3 Amylase Inhibitors
α-Amylase (1,4-α-d-glucan-glucanohydrolase, EC3.2.1.1) è una endoglucanasi che catalizza l’idrolisi dei legami endo α-(1,4) glicosidici nell’amido e nei polisaccaridi correlati. L’idrolisi dell’amido è catalizzata prima dall’α-amilasi presente nella saliva umana seguita dall’amilasi pancreatica nel duodeno. L’α-amilasi pancreatica umana (HPA) è un importante bersaglio farmacologico per il trattamento del diabete di tipo 2. Tuttavia, la spesa per l’HPA è relativamente alta per scopi di ricerca. Invece, l’α-amilasi del pancreas suino (PPA) è usata nella misurazione della digestione in vitro. La PPA è composta da 496 residui aminoacidici e mostra l’83% di identità con la sua controparte umana HPA (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). La PPA è un’amilasi di tipo endo e catalizza l’idrolisi dei legami glicosidici interni α-(1,4) nell’amilosio e nell’amilopectina attraverso un attacco multiplo verso l’estremità non riducente (Robyt & French, 1970). I prodotti dell’idrolisi dell’α-amilasi pancreatica suina sono principalmente maltosio, maltotriosio e maltotetraosio (Yook & Robyt, 2002). PPA ha due isomeri PPA isoenzima-I (PPA-I) e PPA-II, che hanno lo stesso peso molecolare ma differiscono leggermente nella composizione aminoacidica e nel punto isoelettrico (Pasero et al., 1986).
Gli inibitori naturali dell’α-amilasi includono quelli a base di proteine e metaboliti secondari. I primi non rientrano nello scopo di questo articolo perché tendono a denaturare al trattamento termico o acido (acidità di stomaco) e perdono la loro attività quando raggiungono l’intestino tenue. Qui, riassumiamo la letteratura più recente sugli inibitori dell’α-amilasi. I metodi utilizzati per misurare la loro attività di inibizione sono anche elencati perché metodi diversi possono risultare in diversi valori di IC50. Rispetto all’α-glucosidasi, si trovano meno rapporti sull’α-amilasi e la maggior parte degli studi sono sui polifenoli.
Isookanin (57) (Fig. 3.8) isolato da aghi spagnoli, Bidens bipinnata, ha mostrato una moderata attività di inibizione sull’HPA (IC50 di 0,447 mg/mL o 156 μM) misurata utilizzando il saggio iodometrico (Yang et al., 2012). Va notato che l’isookanina contiene due unità catecoliche, e quindi ci si aspetta che sia un buon riduttore, che può ridurre lo iodio causando risultati falsi positivi.
Figura 3.8. Strutture chimiche degli inibitori dell’amilasi, composti 57-59, acido 5-caffeoil chinico e acido 4,5-dicaffeoil chinico.
Dalla foglia dell’acqua applicata (Syzygium aqueum), la miricetina-3-O-rhamnoside (9) ed europetina-3-O-rhamnoside (10) (Fig. 3.2) sono stati isolati, e l’attività di inibizione dell’α-amilasi è stata misurata usando il saggio DNSA per essere 10 volte (EC50 di ~ 2,0 μM) più forte dell’acarbosio (EC50 di 19 μM). Un’attività così elevata è abbastanza raramente vista nei composti polifenolici e richiede ulteriori indagini in particolare sul suo meccanismo di inibizione e la selettività quando questi composti sono sfidati con la matrice alimentare complessa. La miricetina è un forte radical scavenger e quindi la stabilità di 9 e 10 è anche una preoccupazione. Gli autori hanno riferito che la quercetina ha un EC50 comparabile (17 μM) a quello dell’acarbosio (19 μM). Utilizzando il test di torbidità che abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio, non abbiamo potuto rilevare alcuna attività di inibizione della quercetina contro l’α-amilasi pancreatica utilizzando l’acarbosio come standard di riferimento (Huang et al., risultati non pubblicati). Pertanto, è necessario verificare se l’EC50 riportato è dipendente dal metodo per escludere potenziali artefatti (Manaharan et al., 2012). Anche il Cleistocalyx operculatus appartiene alla famiglia delle Myrtaceae. Hu, Luo, Li, Joshi e Lu (2012) hanno isolato e purificato il 2′4′-diidrossi-6′-metossi-3′5′-dimethylchalcone (DMC) dalle gemme di fiori essiccati di C. operculatus. Il composto ha mostrato un meccanismo inibitorio non competitivo verso PPA (Hu et al., 2012).
Tiliroside (58) (Fig. 3.8), isolato dai semi di rosa canina, Rosa canina L., inibisce PPA con IC50 di 280 mM, e lo studio cinetico mostra che è un inibitore non competitivo con valori Ki di 84,2 μM quantificati usando p-nitrofenil-alfa-d-pentaglucoside come substrato. A differenza dell’acarbosio, il tiliroside non mostra alcuna attività di inibizione contro l’α-glucosidasi. Forse a causa della sua debole attività di inibizione dell’α-amilasi nel modello animale, la tiliroside ad alto dosaggio (600 mg/kg) è necessaria per ridurre la concentrazione di glucosio plasmatico postprandiale dei topi trattati con amido a 2 g/kg. La tiliroside può esibire un’antiiperglicemia attraverso l’inibizione sia del trasportatore di glucosio 1 che del trasportatore di glucosio 2 mediato dal sodio negli enterociti (Goto et al., 2012).
La curcumina e i suoi derivati sono stati indicati come composti multitarget che hanno una vasta gamma di benefici per la salute. Come agente potenziale per mitigare i tassi di digestione dell’amido, la bisdemetossicurcumina (59) (Fig. 3.8) dal rizoma della Curcuma longa ha un’attività di inibizione di HPA e PPA con valori IC50 di circa 25 μM usando il saggio DNSA. Lo studio cinetico mostra che è un inibitore non competitivo dell’HPA con un Ki apparente di 3,0 μM (Ponnusamy et al., 2012).
Gli acidi caffeoilchinici mono- e disostituiti sono i principali composti polifenolici presenti nei chicchi di caffè verde. A causa della presenza di tre gruppi idrossilici secondari nell’anello dell’acido chinico, ci sono tre isomeri di posizione interconvertibili di acidi caffeoilchinici monosostituiti e tre acidi chinici dicaffeoil, che sono stati tutti purificati dai chicchi di caffè verde. La loro attività di inibizione su PPA-I (Narita & Inouye, 2011) è stata misurata usando p-nitrofenil-diglucoside, che produce p-nitrofenolo e maltosio durante l’idrolisi. È notevole che l’attività inibitoria è altamente dipendente dalla posizione dei gruppi caffeoilici nell’acido monocaffeoil chinico. L’acido 5-caffeoilchinico (o comunemente noto come acido clorogenico) (Fig. 3.8) ha la maggiore attività di inibizione con IC50 di 80 μM, rispetto a quella dell’acido 4-caffeoilchinico (120 μM) e dell’acido 3-caffeoilchinico (230 μM). Per i tre isomeri dell’acido dicaffeoil chinico, l’attività inibitoria è molto più alta e non sono così sensibili alla posizione dei gruppi esteri perché gli acidi 3,4- e 4,5-dicaffeoil chinico (Fig. 3.8) hanno gli stessi valori di IC50 (20 mM), e l’acido 4,5-dicaffeoil chinico ha IC50 di 30 μM (Narita & Inouye, 2011).