) sarà usata e indirizzata alle donne incinte di età compresa tra i 19 e i 42 anni nell’area maggiore di Vancouver, BC.

Ricevere il consenso informato e confermare l’ammissibilità

Le donne interessate a partecipare contatteranno direttamente il coordinatore della ricerca (KMC). In questo momento, i dettagli dello studio, l’idoneità e il consenso informato saranno descritti. Le partecipanti idonee che desiderano essere arruolate riceveranno un ID dello studio e la loro visita di riferimento sarà programmata. I partecipanti saranno istruiti a continuare qualsiasi integrazione prenatale multivitaminica/folata fino alla loro visita di riferimento. La fase post-partum opzionale dello studio sarà descritta nel modulo di consenso informato; tuttavia, i partecipanti che scelgono di continuare oltre le 16 settimane primarie riceveranno un modulo di consenso separato da firmare.

Visite dello studio

Le visite dello studio saranno facilitate a Vancouver, BC, Canada presso l’Università della British Columbia, Food, Nutrition and Health Building e nell’unità di valutazione della ricerca clinica del BC Children and Women’s Hospital. Linea di base (8-21 settimane di gestazione): Sia il partecipante che il coordinatore della ricerca (KMC) firmeranno il modulo di consenso informato; una copia sarà scannerizzata e inviata via e-mail al partecipante dopo la visita dello studio. I partecipanti completeranno un questionario di base per acquisire la storia medica e nutrizionale e i dati demografici. Un questionario di frequenza alimentare convalidato sarà utilizzato per calcolare i DFE. Il peso e l’altezza saranno rilevati utilizzando una bilancia elettronica e uno stadiometro e registrati rispettivamente a 0,1 kg e 0,10 m. Verrà raccolto un campione di sangue venoso a digiuno di 12 ml per 3 ore. I partecipanti riceveranno i loro integratori di studio (acido folico o (6S)-5-metiltetraidrofolico) e saranno dotati di un diario per registrare l’assunzione giornaliera. Midpoint: dopo 8 settimane, tutte le donne saranno contattate per verificare la conformità, per rispondere a qualsiasi domanda o preoccupazione e per programmare una visita endline. Fine (24-37 settimane di gestazione): sarà raccolto un campione di sangue venoso di 12 ml, 3 ore a digiuno, il peso sarà misurato come descritto sopra e le partecipanti completeranno un questionario finale per determinare qualsiasi cambiamento nello stato di salute o nell’uso di farmaci dal basale. I partecipanti restituiranno il loro diario degli integratori e tutte le capsule rimanenti saranno contate. Postpartum: alla visita finale, le partecipanti che hanno intenzione di allattare e che hanno un congelatore domestico funzionante possono continuare nella fase postpartum dello studio. Una volta ottenuto il consenso tramite un secondo modulo di consenso informato, verranno dati loro degli integratori da continuare a prendere fino a circa 1 settimana dopo il parto e un nuovo diario degli integratori. Le partecipanti saranno istruite su come raccogliere un piccolo campione di latte materno (3 ml) a casa loro nei giorni 5-7 dopo il parto e riceveranno tutto il materiale necessario (descritto più dettagliatamente nella sezione “Raccolta e trattamento del latte materno”). I partecipanti conserveranno il loro campione di latte materno nel congelatore e avviseranno il coordinatore della ricerca quando sarà pronto per il ritiro. Il ritiro avverrà entro 4 giorni dalla notifica e in quel momento verrà prelevato un campione di sangue venoso di 12 ml. Le donne saranno istruite a prendere il loro supplemento di folati 2 ore prima della raccolta di entrambi i campioni di latte materno e di sangue al fine di standardizzare il picco nel plasma UMFA (e potenzialmente l’assorbimento di UMFA nel latte materno, tuttavia, i tempi di questo processo non ben descritto).

Supplementi dello studio

L’acido folico e (6S)-5-metiltetraidrofolico saranno forniti separatamente dalle multivitamine prenatali. Questa decisione è stata presa perché alcune donne riportano intolleranza quando consumano multivitaminici prenatali; questo è tipicamente dovuto all’alto contenuto di ferro e si risolve dopo il primo trimestre. In caso di intolleranza temporanea, i partecipanti possono saltare o prendere una mezza dose del loro multivitaminico, pur continuando a integrare con la dose completa di folato. Gli ingredienti di base per l’acido folico e i multivitaminici prenatali sono stati forniti da Natural Factors (Coquitlam, BC, Canada). L’acido (6S)-5-metiltetraidrofolico alla rinfusa (Metafolin®) è stato fornito dalla Merck & Cie (Schaffhausen, Svizzera). Tutti gli ingredienti di base sono stati composti in capsule gel vegetali da Natural Factors (Coquitlam, BC, Canada). Le capsule di acido folico e (6S)-5-metiltetraidrofolico sono identiche nell’aspetto per consentire il doppio controllo. Il multivitaminico prenatale contiene la stessa formulazione di micronutrienti della WN Pharmaceuticals Ltd.® Prenatal (NPN 80025456), tranne l’acido folico che è stato rimosso. Un riassunto generale della qualità è stato completato per tutti gli integratori dello studio da Natural Factors (Coquitlam, BC, Canada) e verificato da Health Canada, con conferma delle dosi di acido folico e (6S)-5-metiltetraidrofolico tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni. Un avviso di autorizzazione per la domanda di sperimentazione clinica (Submission No. 244456) è stato fornito dalla direzione dei prodotti sanitari naturali e non soggetti a prescrizione di Health Canada il 26 luglio 2019.

Doppio cieco, randomizzazione e fornitura di confezioni di integratori

Un assistente di ricerca indipendente di Natural Factors (Coquitlam, BC, Canada) assegnerà codici di cieco (A o B) agli integratori di acido folico e (6S)-5-metiltetraidrofolico. Le bottiglie di integratori di folato saranno etichettate con “A” o “B” e indicheranno che “le capsule sono o acido folico o folato”. Sia i partecipanti che il team di ricerca primario saranno in cieco rispetto all’assegnazione dei supplementi, che saranno decodificati solo una volta completate le analisi statistiche finali. La sequenza di randomizzazione sarà generata al computer da uno statistico indipendente, utilizzando blocchi di quattro che contengono ciascuno due partecipanti per gruppo di integratori. Il team di ricerca primario sarà cieco alla sequenza di randomizzazione. Alla visita di base di ogni partecipante, il coordinatore della ricerca (KMC) smaschererà l’assegnazione (A o B) solo per quell’ID di studio al fine di fornire gli integratori assegnati. Al basale, i partecipanti riceveranno un pacchetto di integratori contenente tutte le capsule per l’intervento di 16 settimane; se i partecipanti scelgono di continuare la fase postpartum dello studio, riceveranno altri integratori alla loro visita di fine studio per continuare a prendere fino a ~ 1 settimana postpartum.

Medicine concomitanti

Una volta arruolati, non ci saranno restrizioni sull’assunzione di farmaci durante il periodo di intervento; tuttavia, tutti i farmaci devono essere riportati. L’unica eccezione saranno i supplementi nutrizionali contenenti folati/acidi folici, che non saranno consentiti per tutto il periodo di intervento.

Strategie per migliorare l’aderenza

Le donne in gravidanza tendono ad essere altamente motivate e sono generalmente interessate a partecipare a studi di ricerca clinica. Secondo un sondaggio della Public Health Agency of Canada, il 94% delle donne della British Columbia assume multivitaminici prenatali durante la gravidanza. Pertanto, i partecipanti saranno probabilmente abituati all’integrazione giornaliera al momento dell’arruolamento. Il coordinatore della ricerca (KMC) contatterà ogni partecipante a metà percorso (8 settimane dopo la loro visita iniziale) per rispondere a qualsiasi domanda o preoccupazione. Inoltre, la confezione dell’integratore consentirà la conservazione organizzata degli integratori a casa e il diario dell’integratore servirà come promemoria quotidiano per migliorare l’aderenza durante le 16 settimane. Per questi motivi, prevediamo un’alta aderenza (> 90%) al protocollo dello studio.

Raccolta ed elaborazione dei campioni di sangue

I campioni di sangue venoso (12 mL totali) saranno raccolti in una provetta da 6 mL di acido etilendiamminotetraacetico

(EDTA), una provetta da 2 mL EDTA e una provetta da 4 mL di siero (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) alle visite basali, endline e postpartum (se applicabile). Il prelievo di sangue al basale e alla fine del periodo di riferimento avverrà dopo un digiuno di 3 ore; questo lasso di tempo è sufficiente per ridurre l’influenza confondente dell’assunzione recente di folati sulle concentrazioni sieriche. Il campione di sangue postpartum (~ 1 settimana dopo il parto) non sarà a digiuno, in quanto ciò non influenzerà i folati RBC e ridurrà il carico sui partecipanti. Dopo la raccolta, le provette saranno protette dalla luce, invertite delicatamente secondo le raccomandazioni dei produttori, messe in un refrigeratore e trasportate in laboratorio per l’elaborazione immediata (entro 2 ore dalla raccolta).

Per la preparazione dell’emolisato di sangue intero, il sangue intero (0,3 mL) sarà rimosso dalla provetta EDTA da 6 mL e diluito 1/11 aggiungendo 3,0 mL di una soluzione di acido ascorbico all’1% e successivamente incubato a 37 °C per 30 minuti. La provetta EDTA da 6 mL sarà poi centrifugata a 3000 rpm per 15 minuti a 4 °C. Il plasma sarà raccolto e (solo per i campioni della linea di base e della linea finale) il contenuto rimanente della provetta EDTA da 6 mL sarà trattato per l’isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) con il protocollo di isolamento SepMate PBMC (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada). La provetta EDTA da 2 mL sarà usata per un conteggio completo del sangue. La provetta da 4 ml di siero sarà lasciata a temperatura ambiente per circa 30 minuti (fino alla coagulazione) e poi centrifugata a 3000 giri per 15 minuti a 4 °C; il siero sarà raccolto. Tutte le aliquote saranno conservati a – 80 ° C fino a ulteriori analisi.

Raccolta del latte materno e l’elaborazione

Le donne saranno istruiti a raccogliere il latte materno nei giorni 5-7 post-partum tra 13:00 e 14:50 (come concentrazione media di folati durante questo tempo sembra essere rappresentativo delle concentrazioni medie di folati in un periodo di 24 ore), 2-3 ore dopo la loro ultima espressione completa. I partecipanti esprimeranno completamente il latte materno (manualmente o con pompa elettrica) dal seno destro. Una volta espresso il latte materno, le donne saranno istruite a mescolare delicatamente il latte e poi, usando una pipetta falcon sterile, trasferiranno 0,5 mL in due crioconserve ambrate (ciascuna contenente 0,005 g di acido ascorbico per una diluizione dell’1%) e 1 mL in due crioconserve ambrate. Tutte le crioviali saranno chiaramente contrassegnate ai livelli di 0,5 e 1 ml. Le donne metteranno tutte le fiale in una scatola di congelamento che sarà conservata nel congelatore per un massimo di 4 giorni. I campioni saranno prelevati congelati e trasferiti al laboratorio per la conservazione a – 80 °C fino a ulteriori analisi.

Analisi di laboratorio

Il folato sierico (nmol/L) e il folato RBC (nmol/L) saranno analizzati mediante saggio microbiologico, come raccomandato a livello mondiale, utilizzando il metodo della piastra microtiter descritto da Molloy et.al . Il folato RBC (nmol/L) sarà calcolato con la seguente formula :

Bomarcatori plasmatici inclusi UMFA (nmol/L), S-adenosil-metionina (μmol/L), S-adenosil omocisteina (μmol/L), omocisteina totale (μmol/L), cisteina totale (μmol/L), metionina (μmol/L), colina libera (μmol/L) e betaina (μmol/L) saranno analizzati utilizzando la spettrometria di massa con cromatografia liquida. La vitamina B12 (pmol/L) sarà analizzata utilizzando un immunoanalizzatore. Il piridossal-5-fosfato (nmol/L) sarà analizzato utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem. Le varianti geniche saranno genotipizzate utilizzando i test di genotipizzazione TaqMan SNP. Un conteggio completo del sangue sarà eseguito utilizzando un analizzatore ematologico automatizzato (Sysmex XNL-550). Le forme di folato del latte materno (tra cui UMFA, THF, 5-metil-THF, 5-formil-THF e 5,10-metenil-THF) saranno quantificate mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem; il folato totale rappresenterà la somma di queste forme. Le concentrazioni di FBP nel latte materno saranno misurate utilizzando una procedura di dosaggio radio competitivo (come descritto da Selhub et al.).

Sommario dei dati da raccogliere

Dati demografici, medici e nutrizionali tramite questionari strutturati

La raccolta dei dati di base includerà età, etnia, parità, istruzione, occupazione, reddito familiare, storia medica e farmacologica, peso riportato prima della gravidanza, dieta generale (compresa l’assunzione di alimenti vegani, vegetariani, chetogenici, senza glutine e qualsiasi alimento/gruppo alimentare evitato per qualsiasi motivo) e uso di integratori. La raccolta dei dati finali includerà qualsiasi cambiamento nella salute generale o nell’uso di farmaci dalla visita iniziale.

Antropometria

Il BMI prima della gravidanza sarà calcolato utilizzando il peso pre-gravidanza auto dichiarato e l’altezza misurata. Le misure dei partecipanti saranno prese al basale (peso e altezza) e alla fine della gravidanza (solo il peso) per calcolare l’aumento di peso gestazionale durante il periodo di intervento e l’aumento di peso totale durante la gravidanza (usando il peso pre-gravidanza auto-riferito e il peso misurato alla fine della gravidanza).

Valutazione della dieta

I DFE totali (μg/giorno) dai folati alimentari e dall’acido folico supplementare saranno calcolati utilizzando il Block Folic Acid/Dietary Folate Equivalents Screener (NutritionQuest, Berkeley, CA, USA), un questionario validato sulla frequenza alimentare.

Dati post-partum

Saranno registrate le settimane totali di integrazione, le settimane di gestazione al momento del parto, la conformità al protocollo di raccolta del latte materno e i tempi di integrazione di folati prima della raccolta del latte materno e dei campioni di sangue post-partum.

Criteri di rinuncia

I criteri di rinuncia comprendono l’interruzione spontanea o programmata della gravidanza, l’uso di ulteriori supplementi nutrizionali contenenti folati/acidi folici e in seguito a un evento avverso/gravemente avverso associato ai supplementi/all’intervento della sperimentazione (come determinato dall’investigatore qualificato (CM)). I partecipanti possono anche auto-ritirare in qualsiasi momento e non saranno raccolte ulteriori informazioni. Indipendentemente dal motivo del ritiro, tutti i dati precedentemente raccolti saranno conservati per l’analisi. Le partecipanti che partoriscono prima della visita finale avranno la possibilità di continuare nella fase postpartum dello studio, a condizione che continuino ad assumere quotidianamente gli integratori dello studio.

Gestione dei dati e privacy

Tutti i dati e i campioni biologici saranno identificati utilizzando l’ID dello studio di ogni partecipante. I dati con identificatori personali saranno memorizzati su un computer criptato e protetto da password in uno spazio server sicuro presso il BC Children’s Hospital Research Institute. I dati con gli identificatori personali scollegati saranno puliti e il doppio inserimento sarà completato dal coordinatore della ricerca (KMC) e da un assistente di ricerca indipendente in REDCap (Research Electronic Data Capture) ospitato dal BC Children’s Hospital Research Institute. KMC, JAH e CDK avranno accesso al dataset finale. I documenti cartacei saranno conservati in uno schedario chiuso a chiave e i campioni biologici saranno conservati in un congelatore chiuso a chiave all’interno del laboratorio del ricercatore principale (CDK) alla University of British Columbia. Ai partecipanti potrà essere comunicata l’assegnazione dell’integratore di folati e i risultati dei folati nel sangue e nel latte materno (se applicabile) (inclusi i DFE, i folati nel siero e nella RBC al basale, alla fine e dopo il parto, e le concentrazioni totali di folati nel latte materno) dopo il completamento delle analisi statistiche finali.

Dati e analisi statistiche

Le statistiche descrittive saranno utilizzate per i dati basali dei partecipanti. Le variabili continue saranno riportate con una media ± deviazione standard (o mediana e intervallo interquartile se non distribuite normalmente) e le variabili categoriche come numeri assoluti per gruppo e percentuale. Il conteggio delle capsule sarà utilizzato per calcolare l’aderenza dei partecipanti e il diario dell’integratore sarà utilizzato per fornire un quadro descrittivo delle barriere all’aderenza. I dati saranno valutati per la normalità e le trasformazioni o l’uso di test non parametrici equivalenti saranno considerati se i dati non seguono una distribuzione normale. Le analisi statistiche saranno eseguite utilizzando Stata (StataCorp, College Station, TX, USA). Tutte le analisi saranno inizialmente completate su una base intention-to-treat secondo l’assegnazione iniziale del gruppo al basale e senza alcuna imputazione per i dati mancanti. Le analisi secondarie per protocollo saranno condotte includendo coloro che hanno completato lo studio e hanno aderito al protocollo dello studio. L’imputazione multipla sarà utilizzata per correggere i dati mancanti come appropriato nelle analisi di sensibilità.

Analisi primarie

Calcoleremo la media ± deviazione standard per i risultati primari (folati sierici, folati RBC e plasma UMFA) in ogni gruppo al basale e alla fine, così come la media ± deviazione standard del cambiamento all’interno della donna in questi risultati in ogni gruppo. Queste stime saranno utilizzate per informare il calcolo della dimensione del campione dello studio definitivo.

Analisi secondarie

Analisi esplorative dei risultati primari saranno condotte utilizzando un modello di regressione lineare multipla per indagare se il cambiamento dalla linea di base alla linea di fine differisce in base allo stato del trattamento, aggiustando i valori di base e le variabili esplicative (DFE, biomarcatori esplorativi, settimane di gestazione all’inizio dell’integrazione). Verrà anche calcolata la proporzione di donne con UMFA ≥ 0,2 nmol/L (considerata una concentrazione rilevabile) al basale e all’endline in ogni gruppo. Per informare il nostro obiettivo secondario, il tasso complessivo di partecipazione allo studio sarà stimato dividendo il numero totale di donne arruolate per il numero totale di donne che erano interessate a partecipare. Il tasso di reclutamento settimanale sarà stimato dividendo il numero totale di donne arruolate per il numero totale di settimane che ci sono volute per reclutarle. Il tasso di ritenzione dei partecipanti sarà stimato dividendo il numero di donne che completano l’intero studio per il numero totale di donne arruolate. Per ogni strategia di reclutamento (compresi i manifesti, i social media, il passaparola), saranno valutati la portata totale (solo i social media), le richieste, le iscrizioni e i costi. Le probabilità di iscrizione dopo la richiesta di informazioni per ogni strategia saranno valutate con un odds ratio. Se disponibili, le ragioni della mancata iscrizione saranno registrate.

Analisi post-partum

Calcoleremo la media ± deviazione standard per la proporzione di acido folico nel latte materno (dividendo la concentrazione di acido folico del latte materno per la somma di tutte le forme di folati del latte materno) e per il folato RBC materno post-partum. La regressione lineare sarà utilizzata per stimare l’associazione tra la concentrazione di acido folico nel latte materno e l’UMFA nel plasma postpartum della madre. I risultati post-partum saranno ulteriormente analizzati utilizzando la regressione lineare multipla, aggiustando per i valori finali e le variabili esplicative (DFE, settimane totali di integrazione, aderenza al protocollo di raccolta del latte materno).

Sicurezza

L’acido folico è fornito ad una dose che soddisfa le raccomandazioni canadesi per le donne in gravidanza (0,4-1,0 mg/giorno); quindi, è considerato a basso rischio. Il sale di calcio dell’acido (6S)-5-metiltetraidrofolico è riconosciuto come sicuro ed è incluso nei multivitaminici prenatali canadesi senza un limite superiore tollerabile stabilito (nessun rischio di danno è attualmente noto). La randomizzazione avverrà tra le 8 e le 21 settimane di gestazione (dopo la chiusura del tubo neurale). Considerando il basso rischio di questo studio pilota, l’assemblaggio di un comitato di monitoraggio dei dati non è stato ritenuto necessario. Tutti i problemi di sicurezza e, se necessario, la decisione di interrompere lo studio, saranno affrontati dagli investigatori principali (CDK e JAH) e da un investigatore qualificato (CM) e riportati al Research Ethics Board e a Health Canada. Lo smascheramento dei codici di intervento può essere intrapreso in qualsiasi momento se ritenuto necessario per il monitoraggio della sicurezza dei partecipanti.