HypaCas9 e Cas9-HF1 mostrano lenti tassi osservati di scissione

Abbiamo iniziato le nostre analisi cinetiche misurando la concentrazione del sito attivo dell’enzima per ciascuna delle varianti di Cas923,24,25. Misurare la quantità di prodotto formato in una titolazione di enzima con concentrazioni crescenti di DNA ha rivelato concentrazioni del sito attivo di 31 nM, 26 nM, 23 nM per SpCas9, HypaCas9, e Cas9-HF1, rispettivamente, per campioni di enzima con una concentrazione nominale di 100 nM basato su assorbanza a 280 nm (Supplementary Fig. 1a-d). Abbiamo anche misurato le concentrazioni del sito attivo di SpCas9 e HiFiCas925 da Integrated DNA Technologies (IDT) e osservato concentrazioni simili di enzima attivo (Fig. 1e-f supplementare). È importante notare che, in ogni caso, la concentrazione di DNA necessaria per saturare il segnale era uguale alla concentrazione di prodotto formato, che elimina le preoccupazioni che una parte dell’enzima potrebbe legare il DNA ma non reagire. Tutti gli esperimenti successivi sono stati impostati utilizzando la concentrazione di enzima attivo determinato nella titolazione del sito attivo.

Per confrontare la cinetica dei substrati di DNA on- o off-target di SpCas9 con le varianti ingegnerizzate, abbiamo prima esaminato il corso del tempo del filamento di destinazione (HNH) scissione per ogni enzima (Fig. 1 e Fig. 2 supplementare). I dati sono stati adattati con una funzione esponenziale singola o doppia utilizzando l’Eq. (1) o l’Eq. (2), rispettivamente.

dove Y rappresenta la concentrazione del prodotto di scissione, A1 rappresenta l’ampiezza, e λ1 rappresenta il tasso di decadimento osservato (autovalore)17.

dove Y rappresenta la concentrazione del prodotto di scissione, A1 rappresenta l’ampiezza e λ1 rappresenta il tasso osservato per la prima fase. A2 rappresenta l’ampiezza e λ2 rappresenta il tasso osservato per la seconda fase.

Confronto dei tassi di decadimento di scissione osservati di substrati on- e off-target da SpCas9 mostra che il mismatch PAM-distale di 3 bp rallenta l’enzima di 13 volte (da 1 s-1 a 0,076 s-1). Entrambe le varianti di Cas9 ad alta fedeltà diminuiscono drasticamente il tasso di decadimento osservato per la scissione di substrati di DNA on-target da 21 a 35 volte rispetto a SpCas9 (0,028 s-1 per HypaCas9 e 0,047 s-1 per Cas9-HF1 vs 1 s-1 per SpCas9). Inoltre, HypaCas9 e Cas9-HF1 riducono ulteriormente i tassi di decadimento della scissione del DNA fuori bersaglio da 8 a 290 volte (tassi di 0.0033 s-1 e 0.00016 s-1, rispettivamente) rispetto ai loro rispettivi tassi con DNA on-target. Questi dati dimostrano cambiamenti drammatici nei tassi osservati di scissione dalle varianti ingegnerizzate con il DNA on-target e off-target. Tuttavia, queste misure da sole non definiscono i cambiamenti nella specificità, che è una funzione della partizione cinetica della scissione del DNA rispetto alla dissociazione, che comprende tutti i passaggi che portano al primo passo irreversibile nel percorso 17, tra cui il legame reversibile del DNA, R-loop formazione, HNH docking dominio e scissione del DNA.

Lo svolgimento del DNA è in gran parte invariato con le varianti di Cas9

Dal momento che il nostro lavoro precedente ha identificato la formazione di R-loop come rate-limiting per on-target cleavage e altri successivamente suggerito che R-loop formazione e tassi di riavvolgimento può dettare la specificità dell’enzima per SpCas9 e Cas9-HF116, abbiamo testato se HypaCas9 sarebbe visualizzare cinetica simile. Per misurare direttamente i tassi di formazione di R-loop per tutti gli enzimi, abbiamo usato un saggio a flusso fermato basato sulla misurazione della fluorescenza di tCo a -16 nt, un analogo triciclico fluorescente della citosina che viene spento dall’impilamento delle basi nel dsDNA in modo che l’apertura del duplex provochi un grande aumento della fluorescenza. I nostri esperimenti di controllo utilizzando entrambi i nostri substrati analoghi di base marcati con tCo e 2-AP nelle posizioni -16, -9 e -1 nt, rispettivamente (Fig. 3 supplementare), mostrano che nessuno degli analoghi influenza il tasso di decadimento osservato per la scissione del DNA. Le strutture chimiche di tCo e 2AP sono molto meno ingombranti di grandi etichette Cy3 e Cy5 e meno probabile che interferiscano con la cinetica enzimatica (Fig. 4 supplementare). In presenza di Mg2 +, SpCas9, HypaCas9, e Cas9-HF1 svolgere il substrato di DNA on-target con tassi di decadimento quasi identici (~ 2 s-1) (Fig. 2). Sorprendentemente, il tasso di decadimento della formazione di R-loop per substrati di DNA off-target per tutte le varianti di Cas9 era anche in gran parte invariato (tra 0,85 s-1 e 2,59 s-1). Pertanto, lo svolgimento del DNA non è limitante e non è correlato con i tassi osservati di scissione per le varianti ad alta fedeltà, a differenza di SpCas9.

I tassi di decadimento della formazione del loop R sono stati misurati monitorando l’aumento di fluorescenza da tCo (posizione -16 nel filamento non bersaglio) in funzione del tempo dopo aver miscelato l’enzima (28 nM) con il DNA (10 nM) in presenza di 10 mM Mg2+. I dati sono stati adattati ad una funzione esponenziale doppia per ottenere i tassi di decadimento indicati. a, b SpCas9 (28 nm) con on-target (a) e off-target (b) DNA, c, d HypaCas9 con on-target (c) e off-target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 con on-target (e) e off-target (f) DNA.

Data la posizione del tCo a -16 nt, è probabile che le nostre misurazioni riflette un passo tardi nel processo di svolgimento. Per confronto, abbiamo misurato il tasso di decadimento per la formazione di R-loop usando tCo etichettati in una posizione immediatamente prossimale al PAM (posizione -1 nt). Dopo aver miscelato rapidamente Cas9-RNA con il substrato di DNA on-target, abbiamo osservato un marcato aumento della fluorescenza mentre il DNA srotola l’analogo della base tCo. Abbiamo adattato i dati a un doppio esponenziale per determinare il tasso di decadimento principale di 10 s-1 (Fig. 3a-f). Curiosamente, questi risultati indicano che una volta che un sito PAM è impegnato con l’enzima, lo srotolamento iniziale del DNA è più veloce di quello osservato a -16 nt. Questi dati suggeriscono che il tasso di decadimento netto osservato di srotolamento osservato a -16 nt può essere una funzione di diverse fasi di srotolamento veloce che portano allo srotolamento completo. Tuttavia, poiché non è stato osservato alcun ritardo nella cinetica, sembra che i passi di srotolamento parziale più veloci e precedenti portino a un passo finale che limita la velocità di srotolamento completo, misurato alla posizione -16 nt. Anche se sono necessari ulteriori studi per esaminare gli effetti dei mismatch nelle fasi precedenti dello svolgimento, la nostra misurazione attuale fornisce la migliore stima del tasso netto di formazione di R-loop. Il tasso di decadimento misurato per la formazione di R-loop utilizzando questa etichetta è indistinguibile sia per SpCas9 che per le varianti ad alta fedeltà su tutti i substrati testati, quindi i tassi di svolgimento del DNA sembrano essere invariati dagli enzimi Cas9 ingegnerizzati.

I tassi di decadimento della formazione del loop R sono stati misurati monitorando l’aumento di fluorescenza da tCo (posizione -1 nel filamento non bersaglio) in funzione del tempo dopo aver mescolato l’enzima (28 nM) con il DNA (10 nM) in presenza di 10 mM Mg2+. I dati sono stati adattati ad una funzione esponenziale doppia per ottenere i tassi di decadimento mostrati. a, b SpCas9 (28 nm) con on-target (a) e off-target (b) DNA, c, d HypaCas9 con on-target (c) e off-target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 con on-target (e) e off-target (f) DNA. g Cartoon del riarrangiamento del dominio HNH. h Il FRETSpCas9 etichettato con Cy3 e Cy5 coppia a C867 e C355, rispettivamente, è stato utilizzato per misurare il movimento del dominio HNH durante la scissione di on-target substrati.

Per correlare i tassi di formazione R-loop con passi coinvolti in HNH-domain docking sul filamento bersaglio, abbiamo misurato il cambiamento conformazionale enzima utilizzando l’analisi stopped-flow su un Cas9 che è stato etichettato con Cy3 e Cy5 come descritto precedentemente 18. Brevemente, una cisteina-light versione di Cas9 è stato etichettato con Cy3 a 355 aminoacido e Cy5 a 867 aminoacido. L’efficienza FRET aumenta quando il dominio HNH riarrangia allo stato cataliticamente attivo (Fig. 3g). Dopo aver miscelato rapidamente il FRET-pair-labeled Cas9 con un perfettamente abbinato on-target DNA, abbiamo osservato un aumento dell’efficienza FRET, indicando che il dominio HNH è stato riarrangiamento ad uno stato cataliticamente attivo. Abbiamo misurato il tasso di decadimento per il docking HNH per essere ~ 2,5 s-1 (Fig. 3h), che è simile alle misure FRET singola molecola. Sorprendentemente, i tassi osservati di R-loop formazione (1.5 s-1) e docking dominio HNH sono molto simili, indicando che questi passaggi possono essere cineticamente collegati. Il tasso di decadimento leggermente più veloce osservato per il movimento del dominio HNH potrebbe essere dovuto alla reazione inversa come il movimento del dominio arriva all’equilibrio dopo o in coincidenza con R-loop formation.

I tassi di decadimento di srotolamento del DNA sono stati misurati anche utilizzando metodi singola molecola utilizzando un FRET-paio etichettato DNA, Cy3 e Cy5 sono stati etichettati sulla posizione -6 nt del filamento bersaglio e -16 nt sul filamento non bersaglio, rispettivamente 16. Pertanto, abbiamo anche testato il FRET-accoppiato substrati di DNA nel tentativo di correlare il segnale FRET con i tassi osservati di scissione del DNA. In primo luogo, abbiamo testato il substrato precedentemente utilizzato in studi di singola molecola senza le etichette Cy3/Cy5 16, che ha una differenza di due nucleotidi con il nostro substrato, in particolare, una sostituzione T nelle posizioni -16 e -18. Il tasso di decadimento del filamento di destinazione (HNH) scissione è simile a quella del nostro substrato (0,7 s-1 vs 1 s-1, Supplementary Fig. 5a), quindi contesto sequenza in questa posizione non ha un effetto significativo. Abbiamo anche testato la scissione con Cy3 / Cy5 DNA etichettato con questa altra sequenza, e ha mostrato un tasso di decadimento simile come la nostra sequenza (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, figure supplementari. 5b e 6a). Successivamente, abbiamo esaminato il corso del tempo del filamento bersaglio (HNH) scissione del DNA marcato Cy3/Cy5 con la nostra sequenza per ogni enzima (Fig. 6 supplementare). Con SpCas9, la reazione del DNA marcato Cy3/Cy5 segue un singolo esponenziale con un tasso di decadimento notevolmente ridotto (0,06 s-1 vs 1 s-1) mostrando una diminuzione di ~ 17 volte nel tasso di decadimento osservato per la scissione del DNA rispetto al substrato non marcato. Il HypaCas9 ingegnerizzato e Cas9-HF1 anche esibito diminuito tassi di scissione del DNA di 0.0046 s-1 e 0.0016 s-1, rispettivamente, che sono 5.9 volte e 28.75 volte più lento di substrati non etichettati misurato in condizioni identiche. È chiaro che l’interferenza delle etichette Cy3/Cy5 altera l’effetto delle varianti ad alta fedeltà sui tassi di scissione del DNA. Nel complesso, l’etichettatura del DNA con etichette Cy3 e Cy5 ingombranti ha avuto un impatto drammatico sull’enzima. Per questi motivi, non sono stati eseguiti ulteriori studi utilizzando il DNA marcato con la coppia FRET.

La specificità di Cas9 è governata dal partizionamento cinetico

Poiché la specificità dell’enzima è una funzione di tutti i passaggi che portano al primo passo in gran parte irreversibile, tutti gli eventi precedenti alla scissione del DNA devono essere considerati17. Per misurare il tasso di scissione intrinseca, abbiamo bypassato il passo di formazione R-loop normalmente limitante tasso preincubando SpCas9 con off-target DNA in assenza di Mg2 + per consentire il legame e cambiamenti conformazionali per venire a equilibrio per formare un complesso SpCas9.DNA. Abbiamo poi iniziato la reazione chimica con l’aggiunta di 10 mM Mg2+. Nei nostri studi precedenti, R-loop formazione è stata limitante con SpCas9 reagire con on-target DNA, e il tasso di decadimento scissione intrinseca era più veloce quando misurato utilizzando il protocollo di preincubazione. Qui, con off-target DNA, i tassi di HNH e RuvC scissione sono stati misurati per essere 0,12 s-1 e 0,14 s-1, rispettivamente (Supplementary Fig. 7c, d, e Supplementary Fig. 8), che sono molto più lenti rispetto ai tassi di R-loop formazione. Intrigante, questi risultati mostrano che il passo limitante nel percorso enzimatico di SpCas9 con un off-target è la scissione del DNA dal momento che il tasso di decadimento per R-loop formazione abbiamo misurato era 0,85 s-1 (Fig. 2b). Questi dati indicano che la discriminazione si basa, almeno in parte, su un cambiamento nell’identità del passo limitante nel confronto tra il DNA on e off-target.

Abbiamo ripetuto questi esperimenti con HypaCas9 e Cas9-HF1 con DNA on o off-target. Questi risultati definiscono i tassi osservati per la scissione HNH di 0.035 s-1 e 0.0023 s-1 per HypaCas9 con on- e off-target substrati, rispettivamente (Supplementary Fig. 7g, k). Tassi di scissione osservati di Cas9-HF1 per on- e off-target substrati sono stati misurati come 0.038 s-1 e 0.00014 s-1, rispettivamente (Supplementary Fig. 7o, q). Questi tassi di scissione osservati sono un po ‘più veloce di quelli misurati con l’aggiunta simultanea di DNA e Mg2 +, indicando che qualche passo diverso da R-loop formazione ma precedente scissione del DNA può rallentare il tasso di decadimento osservato. Tuttavia, questi risultati mostrano che i tassi di scissione osservati per on-target DNA sono ridotti ~ 100 volte sia per HypaCas9 e Cas9-HF1 rispetto a SpCas9. Per il DNA fuori bersaglio, i tassi di scissione osservati sono ridotti di 50 o 860 volte per HypaCas9 o Cas9-HF1, rispettivamente, rispetto a SpCas9.

La discriminazione non è definita solo dai tassi relativi di scissione del DNA. Piuttosto, perché la formazione di R-loop è veloce, la discriminazione è una funzione del partizionamento cinetico tra i tassi di rilascio del DNA rispetto alla scissione17,26,27. Al fine di quantificare il partizionamento cinetico, abbiamo incubato l’enzima e il DNA etichettato in assenza di Mg2 +, che consente la formazione di R-loop per arrivare all’equilibrio, ma impedisce la catalisi 15. Abbiamo poi aggiunto Mg2 + per avviare la reazione in presenza di un grande eccesso di identico, non etichettato on-target DNA per servire come una trappola. Confronto tra gli esperimenti paralleli eseguiti in presenza e in assenza della trappola DNA fornisce una stima per il partizionamento cinetica frazionale per la dissociazione contro la scissione del DNA legato (Fig. 4a). Una volta SpCas9 era legato al DNA on-target, è stato scisso rapidamente, e la trappola DNA ha avuto poco effetto (Fig. 4b). Al contrario, il 33% del DNA off-target si è dissociato dall’enzima, mentre ~ 67% del DNA è stato impegnato nella scissione (Fig. 4c e Fig. 9a supplementare). Questi risultati dimostrano che SpCas9 discrimina il DNA PAM-distale mismatched diminuendo il tasso di scissione, che aumenta la frazione di DNA che viene rilasciato piuttosto che scisso. Tuttavia, l’effetto è piccolo quindi il tasso di dissociazione sembra essere più lento della scissione.

a Schema di esperimento di trappola del DNA. b, c scissione SpCas9 di on-target (da Gong et al.15) (b) o off-target (c) DNA. d, e HypaCas9 scissione di on-target (d) o off-target (e) DNA. f, g Cas9-HF1 scissione di on-target (f) o off-target (g) DNA. L’enzima (28 nM) e il DNA marcato (10 nM) sono stati incubati in assenza di Mg2+ e la reazione è stata avviata aggiungendo Mg2+ in presenza o in assenza di un eccesso di DNA trappola non marcato. A- e A◦ rappresentano l’ampiezza con (cerchi pieni) e senza trappola (cerchi aperti), rispettivamente. La percentuale indica la frazione di DNA pre-legato impegnato ad andare avanti per la scissione rispetto alla reazione in assenza di trappola.

In seguito, abbiamo esaminato il partizionamento cinetico per HypaCas9 e Cas9-HF1 legato al DNA on-target (Fig. 4d, f, Fig. 9b, d). I nostri risultati con HypaCas9 e Cas9-HF1 mostrano che ~ 75% e ~ 92% del DNA on-target è stato scisso in presenza della trappola, rispettivamente. La percentuale di scissione è più piccola che per SpCas9 wild-type perché il tasso di decadimento intrinseco osservato per il DNA on-target da HypaCas9 (0,035 s-1) e Cas9-HF1 (0,038 s-1) era 100 volte più lento che con SpCas9 (4,3 s-1). Questo tasso di scissione più lento dà il tempo per una piccola frazione (8 al 25%) del on-target DNA per dissociare prima che sia scisso.

Kinetic partizionamento per favorire la dissociazione è stata migliorata quando HypaCas9 e Cas9-HF1 reagire con off-target DNA perché i tassi di scissione sono stati ulteriormente ridotti a 0.0023 s-1 e 0.00014 s-1, rispettivamente (Fig. 4e, g, Supplementary Fig. 9c, e). Questi tassi sono 50- a 860 volte più lento, rispettivamente, rispetto a SpCas9 su un substrato off-target. Di conseguenza, solo ~ 24% e ~ 10% del legato off-target DNA è stato impegnato ad andare avanti per la scissione da HypaCas9 e Cas9-HF1, rispettivamente, in presenza di DNA trappola. Presi insieme, questi risultati dimostrano che le varianti ad alta fedeltà ingegnerizzate hanno acquisito una migliore specificità contro il PAM-distale del DNA spaiato attraverso un tasso notevolmente diminuito di scissione, che altera il partizionamento cinetico per favorire il rilascio piuttosto che la scissione del substrato legato sia per il DNA on- che off-target, ma l’effetto è maggiore per il DNA off-target. Il calcolo delle costanti di velocità di dissociazione apparente utilizzando l’Eq. (3) mostra che le varianti ad alta fedeltà non aumentano il tasso apparente di rilascio del DNA (Tabella supplementare 1).

Piuttosto, l’aumento della discriminazione è interamente attribuito alla diminuzione della costante di velocità apparente per il clivaggio.

Nelle nostre descrizioni della cinetica degli enzimi Cas9 finora, i tassi di decadimento osservati delle reazioni sono stati stimati sulla base dei dati di adattamento alle funzioni esponenziali, che producono autovalori che sono di solito funzioni complesse di più costanti di velocità17. Per comprendere appieno la cinetica e il meccanismo, tutti gli esperimenti per ogni enzima e substrato di DNA sono stati adattati globalmente basato sull’integrazione numerica delle equazioni di tasso utilizzando un unico modello unificato (Fig. 5 e figure supplementari. 10-14). Dati globali raccordo mostra che il nostro modello minimo (Fig. 5f, inserto) conti per i nostri dati e ciascuna delle costanti di tasso è ben definito sulla base di analisi dei contorni di fiducia testando la misura in cui ogni parametro è vincolato dai dati (Fig. 6) 17,28. Si noti in particolare che i nostri conti modello per le tracce bifasiche visto in alcuni esperimenti senza dover invocare eterogeneità, e fornisce costanti di tasso intrinseco per ogni passo del percorso tra cui R-loop formazione e HNH e RuvC eventi scissione. Anche se è probabile che ulteriori riarrangiamenti strutturali non risolti possano essere richiesti per l’allineamento dei residui catalitici per la scissione del DNA, questi non sono ancora stati risolti come eventi cineticamente distinti. Il modello attuale rappresenta un percorso minimo necessario e sufficiente per rappresentare tutti i dati disponibili, e può essere facilmente ampliato come nuove informazioni diventano disponibili per definire ulteriori passi nel percorso.

a DNA e Mg2+ hanno iniziato la scissione dal dominio HNH. b DNA e Mg2+ hanno iniziato la scissione dal dominio RuvC. c Tasso di formazione di R-loop. d Mg2+ hanno iniziato la scissione dal dominio HNH. e Mg2+ hanno iniziato la scissione dal dominio RuvC. f Effetto della trappola DNA sulla partizione cinetica della scissione di Cas9. Tutte le curve sono state calcolate sulla base del fit globale ai dati secondo il modello cinetico (inserto), con costanti di tasso indicato nella tabella 1. Stime di errore sono stati basati su analisi dei contorni di fiducia come mostrato in Fig. 6. E è Cas9.gRNA, D è DNA bersaglio, ED è Cas9.gRNA.DNA, EDH è R-loop formazione con aggancio del filamento di destinazione a HNH, EDHR e EDP1R sono R-loop formazione con aggancio del filamento non-bersaglio a RuvC, EDHP2 è RuvC scissione del filamento non-bersaglio, EDP1 è HNH scissione del filamento di destinazione, EDP1P2 è scissione di entrambi i filamenti, Dtrap è eccesso non etichettato, perfettamente abbinato DNA. EDtrap è Cas9.gRNA.DNAtrap.

I contorni di fiducia sono mostrati per i dati di adattamento in Fig. 5. Costanti di tasso numerati sono definiti nel nostro modello cinetico (Fig. 5f, inserto). La soglia χ2 (linea tratteggiata) è stato impostato su 0,99 per definire i limiti superiore e inferiore per ogni costante di tasso come descritto 17,32. Poiché i contorni erano simmetrici con parametri ben vincolati, riportiamo ± limiti di errore nella tabella 1. Per questa analisi una soglia χ2 è stato calcolato utilizzando una distribuzione F ed è stato utilizzato per definire i limiti inferiori e superiori per ogni parametro.

Per comprendere la specificità enzimatica, costanti di tasso deve essere interpretato nel contesto di tutti i passi cineticamente rilevanti come illustrato nel profilo di energia libera (calcolato utilizzando Eq. (4) dalle costanti di velocità nella tabella 1).

Il coefficiente di trasmissione A = 0,001

Perché l’adattamento globale dei dati fornisce le costanti di velocità per ogni passo rilevante (Figg. 5 e 6), possiamo costruire un profilo di energia libera in buona fede (Fig. 7b, e Figg. supplementari 10-14). I profili di energia libera confrontando SpCas9, HypaCas9, e Cas9-HF1 mostrano un cambiamento nei passaggi che limitano la velocità e determinano la specificità. La specificità dell’enzima è definita da kcat/Km ed è data dalla più alta barriera complessiva relativa allo stato di partenza, mentre la velocità massima, kcat, è definita dalla più alta barriera locale relativa allo stato precedente, attenuata da qualsiasi passo di equilibrio rapido precedente. Poiché le costanti di velocità per la formazione di R-loop non cambiano significativamente con diversi substrati e varianti dell’enzima, la specificità è governata in gran parte dal partizionamento cinetico del Cas9 R-loop, stato EDH nel nostro modello cinetico (Fig. 5f, inserto), sia per andare avanti con conseguente scissione irreversibile contro il rilascio tramite ri-ricottura del DNA ed espulsione dall’enzima. Le più alte barriere complessive per la scissione viste con le varianti ad alta fedeltà aumentano la probabilità di partizione cinetica per favorire la dissociazione del DNA (Fig. 6c).

a Rappresentazione cartografica del percorso di reazione degli enzimi Cas9. b Profili di energia libera per la scissione di SpCas9 di un on-target (linea grigia) da Gong et al.15 e off-target (linea rossa), rispettivamente; HypaCas9 scissione di un off-target (linea blu), e Cas9-HF1 scissione di un off-target (linea nera). Ogni profilo è stato calcolato utilizzando la teoria degli stati di transizione con tasso e costanti di equilibrio che sono stati derivati dal montaggio globale ogni serie di esperimenti (Tabella 1). Si noti le barriere più elevate per la scissione del DNA rispetto alla barriera inferiore per la reazione inversa precedente aumentare la probabilità di rilascio del DNA. c Grafico a barre di sintesi per k2, k3, e partizionamento cinetico (P).