DR. EDWIN B. ASTWOOD a modern endokrinológia látnoka volt. A Roy Greep és Monte Greer által írt életrajzi emlékirat így zárult: “Dr. Edwin B. Astwoodnak konkrét kutatási hozzájárulásain túlmenően olyan mértékben sikerült kevesek által elért eredményeket elérnie a természettudományok és a klinikai orvostudomány közötti széles terület átfogásában”. Számomra ez a legmagasabb hivatás az endokrinológiában.”

A hatvanas évek végét és a hetvenes évek elejét két csoport, Dr. Andrew Schally és Roger Guillemin hihetetlen eredményei jellemezték, akik izolálták, jellemezték és szekvenálták a hipotalamusz szabályozó hormonjait. Az első szekvenált hipotalamikus szabályozó hormon a TRH volt (egy tripeptid), a második a gonadotropin-releasing hormon (egy dekapeptid), a harmadik pedig a 14 aminosavból álló szomatosztatin. A GHRH létezésére már az 1960-as évek elején utalt Reichlin néhány klasszikus kísérlete (1); ő a hipotalamuszban végzett léziókat, és kimutatta, hogy az agyalapi mirigy GH-tartalma csökken. Ezen adatok alapján azt sugallta, hogy a hipotalamuszban kell lennie egy GHRH-nak.

Az orvosi képzésemet az angliai Londonban végeztem, endokrinológiai képzésemet Prof. G. Michael Besser vezetésével. Az egyik legélvezetesebb konferencia, amelyen rendszeresen részt vettünk, a Royal Society of Medicine klinikai esetek bemutatása volt. Bevésődött az emlékezetembe, hogy minden alkalommal, amikor egy akromegáliás beteget mutattak be, Prof. Peter Sonksen megkérdezte, hogy a betegnél van-e karcinoid daganatra utaló jel vagy sem. A hallgatóságban az volt a felfogás, hogy “Miért teszi fel ez az ember mindig ezt a kérdést?”, mert ilyen esetek valószínűleg nem léteznek, vagy ha igen, akkor nagyon ritkán!”

1977-ben a St. Bartholomew’s Hospitalból (London, Anglia) a Virginiai Egyetemre költöztem. Fő érdeklődési köröm akkoriban a PRL-szekretáló hipofízis-tumorok és azok orvosi kezelése volt.

1980 októberében egy 21 éves beteget Dr. Ann Johanson utalt hozzám. Ennek a betegnek amenorrheája és galactorrheája volt, miközben szájon át szedhető fogamzásgátlót szedett a gonádok szteroid pótlására. Turner-szindrómából eredő gonád agenezise volt.

A kiértékelése a koponya röntgenfelvételen megnagyobbodott hypophysis fossa-t, a komputertomográfiás felvételen szerény suprasellaris kiterjedésű hypophysis tömeget, és 68 μg/L-es emelkedett szérum PRL-t mutatott ki. A 95 μg/l-es emelkedett szérum GH nem szupprimált orális glükózzal, TRH hatására emelkedett, és dopamin infúzióval szupprimált. Szérum inzulinszerű növekedési faktor (IGF)-I szintje 11 U/ml-re emelkedett (normális, 0,41-2,2 U/ml).

Az eredmények alapján egyértelmű volt az akromegália diagnózisa. Érdekesség, hogy a beteg testmagassága 180 cm volt, ami egy Turner-szindrómás beteg esetében igen magasnak számít. Ebben a tekintetben szerencsés volt, hogy a szérumokat megőrizték az előző 7 évből. A szérum GH-koncentrációja az egész idő alatt emelkedett volt (1. táblázat).

A beteget transzszfenoidális műtétre utalták, amelyet 1981. január 15-én végeztek el. Hét héttel a műtét után még mindig akromegáliás volt; a szérum GH 52 μg/L volt, az IGF-I pedig továbbra is emelkedett, 7,7 U/ml.

A folyamatban lévő együttműködés részeként az agyalapi mirigy patológiai mintákat Dr. Kalman Kovacsnak (St. Michael’s Hospital, Toronto, Kanada) küldték el. Valamivel később Dr. Kovacs felhívott, hogy közölje velem a szövetek vizsgálatának eredményét. A jelentése azt mutatta, hogy a betegnek szomatotrófiás hiperpláziája van, és nem hipofízisdaganata. A diagnózishoz vezető okok a következők voltak: 1) a retikulin mintázat megmaradt (a tumorokban elpusztul) (1. ábra); 2) a szomatotrófok túlsúlyban voltak, bár a tirotrófok, gonadotrófok és kortikotrófok elszórtan előfordultak; és 3) a szomatotrófok elektronmikroszkópos vizsgálata jól fejlett endoplazmatikus retikulumot és Golgi-apparátust mutatott, ami aktív hormonszintézisre utal (2. ábra). Mivel a szomatotrófok sűrűn tele voltak szekréciós granulákkal, ez azt sugallta számomra, hogy ez a hormonfelszabadulás gátlását tükrözi a szekretált GH visszacsatolása miatt, feltehetően a szomatosztatin-szekréció (és/vagy az IGF-I) fokozása révén.

Az agyalapi mirigy szövettana alapján egyértelmű volt, hogy az agyalapi mirigyet egy extrinsic faktor stimulálja. Nem volt valószínű, hogy ez a GHRH-receptor mutációjának vagy a GHRH-receptorhoz kapcsolt G-fehérje konstitutív aktivációjának köszönhető, mert ez valószínűleg egyetlen sejtben történne, ami tumor kialakulásához és a retikulinmintázat lebomlásához vezetne. Ezért sokkal valószínűbb volt, hogy az agyalapi mirigyet egy külső faktor, vagy a hipotalamuszból vagy a perifériáról érkező GHRH stimulálta. Másodszor, a tartós akromegália elengedhetetlenné tette, hogy megtaláljuk a beteg akromegáliájának okát. Ebben az időben Frohman és munkatársai (2) cikke beszámolt egy GH-felszabadító aktivitású peptid részleges tisztításáról és jellemzéséről akromegáliás betegek extrapituitiszes tumoraiból.

A hasi komputertomográfiás vizsgálat egy 5 cm átmérőjű tumort mutatott ki a hasnyálmirigy farkában. A daganatot 1981. augusztus 26-án eltávolították. Jól be volt kapszulázva, és a szövettani vizsgálat során megállapították, hogy szigetsejtes daganat. A daganat azonban nem volt sem β-, sem α-sejtes daganat. Erősen pozitív volt neuron-specifikus enolázra, és immunfestésen negatív volt GH-ra, inzulinra, glükagonra, kalcitoninra és ACTH-ra, szomatosztatinra pedig kétértelműen festődött.

A tumor immuncitokémia szerint nem tartalmazott GH-t. A tumor eltávolítását követő első 2 órában a szérum GH-szintje gyorsan, 70 μg/L-ről 3 μg/L-re csökkent (3. ábra) (3). A beteget most már 18 éve követik, és továbbra is gyógyult az akromegáliából.

A következő kérdés az volt, hogy mi legyen a hasnyálmirigy-tumorral. Abban az időben szerencsém volt, hogy a néhai Dr. Michael Cronin kollégám volt a Virginiai Egyetemen. Michael eljött velem a műtőbe, hogy segítsen megvalósítani a tumor kezelésére gondosan kidolgozott stratégiánkat. A daganat felét felkockáztuk, és azonnal folyékony nitrogénbe tettük, a másik felét pedig előkészítettük a szövettenyésztéshez. Az utóbbit elküldtük több olyan csoportnak, amelyek a stabil sejtvonalak létrehozásának szakértői voltak. Michael Croninnak sikerült kimutatnia, hogy a daganatot fürdető közeg GHRH-aktivitást tartalmazott, és serkentette az adenilát-ciklázt (4). A tumort eredetileg Dr. Wylie Vale-nek adták át a Salk Intézetben (La Jolla, Kalifornia), aki később egy részét Dr. Guillemin-nek adta át. A két csoport egymástól függetlenül megállapította, hogy magas GHRH-aktivitást tartalmaz, és képesek voltak izolálni a GHRH-t a tumorból, jellemezni és szekvenálni (5-8). Az ebből a tumorból származó GHRH egy 40 aminosavból álló peptid volt, amely homológiát mutat a glükagon/szekretin/VIP peptidcsalád tagjaival.

Azért választottam az endokrinológiát szakterületemnek, mert mentoraim lenyűgözték bennem az élettan alkalmazásának fontosságát az endokrin betegségben szenvedő betegek patofiziológiájának és terápiájának megértésében.

Minden beteg, akit látunk, a természet kísérlete. Nagyon szerencsés voltam, hogy beutalták ezt a beteget, aki lehetővé tette számomra és kollégáim számára, hogy a tumort két vezető csoport rendelkezésére bocsássuk, akik aztán képesek voltak a régóta keresett GHRH izolálására, jellemzésére és szekvenálására. Valójában a GHRH volt az egyik első hipotalamikus hormon, amelyet kerestek, de sok téves kezdet volt.

Miatt 1982-ben több okból is sikerült sikeresen jellemezni és szekvenálni a GHRH-t. Először is, a tumorkivonatok aktivitásának értékelésére szolgáló módszerek finomodtak, és sokkal érzékenyebbek voltak. Másodszor, a mikroszekvenálási módszerek jelentősen javultak az előző 10 évhez képest. De a harmadik, és valószínűleg a legfontosabb ok az volt, hogy ez a tumor nagy koncentrációban tartalmazott GHRH-t és nagyon kevés szomatosztatint. A szomatosztatin gátolja a GH felszabadulását a biotesztben, így jelenléte megzavarta a GHRH tisztításának nyomon követését. Az ebből a tumorból származó kivonat jelentősen leegyszerűsítette a folyamatot (mivel magas GHRH-koncentrációjú volt, és kevés szomatosztatin volt jelen), szemben a korábbi kísérletekkel, amelyekhez több százezer állati hipotalamit használtak, amelyek szomatosztatinban gazdagok voltak, és nagyon kis GHRH-koncentrációjúak. Ez volt az első példa arra, hogy egyetlen emberi tumort használtak fel egy hormon azonosítására és izolálására. A PTH-val kapcsolatos fehérjét hasonló technikával izolálták egy emberi tumorsejtvonal felhasználásával.

Klinikusokként mindannyiunk felelőssége, hogy azonosítsuk a természet kísérleteit, és megragadjuk a lehetőségeket olyan kérdések feltevésére, amelyekre más módon nagyon nehéz lenne választ adni. A természet kísérletei gyakran egyediek, és minden bizonnyal az ezt megelőző 15 vagy 20 beteg adott támpontokat arra, hogy egy ektopikus GHRH-szekrécióval rendelkező beteg tumora választ adhat a GHRH természetére és szerkezetére vonatkozó kérdésre. Valójában Dr. Guillemin csoportja később tudomást szerzett egy másik, Dr. Genevieve Sassolas-tól (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Franciaország) származó tumorról, és mivel több szövetük volt ebből a tumorból, agresszívebben tanulmányozták, mint a Charlottesville-ből származó tumort. Azonban az eredeti Charlottesville-i tumor volt az, ami azt sugallta, hogy egy ilyen tumor adhatja a kulcsot a GHRH kereséséhez.

A GHRH fiziológiájának és terápiás potenciáljának későbbi tanulmányozása, mint a gyermekkori GH-hiány kezelésének lehetősége, állt csoportunk munkájának középpontjában az elmúlt 17 évben (9, 10). Kezdetben normál önkénteseknek adtuk be a GHRH-t, és bizonyítottuk hatékonyságát és specifitását a szérum GH-koncentráció növelésében (11). Ezután idiopátiás GH-hiányban szenvedő gyermekeknél meghatároztuk a GHRH akut injekciójára adott GH-választ (4. ábra). Sok gyermeknél nagyon erőteljes GH-növekedést tapasztaltunk, míg néhányuknál csak kis mértékű volt a növekedés, vagy egyáltalán nem (12); a GHRH-ra adott válasz nagyobb volt, mint az argininre és az l-dopára adott válasz. Ezen eredmények alapján azt javasoltuk, hogy sok idiopátiás GH-hiányos gyermek valóban GHRH-hiányban szenved.

A GHRH-kezelés multicentrikus vizsgálatát ezután kezdeményeztük. Ez különösen helyénvalónak tűnt, mivel a GH-hiány kezelésére használt GH-t holttestekből nyerték, és a Jacob Creutzfeld-kór átvitelében is szerepet játszott. Összesen 24 gyermeket kezeltek; 10 gyermeknél pumpát használtak, hogy 3 óránként sc GHRH-boluszt adjanak be. Ezt az utat és dózist úgy választották, hogy utánozzák a normális fiziológiát, azaz a növekvő gyermekeknél 3 óránként körülbelül egy GH-impulzust. Ezenkívül 10 gyermeket csak éjszakánként 3 óránként kezeltek a pumpával, 4 gyermek pedig naponta kétszer kapott sc GHRH-injekciót. A gyermekek növekedési sebességét a kezelés előtt és 6 hónapos kezelés után az 5. ábra mutatja (13).

A vizsgálat eredményei alapján a Serono Laboratories, Inc. 12 hónapos multicentrikus vizsgálatot indított a naponta egyszer sc-ben beadott GHRH(1-29)-NH2-vel (14). A leglassabban növekvő gyermekek növekedési sebessége növekedett a legnagyobb mértékben (6. ábra). Ez arra utal, hogy a GHRH helyreállíthatja a fiziológiás GH-szekréciót. A GHRH-t az Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal diagnosztikai célra, valamint gyermekek GH-hiányának kezelésére engedélyezte. A GHRH biztonságos és hatékonyan gyorsítja a növekedési sebességet a GH-hiányos betegek többségénél.

A GHRH szintézisének idején nagy érdeklődés övezte a gonadotropin felszabadító hormonra adott gonadotropinválasz lefelé történő szabályozását. Kíváncsivá tett bennünket egy másik beteg megfigyelése, akinek ektopikus GHRH-szekréciója egy metasztatikus carcinoid tumorból származott, és akromegáliát okozott. Annak ellenére, hogy a GHRH-szint 24 órán keresztül tartósan emelkedett volt, a GH-felszabadulás mintázata mégis pulzáló volt, ami arra utal, hogy feltehetően más tényezők is részt vesznek a GH-szekréció pulzáló mintázatának szabályozásában (15). Felvetődött, hogy ez a szomatosztatin megvonásának tudható be. Így az ektopikus GHRH-szekréció egyértelműen bizonyítja, hogy egy hosszú hatású GHRH-agonista képes növelni a pulzatilis GH-szekréciót. Folyamatos iv GHRH-infúziós vizsgálatok normális alanyokon ugyanezt a jelenséget mutatják, és így egyértelmű, hogy a GHRH depotkészítménye hasznos terápiás szer lehet.

A mi csoportunk (16) és Mayo (17) klónozta a GHRH-receptort. Érdekes, hogy a GHRH-receptor a G-fehérje-kapcsolt receptorok B osztályának tagja, amelybe a glükagon/szekretin peptidcsalád, valamint a CRH, a kalcitonin és a parathormon receptorai tartoznak. Szerkezetük teljesen különbözik a nagyobb rhodopszin (A család) receptorokétól. Azonban ebben a receptorcsaládban is hét transzmembránon átívelő domén található.

A GHRH kritikus szerepét bizonyítja a törpe lit egér, amely a GHRH receptorban pontmutációval rendelkezik (18, 19). Wajnrajch és munkatársai (20) leírtak egy nonszensz mutációt (Glu 72stop) a humán GHRH-receptorban, amely növekedési zavarokat és GH-hiányt okoz két, ugyanabból az indiai moszlim rokonságból származó gyermeknél. Maheshwari és munkatársai (21) a pakisztáni Sindh völgyében egy ugyanilyen mutációval rendelkező rokonságot írtak le. E rokonság tagjai extrém alacsony termetűek. A receptor egy másik mutációját egy nagy brazil rokonságban írták le, amely több mint 110, súlyos GH-hiányban és extrém alacsony termetben szenvedő egyént tartalmaz (22). Ezek a természeti kísérletek bizonyítják, hogy a GHRH-receptor hibája károsítja a normális növekedést, és hangsúlyozzák a GHRH létfontosságú jelentőségét.

A GHRH-receptor karikatúrája a 7. ábrán látható (10). A startkódontól számított 60. pozícióban lévő aszparaginsav a lit egérmutáció helye. A humán GHRH receptor szekvenciáján alapuló peptidre nevelt C-terminális GHRH receptor antiszérummal végzett Western blottingot a GHRH receptor komplementer DNS-ével transzfektált HEK293 sejtekből származó membránok vizsgálatára használtuk. A vizsgálatok azt mutatják, hogy a lit egér receptor fehérjévé transzlálódik, és valóban jelen van a lit egér hipofízis sejtjeinek membránjában. Azt javasoltuk, hogy ez a mutáció a receptor tercier szerkezetének megváltozásához vezet, ami megakadályozza a kötődést (23). Fényaffinitású szondákat használva bizonyítékaink arra utalnak, hogy más helyek is a megkötött GHRH közvetlen közelében vannak, ami arra utal, hogy a jelátvitelhez valószínűleg több kölcsönhatási hely szükséges. A rekombináns receptor elérhetősége lehetővé teszi a nem-peptid GHRH agonisták keresését.

Összefoglalva, egyetlen akromegáliás beteg gondos megfigyeléséből nyert ismeretek vezettek a GHRH izolálásához, jellemzéséhez és szintéziséhez. További vizsgálatok vezettek a GH-hiány GHRH-kezelésének bevezetéséhez. Ezt követően másokkal együtt sikerült klónozni a GHRH receptorát. A GHRH-val végzett vizsgálatok megerősítették, hogy a GH szintézishez és a normális növekedéshez nélkülözhetetlen. Ezt az álláspontot mostanra megerősítették azok a megfigyelések, hogy a GHRH receptor inaktiválását eredményező mutációk mély GH-hiányhoz és súlyos alacsony termethez vezetnek, és teljessé teszik a GH GHRH általi szabályozásáról alkotott ismereteink körét.

.