A sejtkultúra lényegében a sejtek mesterséges környezetben (in vitro) történő elosztását jelenti, amely a sejtek növekedéséhez és szaporodásához szükséges tápanyagokból, ideális hőmérsékletből, gázokból, pH-ból és páratartalomból áll.

• In vivo – Amikor a vizsgálat élő biológiai egységeket érint a szervezetben.

• In vitro – Amikor a vizsgálatot a természetes biológiai környezetükből izolált biológiai egységek (sejtek, szövetek stb.) felhasználásával végzik. Pl. májból vagy veséből izolált szövet vagy sejtek.

Míg a szövetdarabokat megfelelő tenyészetbe lehet helyezni, hogy sejteket állítsanak elő, amelyeket aztán tenyésztésre lehet használni (explantkultúra), addig a szövetekből (lágyszövetekből) enzimatikus reakciókkal lehet sejteket nyerni. Az olyan enzimeket, mint a tripszin és a proname, a szövet lebontására és a kívánt sejtek felszabadítására használják.

Amikor a sejteket közvetlenül a szervezetből/állati szövetből (vagy akár növényi szövetből) enzimatikus vagy mechanikus technikákkal nyerik, az ilyen sejteket elsődleges sejteknek nevezik. Azokat a sejteket azonban, amelyek (az első szubkultúrát követően) speciális körülmények között korlátlan ideig szaporodnak, sejtvonalaknak nevezzük.

Ezeket a sejteket általában hosszú időn keresztül passziválták, aminek következtében homogén (hasonló) genotípusos és fenotípusos tulajdonságokat szereznek.

Morfológia

A sejtek a kultúrában megjelenésük alapján három fő csoportba sorolhatók:

• Fibroblasztikus – Ide tartoznak az általában bipoláris/multipoláris, hosszúkás alakú sejtek. Ezek a sejtek növekedésük során a szubsztrátumhoz tapadnak.

• Epithelialis – Az epithelszerű sejtek sokszögletű alakot érnek el, szabályos méretekkel. Bár általában különálló foltokban nőnek, ezek a sejtek is a szubsztrátumhoz tapadva nőnek.

• Lymphoblast – Ezek a sejtek általában gömb alakúak, és nem tapadnak a szubsztrátum felszínéhez. Ennek eredményeképpen szuszpenzióban tenyésztik őket.

* A szilárd lemezek esetében megszilárdító anyagokat (pl. agar) használnak, ahol a folyékony táptalajt agarral együtt használják.

A sejttenyésztés jelentősége

A sejttenyésztés fontos technika mind a sejt-, mind a molekuláris biológiában, mivel ez biztosítja a legjobb platformot a sejtek normál fiziológiájának és biokémiájának tanulmányozására. A sejt minden élőlény alapvető szerkezeti, funkcionális és biológiai egysége.

A szervezet vagy adott szövetek megértéséhez fontos megérteni, hogyan működnek a sejtek. A sejttenyésztés révén ez lehetővé válik, különösen azért, mert az elsődleges sejtek hasonlítanak a szervezet/szövet szülői sejtjeihez.

Minden, amit a sejtekről in vitro megtanulunk, reprezentálja azt, ami a szervezetben/szövetben történik. Ez teszi a sejttenyésztést jelentősen fontossá a vakcinafejlesztés, a szűrés (gyógyszerek stb.) és az adott betegségek/állapotok diagnosztizálása szempontjából.

Mivel a különböző típusú sejtek különböző környezetet igényelnek a szaporodáshoz, a tenyésztéshez különböző típusú táptalajokat használnak, mint például a szérummentes és a szérumtartalmú táptalajok.

Amikor a megfelelő követelmények biztosítottak, a sejtek száma növekedni fog, és kolóniákat képezhetnek, amelyek aztán könnyen láthatók és azonosíthatók.Mindez azonban megköveteli, hogy megértsük az eljárás célját.

Az eljárás céljának megértése után könnyebbé válik a tenyésztés előkészítése a megfelelő összetevőkkel. Ha a kutató megérti, hogy mi az eljárás célja, tudni fogja, hogy szelektív táptalajt (amely lehetővé teszi bizonyos sejtek növekedését) vagy differenciális táptalajt (amely lehetővé teszi különböző típusú sejtek növekedését) kell-e készítenie.

Elsődleges sejtkultúra

A sejtkultúra olyan folyamat, amelyben a sejteket (állati vagy növényi sejteket) kiveszik a szervezetből, és a növekedéshez kedvező feltételeket biztosító mesterséges környezetbe helyezik. Ez lehetővé teszi a kutatók számára, hogy tanulmányozzák és többet tudjanak meg a sejtekről.

A sejttenyésztésnek három fő típusa van, amelyek a következők:

• primer sejttenyésztés
• szekunder sejttenyésztés, és
• sejtvonal

Itt az elsődleges sejttenyésztésre fogunk koncentrálni.

A primer sejteknek két típusa van:

Adherens sejtek – Más néven horgonyfüggő sejtek, ezek olyan típusú sejtek, amelyeknek a növekedéshez kötődésre van szükségük. Az adherens sejtek mozdulatlanok, és olyan szervekből nyerik őket, mint a vese.

Szuszpenziós sejtek – Ezek olyan típusú sejtek, amelyeknek a növekedéshez nincs szükségük kötődésre. Ezért horgonyzástól független sejteknek is nevezik őket, és ide tartoznak például a vérrendszerben található limfociták.

A primer sejtkultúrában az olyan szülői szövetekből (élő szövetekből) nyert sejteket, mint a máj és a vese, a növekedéshez megfelelő közegbe juttatják. A sejtek kinyerése után a sejtek tenyészthetők explantátumkultúra, szuszpenzió vagy monolayer formájában.

* Az elsődleges sejtkultúrában a sejteket a szülői/élő szövetből kell kinyerni. Azaz nem más tenyésztési folyamatból származnak.

A sejtek tenyésztése előtt először enzimatikus kezelésnek vetik alá őket a disszociáció érdekében. Ennek azonban minimális ideig kell tartania, hogy elkerüljék a sejtek károsodását vagy elpusztulását. Az egyes sejtek kinyerése után megfelelően tenyésztik őket médiában, hogy növekedhessenek (osztódhassanak) és elérjék a kívánt számot.

A kultúra kezdetben általában heterogén, mivel a szövetből nyert különböző típusú sejtekből áll.Bár ez az in vitro folyamat révén fenntartható (a megfelelő táptalajban lévő tenyészetben), ez csak korlátozott ideig lenne lehetséges.

A transzformációs folyamat révén az elsődleges sejtek hosszú ideig felhasználhatók, így a tenyészet idővel megváltozik. Ezeket a sejteket folyamatos sejtvonalaknak nevezik.

A primer sejteket azonban általában előnyben részesítik a folyamatos sejtvonalakkal szemben, mivel (fiziológiailag) jobban hasonlítanak az invivo sejtekhez (az élő szövetből származó sejtekhez). Ezenkívül a folyamatos sejtvonalak bizonyos változásokon mehetnek keresztül (fenotípusos és genotípusos változások), amelyek eltéréseket eredményezhetnek az elemzés során. Mint ilyenek, nem használhatók annak meghatározására, hogy mi történik az in vivo sejtekkel. Ez az oka annak, hogy az elsődleges sejteket előnyben részesítik.

Mivel az elsődleges sejtek jelentősen hasonlítanak az élő szövetből nyert sejtekhez, fontosak kutatási célokra, mivel felhasználhatók funkcióik, metabolikus szabályozásaik, sejtfiziológiájuk, fejlődésük, hibáik és az adott szövetet érintő állapotok tanulmányozására.

Egyebek mellett olyan célokra is használják őket, mint a vakcinagyártás, a géntechnológiai gyógyszerszűrés, valamint a toxicitás vizsgálata és a prenatális diagnosztika.

Sejttenyésztési közegek

A sejttenyésztési technikákban a sejteket (vagy szöveteket)egy növényből vagy állatból eltávolítják, és olyan új, mesterséges környezetbe helyezik, amely képes támogatni a szaporodásukat (túlélésüket és növekedésüket).

Egy ilyen környezet néhány követelménye a sejtek szaporodásához a következők:

• A szubsztrát (tápanyagforrás)
• ideális hőmérsékleti tartomány (szabályozott)
• növesztőközeg, és
• ideális pH többek között

Itt, a táptalajra (sejttenyésztő közegre)

Bár különböző típusú táptalajok léteznek (különböző típusú sejtekhez), ezek jellemzően a következőkből állnak:

• Glükóz
• Aminosavak
• Vitaminok
• Szervetlen sók
• Kötődési tényezők stb.

A táptalajoknak két fő típusa van.Ezek a következők:

természetes táptalaj – A természetes táptalajok a természetben előforduló biológiai folyadékokból állnak. Bár ez a fajta táptalaj számos sejthez használható, legnagyobb hátránya, hogy hiányozhatnak belőle az adott sejtek által igényelt pontos összetevők, ami nagyban befolyásolhatja a reprodukálhatóságot.

Mesterséges táptalaj – A szintetikus táptalajnak is nevezett mesterséges táptalaj olyan típusú táptalajt jelent, amelyet többek között olyan tápanyagok, mint vitaminok, gázok (oxigén és szén-dioxid) és fehérjék hozzáadásával állítanak elő. Ezeket a szerves és szervetlen tápanyagokat úgy adják hozzá, hogy kielégítsék az adott sejtek speciális igényeit, és így ideális környezetet biztosítsanak a növekedésükhöz.

Akként számos célra felhasználhatók, többek között:

• A sejtek azonnali túlélésének biztosítása
• A sejtek hosszabb túlélésének lehetővé tétele
• A sejtek korlátlan növekedésének lehetővé tétele
• Speciális funkciók biztosítása

Másrészt a tenyésztés kategorizálható:

Szelektív táptalaj – Ez egy speciális típusú táptalaj, amely csak bizonyos sejtek növekedését teszi lehetővé. Például a vér agar (amelyet Streptococcus & Moraxella fajok izolálására használnak) antibiotikumok hozzáadásával szelektív táptalajjá alakítható.

Differenciális táptalajok- Az ilyen típusú táptalajok lehetővé teszik a különböző típusú sejtek/mikroorganizmusok növekedését azok anyagcseréjétől függően.

A fent említettek szerint a különböző típusú szintetikus táptalajokat úgy készítik, hogy az adott sejtek számára ideális szaporodási környezetet biztosítsanak. Emiatt a szintetikus közegek négy fő kategóriába sorolhatók.

Ezek közé tartoznak:

Szérumtartalmú közegek – Az ilyen típusú közegekben a szérumot (magzati szarvasmarha-szérum) használják hordozóként többek között a vízben általában nem oldódó tápanyagok és növekedési faktorok számára.

Szérummentes táptalajok – Az ilyen típusú táptalajokat jellemzően egyetlen sejttípus tenyésztésének támogatására állítják elő.Mint ilyen, meghatározott tápanyagokat és más, a sejttípus által szükséges tényezőket biztosít. Ebben a táptalajban nincs szérum, mivel az bizonyos hátrányokkal jár, és az immunológiai eredmények félreértelmezéséhez vezethet.

Kémiailag meghatározott táptalaj – Ahogy a neve is mutatja, ez a táptalajtípus szennyeződésmentes, tiszta szerves és szervetlen összetevőkből áll. Az ilyen típusú közegek összetevőit jellemzően géntechnológiával állítják elő baktériumokban/élesztőben.

Fehérje-mentes közegek – A fehérje-mentes közegek általában nem tartalmaznak semmilyen típusú fehérjét. Nagyrészt arra használják, hogy elősegítsék a sejtek jobb növekedését és a fehérjeexpressziót, valamint megkönnyítsék a kifejezett termék tisztítását.

A sejttenyésztő közegek néhány fő összetevője a következő:

• Tápanyagok – a peptidek és aminosavak biztosítják, amelyek a fehérjék építőkövei
• Szénhidrátok az energiához
• Ellengedhetetlen ásványi anyagok, mint a kalcium, magnézium, foszfátok és vas többek között pufferanyagok, mint például acetátok a táptalaj stabilizálására
• Vitaminok
• PH-változási indikátorok, mint például fenolvörös

A sejttenyésztő táptalajokat a sejtek proliferációjára használják, amelyeket aztán azonosítani és tanulmányozni lehet. Mint ilyen, különböző célokra használható, többek között oktatásra, diagnózisra és betegség kezelésére.

Sejtszuszpenzió

A tenyésztési módszerekben a sejtszuszpenzió a tenyésztés olyan típusára utal, ahol a sejteket folyékony közegben szuszpendálják.

Az egyes sejtek kinyeréséhez egy morzsalékos kalluszt (könnyen széteső kis szövet) tesznek kevert folyékony közegbe (a keverés lehetővé teszi a gázcserét, ellentétben a szilárd közeggel), felbontva azt. Ez lehetővé teszi az egyes sejtek kiszabadulását, amelyeket aztán egy másik friss közegbe helyeznek át.

A szuszpenziós sejtkultúráknak nagy előnye van az álló kultúrákkal szemben, mivel lehetővé teszi a sejtek egyenletes fürdetését. Továbbá, mivel a közeget hajlamos felkavarni, lehetővé teszi a közeg levegőztetését, ami gázokkal látja el a sejteket. Tekintettel arra, hogy a közeg szuszpenzió, a tenyészet tartalma könnyen manipulálhatóvá válik.

Mint minden más kultúrának, a szuszpenziós sejtkultúrának is ellenőrzött körülmények között kell lennie, ideális környezetet biztosítva a sejteknek a szaporodáshoz. Amint elérik a kb. 80 százalékos összefolyást, ideje szubkultúrázni a folyamatos megfelelő növekedés biztosítása érdekében.

* A 80 százalékos összefolyás azt az állapotot jelenti, amikor a tenyészet felületének 80 százalékát a növekvő sejtek borítják.

A szuszpenzióban lévő sejtek bizonyos esetekben megtapadhatnak a tenyésztőlombik műanyag felületén, vagy akár csomókat is képezhetnek. Ilyenkor egy pipettával ki lehet szedni ezeket a sejteket, és ki lehet tolni őket a lombik felületére és így a műanyag felületről. Ez segíti az egyes sejtek elérését, mivel azok nem tapadnak a műanyag felületre.

Vörösvérsejt szuszpenzió

• (balra: hemolízis nélkül) vörösvérsejt szuszpenzió (0,5% juh vörösvértestek sóoldatban), vörösnek és átlátszatlannak tűnik.
• (középen: hemolízis nélkül) 60 percig spontán ülepedő vörösvértestek. Figyeljük meg, hogy a felülúszó nem színes.
• (jobbra: hemolízis) S. pyogenes hemolizinnel kezelt RBC szuszpenzió 37C-on 30 percig, hemolízis hatására átlátszóvá válik.

Tovább a Vörösvértestek

Sejtek számolása

A szuszpenzióban lévő sejtek számának megszámlálása egy olyan folyamat, amelyhez festék használata szükséges. Ha például trypan-kéket használunk, az áthatol az elhalt sejtek sejtmembránján, de az élő sejteken nem.

A sejteket ezután óvatosan a fedőlemez alatt lévő hemocitométerbe (amely tartalmazza a számláló kamrát) taszítjuk, és mikroszkóp alatt megfigyeljük. A sejteket ezután egy adott számú négyzetben számolják meg a számításokhoz.

Jelentősége

Ezt a módszert nagyrészt azért részesítik előnyben, mert lehetővé teszi, hogy a sejteket oldatban szuszpendálják, ahelyett, hogy szilárd közegben tartanák. Itt tehát könnyebbé válik a tartalom manipulálása, ezáltal megakadályozva, hogy klasztereket képezzenek. A sejtszuszpenzióval az egyes sejtek mikroszkóp alatt is könnyebben megfigyelhetők.

Ez esetben nemcsak a sejtek szerkezetének tanulmányozása válik lehetővé, hanem annak megfigyelése is, hogy mennyire differenciálódtak; az elhalt és élő sejtek mikroszkóp alatt.

Sejttenyésztési protokoll

A sejttenyésztési protokollok célja annak biztosítása, hogy a tenyésztési eljárásokat az előírt szabványoknak megfelelően végezzék. Ez nemcsak a sejtek szennyeződését hivatott megakadályozni, hanem azt is biztosítani, hogy a kutatók maguk is védve legyenek a szennyeződés minden formájától.

Mellett a munka jellegének meg kell felelnie a megfelelő etikai irányelveknek. Ezért mindenekelőtt biztosítani kell, hogy az egész eljárás megfeleljen mind az orvosi etikai, mind az állatkísérleti irányelveknek. Ez azért van így, mert az ilyen jogszabályok és irányelvek megszegése súlyos büntetéseket és akár a laboratórium bezárását is eredményezheti.

Minden munka megkezdése előtt végezze el a következő eljárást:

• Győződjön meg arról, hogy a munkaterület fertőtlenítve van (70 százalékos etanol használatával)
• Mindig új kesztyűt használjon. Ha egy pár kesztyűt egy másik sejttenyésztési eljáráshoz kell használni,70 százalékos etanollal kell fertőtleníteni, és hagyni kell a levegőn megszáradni.
• A szekrényből kivett eszközöket is fertőtleníteni kell a szennyeződés megelőzése érdekében
• Az olyan eszközöket, mint a pipetta, az üvegedények és az eljáráshoz használandó műanyagokat autoklávozni kell

Bár a sejttenyésztő közegek széles választéka létezik, fontos szem előtt tartani, hogy a sejttenyészetek, és különösen a primer sejttenyészetek a fel nem fedezett vírusok kockázatán túlmenően könnyen szennyeződhetnek. Ezért minden anyagot potenciálisan fertőzőként kell kezelni a fertőzések elkerülése érdekében.

A biztonság érdekében a sejtkultúrán végzett munkát megfelelő lamináris áramlású elszívóban kell végezni, ahol a levegő a kutatótól el van irányítva.

A sejttenyésztés előkészítésének protokolljai

Mindig ellenőrizze a tartályon található információkat, hogy a táptalaj megfelel-e a tenyésztendő sejtnek,

Az előkészítés után, a sejtkultúrát az ajánlott hőmérsékleti tartományban kell tartani,

Monitorozza a kultúrát 30-48 óránként, és ellenőrizze a konfluenciát (amikor a sejtek teljesen beborítják a kultúra felszínét) – Ez azonban nagyban függ a sejtek típusától.

Az eljárás befejezése és a sejtek elemzése után a tenyészetet megfelelően el kell dobni. Itt nagy körültekintéssel kell eljárni, tekintettel arra, hogy ekkorra a sejtek már elszaporodtak és megnövekedett a számuk. Ráadásul nagy az esélye annak, hogy a minta szennyeződött, ami a nem megfelelő kezelés esetén növeli a kutatók fertőzésveszélyét.

Megsemmisítés

• A szennyeződésmentesítés többek között olyan tárgyak esetében, mint a szikék, üveglapok és fedőlemezek, 121 Celsius fokon és 15 psi (nyomáson) legalább 30 percig tartó autoklávozással történhet. Ha azonban el kell őket dobni, fontos, hogy műanyag zacskóba és a megfelelő konténerbe kerüljenek, hogy később elégethessék őket.
• A folyékony hulladékok esetében a kémiai fertőtlenítés az egyik legjobb módszer, amellyel a hulladéktermék hatástalanítható. Erre a célra olyan vegyi anyagokat lehet használni, mint a fehérítőszer, mielőtt a folyadékot a mosogató lefolyójába öntenénk.
• A szilárd hulladékok esetében műanyag zsákba gyűjtik őket égetés céljából. Másrészt, ezeket először autoklávozni lehet, mielőtt elégetnék.

Következtetés

A sejttenyésztés, akár szuszpenziós, akár helyhez kötött táptalajt használunk, általában a sejtek növekedését jelenti egy kedvező feltételeket biztosító mesterséges környezetben. Míg az enzimatikus hatás felhasználható a sejtek tenyésztéshez való kinyerésére, a mechanikus szétválasztási módszer a legkedveltebb, mivel egyszerűbb és kevésbé traumatikus módot biztosít a sejtek kinyerésére.

Ez a módszer egyszerűen egy szövet kisebb darabokra történő felszeletelését jelenti, amelyből aztán a kiömlő sejteket összegyűjtik. A sejtek kinyerésére a primer explantációs technika is alkalmazható. Ez a módszer azonban leginkább kisebb szövetmennyiségek szétbontására alkalmas.

Míg bármilyen sejtet fel lehet használni tenyészetekben, hogy megfigyeljük a viselkedésüket, az embrionális szöveteket előnyben részesítik (az elsődleges sejtek esetében) a felnőtt sejtekkel szemben, mivel ezek életképesebb és gyorsabban szaporodó sejteket biztosítanak.

Ezekben az is fontos, hogy a sejtek nagyobb mennyiségűek legyenek, mivel túlélési arányuk általában alacsonyabb a szubkultúrákkal összehasonlítva. I

A kultúrák sikerének fokozása érdekében az is fontos, hogy a sejtek károsodását minimalizáljuk mind a sejtgyűjtés, mind a feldolgozás során. Ez azon túlmenően, hogy az adott sejtekhez megfelelő médiumot használjunk.

Ezzel összhangban tekintse meg a szövettenyésztés típusait és technikáit.

Nézze meg a MicroscopeMaster mikroszkópos kiegészítőkre vonatkozó válogatását.

Amint a sejtosztódásról, sejtdifferenciálódásról és sejtfestésről szóló információk, és nyerjen némi betekintést a sejtelméletbe.

A haladóbbaknak és nagyszerű olvasmány A sejt molekuláris biológiája. Valamint a citokémia megismerése.

Talán diák, tanár vagy hobbista, és szeretné követni a MicroscopeMaster szórakoztató mikroszkópos kísérletekről szóló információit.

Lásd még Mikroszkópos tenyésztés és érzékenységvizsgálat

Térjünk vissza a sejttenyésztésről a sejtbiológiai főoldalra

Térjünk vissza a sejttenyésztésről a MicroscopeMaster főoldalára

.