In sostanza, la coltura cellulare comporta la distribuzione di cellule in un ambiente artificiale (in vitro) che è composto dai nutrienti necessari, dalla temperatura ideale, dai gas, dal pH e dall’umidità per permettere alle cellule di crescere e proliferare.

• In vivo – Quando lo studio coinvolge entità biologiche viventi all’interno dell’organismo.

• In vitro – Quando lo studio è condotto utilizzando entità biologiche (cellule, tessuti ecc.) che sono state isolate dal loro ambiente biologico naturale. Es. tessuto o cellule isolate dal fegato o dal rene.

Se pezzi di tessuto possono essere messi nella coltura appropriata per produrre cellule che possono poi essere usate per la cultura (explantculture), le cellule dai tessuti (tessuti molli) possono essere ottenute attraverso reazioni enzimatiche. Tali enzimi come la tripsina e il proname sono usati per rompere il tessuto e rilasciare le cellule desiderate.

Quando le cellule sono state ottenute direttamente dall’organismo/tessuto animale (o anche tessuto vegetale) attraverso tecniche enzimatiche o meccaniche, tali cellule sono definite cellule primarie. Tuttavia, le cellule che continuano a proliferare indefinitamente (dopo la prima sottocultura) in condizioni speciali sono chiamate linee cellulari.

Queste particolari cellule tendono ad essere state fatte passare per un lungo periodo di tempo, il che fa loro acquisire tratti genotipici e fenotipici omogenei (simili).

Morfologia

In base al loro aspetto, le cellule in coltura possono essere suddivise in tre gruppi principali:

• Fibroblastico – Questo include cellule che tendono ad essere bipolari/multipolari con forme allungate. Queste cellule sono attaccate al substrato mentre crescono.

• Epiteliali – Le cellule epiteliali raggiungono una forma poligonale con dimensioni regolari. Sebbene tendano a crescere in chiazze discrete, queste cellule crescono anche attaccate al substrato.

• Linfoblasto – Queste cellule sono di solito di forma sferica e non si attaccano alla superficie del substrato. Di conseguenza, sono coltivate in sospensione.

* Per le piastre solide, si usano agenti solidificanti (come l’agar) quando il mezzo liquido è usato con l’agar.

Significato della coltura cellulare

La coltura cellulare è una tecnica importante in biologia cellulare e molecolare, dato che fornisce la migliore piattaforma per studiare la normale fisiologia e biochimica delle cellule. Una cellula è l’unità strutturale, funzionale e biologica di base di tutti gli esseri viventi.

Per capire un organismo o determinati tessuti, è importante capire come funzionano le sue cellule. Attraverso la coltura cellulare, questo diventa possibile soprattutto grazie al fatto che le cellule primarie assomigliano alle cellule parentali dell’organismo/tessuto.

Quel che si impara sulle cellule in vitro è rappresentativo di ciò che sta succedendo all’organismo/tessuto. Questo rende la cultura cellulare significativamente importante per lo sviluppo di vaccini, lo screening (farmaci ecc.) e la diagnosi delle malattie/condizioni date.

Dato che diversi tipi di cellule richiedono ambienti diversi per la proliferazione, ci sono diversi tipi di mezzi usati per la cultura come mezzi senza siero e mezzi contenenti siero tra gli altri.

Una volta che i requisiti giusti sono stati forniti, le cellule aumenteranno di numero e possono formare colonie, che possono poi essere facilmente viste e identificate.

Avendo una buona comprensione di ciò che la procedura è destinata a raggiungere, diventa più facile preparare la cultura con i componenti giusti. Capendo a cosa mira la procedura, il ricercatore saprà se preparare un mezzo selettivo (che permette la crescita di cellule specifiche) o un mezzo differenziale (che permette la crescita di diversi tipi di cellule).

Cultura cellulare primaria

La coltura cellulare è un processo in cui le cellule (cellule animali o vegetali) vengono rimosse dall’organismo e introdotte in un ambiente artificiale con condizioni favorevoli alla crescita. Questo permette ai ricercatori di studiare e imparare di più sulle cellule.

Ci sono tre tipi principali di coltura cellulare, che includono:

• Cultura cellulare primaria
• Cultura cellulare secondaria, e
• Linea cellulare

Qui, ci concentreremo sulla cultura cellulare primaria.

Ci sono due tipi di cellule primarie:

Cellule aderenti – Anche dette cellule dipendenti dall’ancoraggio, sono il tipo di cellule che richiedono l’attaccamento per crescere. Le cellule aderenti sono immobili, e sono ottenute da organi come il rene.

Cellule in sospensione – Queste sono il tipo di cellule che non richiedono l’attaccamento per crescere. Sono quindi chiamate anche cellule indipendenti dall’ancoraggio e comprendono cellule come i linfociti che si trovano nel sistema sanguigno.

Nella coltura cellulare primaria, le cellule ottenute da tessuti parentali (tessuti vivi) come il fegato e il rene, sono introdotte in mezzi adatti alla crescita. Una volta che le cellule sono state ottenute, possono essere coltivate come coltura di espianti, sospensione o monostrato.

* Nella coltura cellulare primaria, le cellule devono essere state ottenute dal tessuto parentale/vivente. Cioè, non provengono da un altro processo di coltura.

Prima che le cellule siano coltivate, sono prima sottoposte a un trattamento enzimatico per la dissociazione. Tuttavia, deve essere per una quantità minima di tempo per evitare di danneggiare o uccidere le cellule. Una volta ottenute le singole cellule, queste vengono poi opportunamente coltivate in mezzi per permettere loro di crescere (dividersi) e raggiungere i numeri desiderati.

Inizialmente, la coltura tende ad essere eterogenea in quanto è composta da diversi tipi di cellule ottenute dal tessuto.Anche se questo può essere mantenuto attraverso il processo in vitro (in una cultura in un mezzo adatto), questo sarebbe solo per un periodo limitato di tempo.

Attraverso il processo di trasformazione, le cellule primarie possono essere utilizzate per un lungo periodo di tempo, cambiando la cultura nel tempo. Queste cellule sono chiamate linee cellulari continue.

Tuttavia, le cellule primarie sono tipicamente preferite alle linee cellulari continue per il fatto che sono più simili (fisiologicamente) alle cellule invivo (cellule del tessuto vivente). Inoltre, le linee cellulari continue possono subire alcuni cambiamenti (cambiamenti fenotipici e genotipici) che porterebbero a discrepanze durante l’analisi. Come tali, non possono essere utilizzati per determinare ciò che sta accadendo alle cellule in vivo. È per questa ragione che le cellule primarie sono preferite.

Dato che le cellule primarie assomigliano significativamente alle cellule ottenute da tessuti viventi, sono importanti per la ricerca in quanto possono essere utilizzate per studiare le loro funzioni, le regolazioni metaboliche, la fisiologia cellulare, lo sviluppo, i difetti e le condizioni che riguardano il tessuto di interesse.

Inoltre, sono utilizzati per scopi quali la produzione di vaccini, lo screening di farmaci di ingegneria genetica, nonché i test di tossicità e la diagnosi prenatale, tra gli altri.

Mezzi di coltura cellulare

Nelle tecniche di coltura cellulare, le cellule (o tessuti) vengono rimosse da una pianta o un animale e introdotte in un nuovo ambiente artificiale che può sostenere la loro proliferazione (sopravvivenza e crescita).

Alcuni dei requisiti di tale ambiente per la proliferazione delle cellule includono:

• Un substrato (fonte di nutrimento)
• Gamma di temperatura ideale (controllata)
• Mezzo di crescita, e
• Phf ideale tra gli altri

Qui, ci concentreremo sul mezzo di coltura (media di coltura cellulare)

Anche se ci sono diversi tipi di media di coltura (per diversi tipi di cellule) sono tipicamente composti da:

• Glucosio
• Aminoacidi
• Vitamine
• Sali inorganici
• Fattori di attaccamento ecc.

Ci sono due tipi principali di mezzi di coltura che includono:

Media naturali – I mezzi di coltura naturali sono composti da fluidi biologici che si trovano in natura. Anche se questo tipo di media può essere usato per una serie di cellule, il suo più grande svantaggio è che non ha i componenti esatti richiesti da determinate cellule, il che può influenzare notevolmente la riproducibilità.

Mezzi artificiali – Chiamati anche mezzi sintetici, i mezzi artificiali si riferiscono al tipo di media che viene prodotto aggiungendo nutrienti come vitamine, gas (ossigeno e anidride carbonica) e proteine. Questi nutrienti organici e inorganici sono aggiunti in modo da soddisfare le esigenze specifiche di determinate cellule, e quindi fornire l’ambiente ideale per la loro crescita.

Come tali, possono essere utilizzati per una serie di scopi tra cui:

• Fornire la sopravvivenza immediata delle cellule
• Consentire la sopravvivenza prolungata delle cellule
• Consentire la crescita indefinita delle cellule
• Fornire funzioni specializzate

D’altra parte, la cultura può essere classificata come:

Media selettivi – Questo è un tipo speciale di media che permette solo a certe cellule di crescere. Per esempio, l’agar sangue (usato per isolare lo Streptococco & specie Moraxella) può essere trasformato in mezzi aselettivi aggiungendo antibiotici.

Mezzi differenziali- Questo tipo di mezzi permette a diversi tipi di cellule/microrganismi di crescere a seconda del loro metabolismo.

Come detto sopra, diversi tipi di mezzi sintetici sono preparati in modo da fornire l’ambiente di proliferazione ideale per determinate cellule. Per questo motivo, i mezzi sintetici possono essere divisi in quattro grandi categorie.

Queste includono:

Medi contenenti siero – In questi tipi di mezzi, il siero (siero bovino fetale) è usato come un vettore per i nutrienti e i fattori di crescita tra gli altri che tendono ad essere insolubili in acqua.

Mezzi senza siero – Questi tipi di mezzi sono tipicamente prodotti allo scopo di sostenere la cultura di un singolo tipo di cellula e, come tali, forniscono i nutrienti specifici e altri fattori richiesti dal tipo di cellula. In questi mezzi, il siero è assente perché presenta alcuni svantaggi e può portare a un’errata interpretazione dei risultati immunologici.

Media chimicamente definiti – Come suggerisce il nome, questo tipo di media è composto da ingredienti organici e inorganici puri e privi di contaminazione. I costituenti di questo tipo di media sono tipicamente prodotti attraverso l’ingegneria genetica in batteri/lieviti.

Media senza proteine – I media senza proteine sono tipicamente privi di qualsiasi tipo di proteina. E ‘in gran parte utilizzato per promuovere la crescita superiore delle cellule così come l’espressione della proteina in aggiunta tofacilitando per la purificazione di qualsiasi prodotto espresso.

Alcuni dei principali componenti dei mezzi di coltura cellulare includono:

• Nutrienti – forniti da peptidi e aminoacidi, che sono i mattoni delle proteine
• Carboidrati per l’energia
• Minerali essenziali come calcio, magnesio, fosfati e ferro tra gli altri, agenti tampone come gli acetati per stabilizzare il mezzo di coltura
• Vitamine
• Indicatori di cambiamento PH come il rosso fenolo

I mezzi di coltura cellulare sono usati per la proliferazione delle cellule, che possono poi essere identificate e studiate. Come tale, può essere utilizzato per vari scopi, tra cui l’istruzione, la diagnosi e il trattamento di una malattia, tra gli altri.

Sospensione cellulare

Nei metodi di cultura, la sospensione cellulare si riferisce a un tipo di cultura in cui le cellule sono sospese in un mezzo liquido.

Per ottenere singole cellule, un callo friabile (piccolo tessuto che cade facilmente a pezzi) viene messo in un mezzo liquido agitato (l’agitazione permette lo scambio gassoso a differenza del mezzo solido), rompendolo. Questo permette il rilascio di singole cellule, che vengono poi trasferite in un altro mezzo fresco.

Le colture in sospensione di cellule hanno un grande vantaggio rispetto a quelle stazionarie, dato che permettono alle cellule di essere bagnate in modo uniforme. Inoltre, dato che il mezzo tende ad essere agitato, permette l’aerazione del mezzo, fornendo gas alle cellule. Dato che il mezzo è una sospensione, diventa anche facile manipolare il contenuto della cultura.

Come ogni altra coltura, la coltura di cellule in sospensione deve essere in condizioni controllate, dimostrando alle cellule un ambiente ideale per proliferare. Una volta che raggiungono circa l’80 per cento di confluenza, è il momento di sottocoltura al fine di garantire la continua crescita adeguata.

* L’80 per cento di confluenza si riferisce allo stato in cui l’80 per cento della superficie della coltura è coperto dalle cellule in crescita.

In alcuni casi, le cellule in sospensione possono aderire alla superficie di plastica della beuta di coltura o addirittura formare grumi. In questi casi, una pipetta può essere usata per raccogliere queste cellule ed espellerle sulla superficie del pallone e quindi lontano dalla superficie di plastica. Questo helpsobtain singole cellule dato che non sono aderire alla superficie di plastica.

Sospensione di cellule rosse del sangue

• (sinistra: senza emolisi) sospensione di cellule rosse del sangue (0,5% RBC di pecora in soluzione salina), sembra rosso e opaco.
• (centro: senza emolisi) RBCs sedimentato spontaneamente per 60 min. Si noti che il surnatante non è colorato.
• (a destra: emolisi) La sospensione di RBC trattata con l’emolisina di S. pyogenes a 37C per 30 min, diventa trasparente per emolisi.

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Conteggio delle cellule

Contare il numero di cellule in una sospensione è un processo che comporta l’uso di una colorazione. Per esempio, quando viene usato il blu trypan, penetra la membrana cellulare delle cellule morte, ma non le cellule vive.

Le cellule vengono poi espulse delicatamente in un emocitometro (contiene la camera di conteggio) sotto il vetrino e osservate al microscopio. Le cellule vengono poi contate entro un dato numero di quadrati per i calcoli.

Significato

Questo metodo è largamente preferito per il fatto che permette alle cellule di essere sospese in una soluzione piuttosto che essere tenute in un supporto solido. Qui, quindi, diventa più facile manipolare il contenuto evitando che si formino degli ammassi. Con le sospensioni cellulari, è anche più facile osservare le singole cellule al microscopio.

In questo caso, diventa possibile non solo studiare la struttura delle cellule, ma anche arrivare a osservare quanto bene si sono differenziate; vedendo le cellule morte e vive al microscopio.

Protocollo di coltura cellulare

I protocolli di coltura cellulare hanno lo scopo di assicurare che le procedure di coltura siano eseguite secondo gli standard richiesti. Questo non è solo per prevenire la contaminazione delle cellule, ma anche per garantire che i ricercatori stessi siano protetti da qualsiasi forma di contaminazione.

Inoltre, ci si aspetta che la natura del lavoro sia conforme alle linee guida etiche appropriate. Pertanto, prima di ogni altra cosa, è essenziale assicurarsi che l’intera procedura sia conforme alle linee guida etico-mediche e di sperimentazione animale. Questo perché andare contro tale legislazione e linee guida può portare a pesanti sanzioni e persino alla chiusura del laboratorio.

Prima di iniziare qualsiasi lavoro, eseguire la seguente procedura:

• Assicurarsi che l’area di lavoro sia disinfettata (usando il 70% di etanolo)
• Utilizzare sempre un nuovo paio di guanti. Se un paio di guanti deve essere usato per un’altra procedura di coltura cellulare, devono essere sanificati con etanolo al 70% e lasciati asciugare all’aria.
• Tutte le attrezzature che sono state tolte dall’armadietto dovrebbero anche essere sanificate per prevenire qualsiasi contaminazione
• Tali attrezzature come pipette, vasi di vetro e plastica da usare per la procedura dovrebbero essere sterilizzate in autoclave

Anche se ci sono una vasta gamma di mezzi di coltura per le cellule, è importante tenere a mente che le colture cellulari, e in particolare le colture cellulari primarie sono facilmente soggette a contaminazione, oltre al rischio di contenere virus non rilevati. Per questo motivo, tutto il materiale dovrebbe essere trattato come potenzialmente infettivo al fine di evitare qualsiasi infezione.

Inoltre, per motivi di sicurezza, il lavoro sulla coltura cellulare dovrebbe essere effettuato nella cappa a flusso laminare appropriata, dove l’aria è diretta lontano dal ricercatore.

Protocolli per la preparazione della coltura cellulare

Controlla sempre le informazioni sul contenitore per assicurarti che il mezzo sia appropriato per la cellula da coltivare,

Una volta preparata, la coltura cellulare dovrebbe essere mantenuta sotto la gamma di temperatura raccomandata,

Monitorare la coltura ogni 30-48 ore e controllare la confluenza (quando le cellule coprono completamente la superficie della coltura) – Tuttavia, questo dipende in gran parte dal tipo di cellule.

Una volta che la procedura è completata e le cellule sono state analizzate, la cultura dovrebbe essere opportunamente scartata. Qui, è importante prendere molta cautela dato che a questo punto le cellule hanno già proliferato e sono aumentate di numero. Inoltre, ci sono alte probabilità che il campione sia stato contaminato, il che aumenta i rischi di causare infezioni al ricercatore se non gestito in modo appropriato.

Smaltimento

• Per oggetti come bisturi, vetrini e vetrini, tra gli altri, la de-contaminazione può comportare la sterilizzazione a 121 gradi Celsius e 15 psi (pressione) per almeno 30 minuti. Tuttavia, se devono essere scartati, è importante che siano messi in un sacchetto di plastica e nel contenitore appropriato per essere inceneriti in seguito.
• Con i rifiuti liquidi, la disinfezione chimica è uno dei migliori metodi attraverso cui il prodotto di scarto può essere disattivato. Prodotti chimici come la candeggina possono essere usati a questo scopo prima di versare il liquido nello scarico del lavandino.
• Per i rifiuti solidi, essi vengono raccolti in un sacchetto di plastica per essere inceneriti. D’altra parte, possono essere prima autoclavati prima di essere inceneriti.

Conclusione

In generale, la coltura cellulare, sia che si tratti di utilizzare una sospensione o un mezzo stazionario, comporta la crescita di cellule in un ambiente artificiale con condizioni favorevoli. Mentre l’azione enzimatica può essere usata per ottenere cellule per la coltura, è il metodo di disaggregazione meccanica che è più preferito dato che fornisce un modo più semplice e meno traumatico di ottenere cellule.

Questo metodo comporta semplicemente il taglio di un tessuto in pezzi più piccoli da cui le cellule fuoriuscite sono poi raccolte. Anche la tecnica degli espianti primari può essere usata per ottenere le cellule. Tuttavia, questo metodo è utile soprattutto per la disaggregazione di piccole quantità di tessuto.

Mentre qualsiasi cellula può essere usata in colture per osservare il suo comportamento, i tessuti embrionali sono preferiti (per le cellule primarie) rispetto alle cellule adulte perché forniscono cellule che sono più vitali e possonorapidamente proliferare.

Qui, è anche importante garantire che le cellule siano in quantità maggiore dato che il loro tasso di sopravvivenza tende ad essere inferiore rispetto alle sottocolture. I

Al fine di migliorare il successo delle colture, è anche importante garantire che i danni alle cellule siano ridotti al minimo sia durante la raccolta che il trattamento delle cellule. Questo è in aggiunta all’utilizzo dell’appropriatezza del medium per le cellule in questione.

Sulla stessa linea, dai un’occhiata ai tipi e alle tecniche di coltura dei tessuti.

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