Funghi esaminati
Gli isolati di Escovopsioides sono stati ottenuti da giardini di funghi di diverse specie di formiche tagliafoglie e non tagliatrici raccolti in studi precedenti. Questa collezione comprende 20 isolati ottenuti da Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi e Trachymyrmex tucumanus, oltre alla specie tipo di E. nivea ottenuta da Acromyrmex subterraneus subterraneus (Tabella 3). Inoltre, un ulteriore isolato è stato ottenuto da una colonia della formica non tagliafoglie Apterostigma megacephala trovata a Parauapebas, Pará, Brasile (Tabella 3). Tutti gli isolati hanno mostrato le caratteristiche morfologiche descritte del genere Escovopsioides: colonie ialine su PDA, vescicole terminali e intercalari con fialidi lageniformi, conidi ialini in lunghe catene, aleuroconidi e strutture simili a clamidospore.
Gli isolati sono conservati come sospensioni di conidi a – 80 °C (in glicerolo 10%) e in acqua distillata a 10 °C nella collezione del Laboratory of Fungal Ecology and Systematics (LESF), Rio Claro, São Paulo State, Brasile. Tutti gli isolati sono stati ravvivati da stock inoculando conidi conservati su un terreno PDA e incubati per 7 giorni a 25 °C, al buio. Tutti gli isolati esaminati sono stati ottenuti come colture monosporiche.
Caratterizzazione molecolare di Escovopsioides
Il DNA genomico è stato estratto con il metodo CTAB da colture coltivate su malt agar 2% (MA2%) per 5 giorni, al buio. I geni che codificano per tef1 (primer: EF6-20F e EF6A-1000R), LSU (primer: CLA-F e CLA-R) e ITS (primer: ITS5 e ITS4) sono stati amplificati per tutti gli isolati. Per tef1, 1 μL di DNA genomico diluito (1:100) è stato usato come template per l’amplificazione usando illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) nelle seguenti condizioni: una fase iniziale di denaturazione a 94 °C per 2 min, seguita da 15 cicli a 94 °C per 30 s e temperatura iniziale di annealing a 65 °C decrescente di 1 °C per ciclo di touchdown ed estensione finale a 72 °C per 1 min. È stato eseguito un secondo passaggio di PCR: 94 °C per 30 s, seguito da 35 cicli a 94 °C per 30 s, 48 °C per 30 s e un’estensione finale a 72 °C per 1 min. Per ITS, 2 μL di DNA genomico diluito (1:100) sono stati usati come template per la PCR, seguendo le condizioni descritte in Schoch et al.: 94 °C per 3 min, seguiti da 35 cicli a 94 °C per 1 min, 55 °C per 1 min e un’estensione finale a 72 °C per 2 min. Per LSU, 2 μL di DNA genomico diluito (1:100) sono stati utilizzati per la PCR, seguendo le condizioni descritte in Augustin et al. : 95 °C per 2 min, 40 cicli di 30 s a 95 °C, 60 s a 62 °C, 90 s a 72 °C e 5 min di estensione a 72 °C. I prodotti di PCR sono stati colorati con GelRed™ (Biotium) e visualizzati sotto i raggi UV dopo l’elettroforesi in gel di agarosio all’1%.
Gli impliconi sono stati purificati con il Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) seguendo il protocollo del produttore. I campioni sono stati analizzati in NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) e 20 ng di DNA sono stati sequenziati utilizzando BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) seguendo le istruzioni del produttore. A causa dell’alto contenuto di GC nella regione ITS di Escovopsioides, è stato aggiunto il 5% di DMSO alle reazioni di sequenziamento. Le sequenze forward e reverse sono state generate in ABI 3500 (Life Technologies) e assemblate in contigs in BioEdit v.7.1.3 . Le sequenze generate nel presente studio sono state depositate presso NCBI-GenBank (Additional file 1: Table S1).
Analisi filogenetica
In aggiunta alle sequenze generate in questo studio, le sequenze della specie tipo (E. nivea) insieme a sei specie descritte di Escovopsis e otto funghi appartenenti alle Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma e Lecanicillium) sono state recuperate da NCBI-GenBank. Così, l’intero set di dati utilizzato in questo studio comprendeva sequenze di 37 funghi (file aggiuntivo 1: Tabella S1).
Per l’analisi filogenetica, le sequenze sono state allineate in MAFFT . Le sequenze di tef1, ITS e LSU sono state concatenate in Winclada v.1.00.08. L’inferenza bayesiana è stata usata come algoritmo di ricostruzione. Il modello di sostituzione nucleotidica GTR + G e GTR + I + G è stato selezionato per tef1 e ITS/LSU, rispettivamente, utilizzando AIC in jModeltest2 con un intervallo di confidenza del 95%. Quindi, le analisi indipendenti partizionate del set di dati sono state eseguite in MrBayes ciascuna con tre catene riscaldate e una catena fredda. Il campionamento MCMC in ogni analisi si è verificato fino a un milione di generazioni. La convergenza delle catene riscaldate e fredde si è verificata quando la deviazione standard delle frequenze di divisione era inferiore a 0,01; poi il primo 25% delle generazioni è stato scartato come burn-in.
Esperimenti di doppia coltura
Abbiamo eseguito test in vitro per verificare il potenziale antagonista di Escovopsioides verso il fungo coltivato dalle formiche tagliafoglie. Abbiamo selezionato 13 dei 21 isolati di Escovopsioides (Tabella 3), sulla base dei seguenti criteri: i) qualsiasi polimorfismo trovato nel gene tef1; ii) diverse specie di formiche associate; iii) posizione geografica (cioè diverse città e siti di raccolta). Due degli isolati selezionati (LESF 596 e LESF 599) erano già stati valutati per le loro interazioni con la cultivar fungina nello studio di Varanda-Haifig et al. Tuttavia, abbiamo replicato questo test per confrontare con ulteriori isolati di Escovopsioides.
Il fungo Leucoagaricus gongylophorus FF2006 coltivato dalla specie di formica Atta sexdens rubropilosa è stato utilizzato negli esperimenti a doppia cultura. Questo ceppo è mantenuto su slant di agar mediante trasferimenti successivi ogni 24 giorni a 25 °C. La produzione di gongylidia da parte di questo ceppo viene controllata in ogni ciclo di trasferimento. Questo fungo è stato coltivato su terreno PDA e incubato a 25 °C per 14 giorni, al buio. Dopo questo periodo, i frammenti miceliari (8 mm di diametro) sono stati trasferiti in nuove piastre Petri (90 × 15 mm) contenenti anch’esse PDA a una distanza di 1,5 cm dal bordo. Queste piastre sono state incubate a 25 °C per 14 giorni, al buio. Poi, frammenti di micelio (8 mm di diametro) di Escovopsioides, precedentemente incubati su PDA, sono stati inoculati a una distanza di 3 cm dal fungo mutualistico. Per confrontare gli effetti dell’Escovopsioides sulla crescita del micelio della cultivar fungina con gli effetti causati da altri funghi, abbiamo utilizzato un isolato di Escovopsis sp. (LESF 19) proveniente dai giardini fungini di Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brasile). Questo isolato è stato ottenuto inoculando piccoli pezzi dei giardini di funghi su PDA integrato con cloramfenicolo. Le piastre di controllo sono state inoculate con lo stesso fungo mutualistico, ma non sono stati inoculati Escovopsioides o Escovopsis. Tutte le piastre sono state incubate per 14 giorni a 25 °C, al buio. Ogni combinazione di Escovopsioides, Escovopsis e il fungo mutualistico è stata effettuata in dieci piastre. Le piastre sperimentali e di controllo sono state scansionate a intervalli di 0, 2, 3, 5, 7, 10 giorni su uno scanner HP Deskjet F2050. Le immagini sono state utilizzate per misurare l’area di crescita delle colonie (cm2) del fungo mutualistico in ImageJ v. 1.38.
Le aree di crescita miceliale di L. gongylophorus negli esperimenti di doppia coltura sono state analizzate utilizzando un’ANOVA mista a due vie, con gli isolati fungini (Escovopsioides ed Escovopsis) contro il controllo come variabile intersoggettiva, e il tempo (giorni) come variabile intersoggettiva, considerando così le misure ripetitive del tempo nei trattamenti. I dati sono stati controllati per la normalità e l’omogeneità delle varianze, utilizzando i test di Shapiro-Wilk e Levene, rispettivamente. A causa delle violazioni di questi criteri, i dati sono stati trasformati usando il log o la radice quadrata quando necessario. I confronti multipli con diversi funghi filamentosi sono stati eseguiti usando il test t con la correzione di Bonferroni.
Per il confronto tra gli isolati, l’area di crescita miceliare di L. gongylophorus in contatto con gli isolati di Escovopsioides è stata divisa per l’area media del suo controllo al giorno 10. I dati sono stati controllati per la normalità e l’omogeneità delle varianze. L’ANOVA a una via è stata eseguita con l’area ottenuta al giorno 10 tra tutti i funghi testati, con confronti tra i diversi trattamenti eseguiti utilizzando il test post-hoc Tukey-HSD. Le analisi statistiche sono state eseguite in R v. 2.12.1.
Saggi biologici su frammenti di giardini di funghi in assenza di lavoratori
Leucoagaricus gongylophorus è coltivato in colonie di formiche attine nei giardini di funghi. Per determinare se Escovopsioides può svilupparsi sul giardino dei funghi senza i possibili effetti protettivi delle operaie, abbiamo eseguito dei biotest utilizzando frammenti di questo substrato senza formiche. I frammenti di giardino dei funghi sono stati ottenuti da una colonia matura e sana di A. sexdens rubropilosa mantenuta presso il Centro per gli studi sugli insetti sociali (UNESP, Rio Claro). I frammenti di giardino di funghi di 2 cm3 privati delle formiche e della covata sono stati posti in piastre Petri sterili con cotone inumidito ai bordi (seguendo Elizondo-Wallace et al. ). Prima di effettuare gli esperimenti, le piastre sono state tenute per 1 giorno a 25 °C per cercare le formiche che eventualmente fossero rimaste nei frammenti.
Abbiamo preparato una sospensione di 10 mL di 0,05% Tween 80 con massa miceliare e conidi di ciascuno dei 12 Escovopsioides (l’isolato LESF 591 non è stato utilizzato in questo esperimento) e un isolato di Escovopsis utilizzato negli esperimenti di doppia coltura. Questa sospensione è stata filtrata due o tre volte seguendo il metodo di Newmeyer per separare i conidi dai frammenti ifali presenti nella sospensione. Poi, la sospensione è stata diluita da 105 a 2,105 conidi mL-1determinata in una camera di Neubauer. Aliquote di 100 μL di sospensioni di conidi sono state inoculate sulla superficie del frammento di giardino usando una micropipetta. La stessa quantità di soluzione sterile 0,05% Tween 80 è stata aggiunta sulla superficie del giardino nel controllo negativo. Le piastre di Petri con il giardino dei funghi sono state tenute a 25 °C per un massimo di 10 giorni, con cinque piatti utilizzati per ogni trattamento e cinque piatti per ogni rispettivo controllo. L’eventuale sviluppo di ife dei funghi inoculati è stato osservato quotidianamente con uno stereomicroscopio (EZ4, Leica). La conidiazione di Escovopsioides sui giardini di funghi è stata osservata prendendo frammenti di micelio che crescevano sui giardini e montati in acqua e osservati al microscopio (DM500, Leica).
I dati di crescita e conidiazione sui giardini di funghi sono stati valutati come: nessuna crescita (punteggio 0), crescita osservata solo allo stereomicroscopio (punteggio 1), crescita macroscopica (punteggio 2) e conidiazione (punteggio 3) su 10 giorni di monitoraggio (file aggiuntivo 1: Figura S1). Abbiamo osservato la conidazione solo dopo la crescita macrocospica del fungo sui giardini dei funghi. La somma totale dei punteggi di cinque piastre di Petri in ogni giorno è stata ottenuta e trasformata in termini di percentuale del totale massimo possibile per confronti diretti.
Effetti di Escovopsioides su giardini con lavoratori
I lavoratori di formiche hanno un ruolo importante nella difesa della colonia contro patogeni e microbi indesiderati nei giardini dei funghi. Così, abbiamo eseguito esperimenti per verificare l’influenza dei lavoratori nei giardini di funghi inoculati con i conidi degli stessi funghi utilizzati nei biotest sui giardini di funghi in assenza di lavoratori di formiche (12 isolati di Escovopsioides e 1 isolato di Escovopsis).
I biotest utilizzando colonie di formiche regine sono difficili a causa del gran numero di colonie che questo tipo di esperimento richiederebbe. Così, abbiamo eseguito biotest con frammenti di giardini contenenti lavoratori per valutare gli effetti degli isolati fungini in vivo. Anche se questo set up sperimentale non rappresenta ciò che si verifica nelle colonie naturali, ha mostrato informazioni indicative circa l’azione difensiva dei lavoratori contro i funghi testati. Questo biotest è stato adattato seguendo il metodo di Elizondo-Wallace et al. Sono stati utilizzati contenitori di plastica con un piccolo strato di gesso sul fondo per evitare l’essiccazione dei giardini di funghi. Circa 20 cm3 di giardino fungino della stessa colonia usata nell’esperimento precedente sono stati messi nei contenitori di plastica. Il set up sperimentale comprendeva un totale di 84 contenitori, in modo che i trattamenti con i conidi dei 13 funghi e il controllo avevano sei contenitori ciascuno. Abbiamo selezionato formiche operaie con un diametro della capsula cefalica compreso tra 1,0 e 1,6 mm, quindi 50 di queste operaie sono state poste in ogni contenitore. Le operaie con meno di 1,0 mm non sono state contate e quelle con più di 1,6 mm sono state escluse. Questa procedura è stata adottata per consentire l’omogeneità tra i sei contenitori di ciascun trattamento, nonché tra i trattamenti, perché i lavoratori nell’intervallo tra 1,0 e 1,6 mm hanno un’attività di pulizia significativa. La superficie interna del contenitore è stata rivestita con Teflon® per evitare la fuga delle formiche.
I contenitori sono stati incubati a 25 °C per 3 giorni per stabilizzare i giardini dei funghi. Le sospensioni di conidi sono state ottenute come descritto sopra. Un totale di 1 mL di sospensione di conidi è stato spruzzato sulla superficie dei giardini di funghi usando uno spruzzatore. I giardini di funghi nel controllo negativo sono stati spruzzati con solo 1 mL di soluzione sterile allo 0,05% di Tween 80.
Gli esperimenti sono stati monitorati dopo 0, 5 e 10 giorni di inoculazione per verificare la salute dei giardini di funghi. Questo parametro è stato basato su un sistema di punteggio, in cui i giardini sani hanno ricevuto il punteggio 0, quelli parzialmente degradati il punteggio 1 e quelli completamente degradati (“infetti”) il punteggio 2. La rimozione della formica di pezzi di giardini di funghi e l’assegnazione alle discariche di rifiuti è stato il principale segno di deterioramento del giardino che abbiamo esaminato (vedi file aggiuntivo 1: Figura S2). I punteggi ottenuti dai sei contenitori di ogni esperimento, nei 3 giorni di osservazione, sono stati confrontati utilizzando il test di Friedman.
Per verificare la presenza degli isolati di Escovopsioides sui giardini dei funghi nei giorni 0, 5 e 10 dopo il trattamento, i frammenti sono stati rimossi dai giardini e inoculati su MA2% integrato con 150 μg mL- 1 di cloramfenicolo. Le piastre sono state incubate a 25 °C per 7 giorni, al buio. Cinque piastre con un frammento di giardino sono state utilizzate per ciascuno dei sei contenitori di ogni trattamento, per un totale di 30 piastre per trattamento. I frammenti con crescita positiva sono stati contati e la presenza a lungo termine dei funghi inoculati nei giardini dei funghi è stata testata utilizzando il test esatto di Fisher. In questa analisi abbiamo confrontato la proporzione di frangenti infettati da conidi fungini (Escovopsioides e Escovopsis) rispetto al controllo senza conidi in ogni giorno di esperimento. Abbiamo anche confrontato i diversi trattamenti con funghi inoculati tra di loro in ogni giorno di esperimento.