Cell Culture and the Establishment of Cell Lines
Cell culture and cell lines have assumed an important role in studying physiological, pathophysiological and the differentiation processes of specific cells. Permettono l’esame delle alterazioni graduali nella struttura, biologia e composizione genetica della cellula in ambienti controllati. Questo è particolarmente prezioso per i tessuti complessi, come il pancreas, che è composto da vari tipi di cellule, dove l’esame in vivo delle singole cellule è difficile, se non impossibile. L’estrema difficoltà nell’isolamento e purificazione di singole cellule epiteliali da tessuti complessi mantenendo le loro caratteristiche native ha ostacolato la nostra comprensione delle loro caratteristiche fisiologiche, biologiche, di crescita e differenziazione.
Sono stati fatti tentativi di coltivare quasi tutti i tessuti, comprese le cellule neuronali, ossee, cartilagine, cellule ciliate, ecc. In generale, le cellule animali, in particolare i fibroblasti, possono essere coltivate con più successo delle cellule umane, e i fibroblasti umani sono più facili da coltivare delle cellule epiteliali. Inoltre, diverse cellule epiteliali mostrano risposte diverse alle condizioni di coltura. Nonostante i progressi nelle tecniche di coltura, le cellule epiteliali umane non possono essere mantenute in coltura per lunghi periodi di tempo. Il problema è la tendenza delle cellule umane a subire la senescenza dopo una certa divisione cellulare. La trasfezione di queste cellule con il gene E6E7 del papilloma virus umano 16, o con il piccolo e grande antigene T del virus delle scimmie (SV) 40 ha parzialmente superato la senescenza e ha aumentato la longevità cellulare in vitro, ma non ha portato all’immortalità delle cellule. Le manipolazioni genetiche risultanti limitano l’uso di queste cellule per studi di biologia molecolare, specialmente per definire i cambiamenti genetici che avvengono durante la differenziazione e la trasformazione cellulare. L’introduzione di questi geni estranei altera la funzione dei geni regolatori dell’ospite, compresa l’inattivazione della proteina soppressore del tumore p53 e della proteina del retinoblastoma pRb. Anche se queste linee cellulari non crescono in agar morbido, che sarebbe un primo segno di trasformazione, o quando vengono introdotte in topi nudi, la trasfezione aggiuntiva con alcuni oncogeni come k-ras ha portato alla trasformazione maligna delle cellule.
La qualità del mezzo di coltura e la tecnica di preparazione delle cellule sono molto importanti per il mantenimento delle cellule epiteliali umane in cultura. Usando un mezzo di coltura definito e una tecnica di separazione cellulare, le cellule epiteliali pancreatiche umane sono state mantenute in coltura per più di 10 mesi. Un altro metodo recentemente scoperto per prolungare la durata della vita delle cellule umane, è l’infezione delle cellule con la telomerasi, un enzima che impedisce la perdita dei telomeri per aggiunta de novo. Ripristina la lunghezza dei telomeri, che altrimenti si accorciano con ogni proliferazione cellulare, portando alla senescenza. Finora, i rapporti di successo includono fibroblasti immortalizzati, retina e cellule endoteliali.
Sono stati fatti tentativi per identificare e coltivare cellule staminali di tessuti specifici perché queste cellule possono adattarsi meglio alle condizioni ambientali e possono dare origine a una varietà di cellule mature in ambienti specifici. Per esempio, è stato dimostrato che le cellule del colon in coltura contenenti cellule staminali possono dare origine a cellule neuroendocrine, cellule del colon o a una miscela di queste. Pertanto, tali colture forniscono ampie opportunità per studiare i percorsi di differenziazione e forniscono uno strumento unico per testare gli effetti delle sostanze naturali e sintetiche, tra cui citochine, fattori di crescita, nutrienti e fattori fisici nella maturazione o morte delle cellule.
I meccanismi di trasformazione maligna possono essere studiati in vitro utilizzando linee cellulari trattate con un carcinogeno o radiazioni in coltura. Possono essere studiati cambiamenti fenotipici, genetici (per esempio livelli di addotti al DNA, alchilazioni, mutazioni) e cromosomici graduali. Possono essere espressi marcatori specifici associati alla trasformazione, come il fattore di crescita tumorale-α (TGF-α) e il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR). Sfortunatamente, non è stato possibile fino ad oggi trasformare le cellule epiteliali umane in coltura, quindi esiste ancora la necessità di modelli animali. I roditori sono molto più suscettibili alla carcinogenicità rispetto agli esseri umani.