Abstract
A krónikus aktív Epstein-Barr-vírusfertőzés (CAEBV) súlyos betegség, szokatlan, évekig fennálló EBV-aktivációval, és patogenezise nagyrészt ismeretlen. Az EBV-DNS számszerűsítésére szolgáló pontos és reprodukálható polimeráz láncreakciós rendszer megalkotása után 54 gyermeknél határozták meg a perifériás vér limfocitáinak (PBL) vírusterhelését: 15 CAEBV-ben, 16 fertőző mononukleózisban (IM) és 23 egészséges gyermeknél. A CAEBV-ben és az IM-ben szenvedő gyermekek vírusterhelése magas volt. A szeropozitív egészséges donorok 47%-ánál alacsonyabb terhelést mutattak ki. A CAEBV-ben és az IM-ben szenvedő gyermekek között két markáns különbség volt: Az előbbiek vírusreplikációja nagyobb volt (103-107 kópia/PBL)2,5 × 105 PBL), mint az IM-ben szenvedőké, és a vírusreplikáció az IM-ben szenvedő gyermekeknél csökkent, míg a CAEBV-ben szenvedő személyeknél az aktív replikáció évekig fennállt. A tartósan magas vírusterhelés a CAEBV lehetséges diagnosztikai kritériuma. Az EBV-terhelések lehetővé tehetik az EBV-fertőzések osztályozását és prognózisát.
Az Epstein-Barr-vírus (EBV) a fertőző mononukleózis (IM) és a krónikus aktív EBV-fertőzés (CAEBV) kórokozója. A CAEBV szokatlan EBV-aktivációval járó súlyos betegség, amely többszörös szervi elégtelenséggel végzetes lehet, és előzetes immunszuppresszió nélkül rosszindulatú limfómához társul . A CAEBV klinikai tünetei és az aktív EBV-replikációnak megfelelő szerológiai eltérések, mint például a jelentősen emelkedett anti-EA-DR antitest és az Epstein-Barr nukleáris antigén (EBNA) antitest hiánya, hónapokig vagy évekig fennállnak. Az EBV az NK , T és B sejtekben szaporodik.
A fertőzés kialakulása után az EBV általában a B limfocitákban tartózkodik a gazdaszervezet egész életében anélkül, hogy klinikai tüneteket okozna (ezt nevezzük látens fertőzésnek). Ezért az EBV-betegség kivizsgálásához nemcsak az EBV kimutatása, hanem mennyiségi meghatározása is elengedhetetlen az érintett szövetekben.
A CAEBV-ben szenvedő személyeknél az EBV-replikáció állapotának tisztázására félkvantitatív DNS-polimeráz láncreakciót (PCR) használtunk a perifériás vér limfocitáiban (PBL) lévő vírusterhelés értékelésére és összehasonlítására 3 gyermekcsoportban: egy CAEBV-ben, egy IM-ben és egy egészséges kontrollcsoportban. A kimutatási rendszerünket pontosnak és megbízhatónak tekintettük az EBV mennyiségi meghatározására, mivel az EBV egyetlen kópiát tartalmazó régióját amplifikáltuk. A legtöbb korábbi tanulmány a BamHI-W régiót célozta meg, amelynek tandemismétlődési gyakorisága nem állandó. Úgy véljük, hogy ez a vizsgálat az első és legnagyobb léptékű vizsgálat a CAEBV-ben szenvedő gyermekek PBL-ében lévő vírusterhelésről.
Anyagok és módszerek
Betegek és kontrollok
Vizsgáltunk 16 IM-es gyermeket (11 fiú, 5 lány; életkor 0-8 év), 15 CAEBV-s gyermeket (11 fiú, 4 lány; életkor 4-19 év), 19 immunkompetens EBV-szeropozitív egészséges személyt (10 fiú, 9 lány; életkor 1-19 év) és 4 szeronegatív egészséges gyermeket (3 fiú, 1 lány; életkor 1-10 év). Minden IM-ben szenvedő személynél tipikus klinikai manifesztációk (pl. láz, mandulagyulladás, lymphadenopathia, hepatosplenomegalia, májműködési zavar és atipikus lymphocytosis) jelentkeztek. Az IM diagnózisát a víruskapszid antigén (VCA) elleni IgM antitest szerológiai lelete vagy a VCA IgG és/vagy EA szerokonverziója és a negatív EBNA antitest alapján állították fel. Huszonkét vérmintát vettek 16 IM-ben szenvedő gyermektől 8 nappal és 8 hónappal a betegség kezdete után (a kezdeti tünet minden betegnél láz volt). A CAEBV-t a Rickinson-kritériumok alapján diagnosztizálták. A CAEBV-ben szenvedő gyermekeknek >16 hónapig tartó időszakos vagy tartós láza volt, hepatosplenomegáliával, lymphadenopathiával és/vagy bőrkiütéssel. A laboratóriumi leletek emelkedett transzaminázszintet, vérszegénységet, trombocitopéniát és/vagy poliklonális hypergammaglobulinémiát mutattak. A szerológiai vizsgálat a VCA-val és az EA-val szembeni antitesttiterek jelentős emelkedését mutatta ki. A humán immunhiányos vírusfertőzést és a reumás betegségeket kizárták. Egyik alany sem esett át transzplantáción vagy részesült rákellenes kezelésben.
Minták
Heparinizált 2 ml-es perifériás vérmintákat vettek. A PBL-eket ficoll-hidroxiddal izoláltuk és 0,15 μg/μL proteináz K-val (Boehringer-Mannheim, Indianapolis) lizáltuk; a DNS-t fenol-kloroform-etanolos kicsapással extraháltuk. A kivont DNS-t spektrofotométerrel számszerűsítettük, 0,25 μg/μL DNS-re állítottuk be, és PCR-templátként használtuk.
PCR érzékenység
EBV DNS három forrásból származott: Raji, amely sejtenként 50 EBV-kópiát tartalmazott ; Akata, amely sejtenként 20 kópiát tartalmazott; és klónozott BamHI-L fragmentumok, amelyeket köldökzsinórvérsejtekből származó DNS-sel kevertek és pozitív standardként használtak. A PCR-rendszer érzékenységének meghatározásához a kivont DNS 10-szeres sorozatos hígításait (10°-104 EBV-kópia) PCR-nek vetették alá.
PCR
A gp220-at kódoló konzervált régió felerősítésére (a BamHI-L fragmentumon belül) fészkelt kettős PCR-t terveztek . A külső primerpár a B95-8 (GenBank M10593) 2870-3171 pozícióinak megfelelő 5′-GCGAACTGGTGGACACATGA és 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA oligonukleotidok felhasználásával egy 302 bp hosszúságú fragmentumot amplifikál. A belső pár egy 239 bp hosszúságú fragmentumot amplifikál. A PCR-t 50 ml-es reakcióban végeztük, amely 50 mM KCl-t, 1,5 mM MgCl2-t, 200 μM dNTP-t, 0,5 μM-ot tartalmazott minden egyes primerből, 2,5 U Taq DNS-polimerázt (Boehringer-Mannheim) és 4 μL minta-DNS-t . Az amplifikált termékeket 2%-os agarózon futtattuk és etídium-bromiddal festettük, majd Southern blottingot használtunk a specifitás megerősítésére a BamHI-L fragmentumot szondaként használva . Minden PCR-reakciót három példányban végeztünk, és a keresztkontamináció kizárása érdekében a negatív kontrollt is bevontuk. A PCR specificitásának megerősítése érdekében elemezték az 1-es és 2-es típusú herpes simplex vírus, a varicella-zoster vírus, a humán citomegalovírus, valamint a humán herpeszvírus-6 és -7 DNS-ét. Nem észleltek specifikus amplifikációt.
Az EBV genom mennyiségi meghatározása
A PBL-ben lévő EBV DNS mennyiségét limitáló hígítási kísérletekkel határozták meg. Az egyes mintákból kivont genomi DNS sorozatos 10-szeres hígításait (1-10-6μg) a fent leírt módon fészkelt PCR-nek vetettük alá, és a pozitív eredmény minimális határértékét a vírusterhelésre (kópiák/2,5 × 105 sejt) számoltuk át.
Eredmények
A PCR-rendszer érzékenységét a három EBV DNS-forrás 10-szeres hígításával gondosan meghatároztuk: Raji és Akata, mindkettő állandó EBV DNS-kópiaszámot tartalmazott sejtenként, valamint a klónozott BamHI-L fragmentumot. A Raji 50 EBV genom kópiát tartalmaz sejtenként , és 1 μg Raji sejtekből származó genomiális DNS megegyezik a 2,5 × 105 sejtből kivont DNS-sel: tehát 1,25 × 107 EBV DNS kópiával. A Raji-ból származó DNS-t megfelelően hígítottuk, és a 10n kópiát tartalmazó DNS-t (a vírus 10°-104 kópiájának sorozatos hígításai) amplifikációnak vetettük alá. Megvizsgáltuk a pozitív PCR-eredmény minimális határát. Az ismételt vizsgálatok azt mutatták, hogy az érzékenység reakciónként 100 kópia volt, reprodukálhatósággal. Az eredmények megegyeztek az Akata DNS-t használva és a hígítási kísérlet során, amikor a BamHI-L fragmentumok 10n kópiáját 105μg, 102μg és köldökzsinórvérsejt DNS-sel keverték, illetve nem használták.
Az IM és CAEBV-ben szenvedő alanyok összes PBL-je pozitív volt az EBV genomra. Az EBV-szeropozitív egészséges személyek 19 mintájából kilenc (47%) volt pozitív. A szeronegatív személyektől származó összes PBL negatív volt.
A PBL-ben lévő EBV-DNS-t számszerűsítették és összehasonlították az EBV-szeropozitív egészséges kontrollok, az IM-ben szenvedő gyermekek és a CAEBV-ben szenvedő gyermekek esetében (1. ábra). Az egészséges EBV-szeropozitív gyermekeknél a vírusterhelés 100-1000 kópia volt 2,5 × 105 PBL-enként. Az IM-ben szenvedő gyermekek PBL-jeiben a pozitív PCR-eredmények legalacsonyabb határértéke 10 μg (2,5 × 105 PBL) és 10∼3μg (2,5 × 102/PBL) genomiális DNS között volt, ami azt jelezte, hogy a vírusterhelés 100-100 000 kópia/2,5 × 105 PBL volt. A betegség kezdetét követő egy hónapon belül vett három vérminta magasabb terhelést mutatott (1000-100 000 kópia/2,5 × 105 PBL). A >11 hónappal az IM megjelenése után gyűjtött PBL inkább csökkent vírusmennyiséget tartalmazott. A vírusterhelést 4 IM-betegnél követtük nyomon (2A ábra). Mind a 4 betegnél a vírusterhelés csökkent a klinikai lefolyás során, de magasabb volt (100-10 000 kópia/2,5 × 105 PBL), mint a szeropozitív egészséges gazdákban.
EBV-DNS a perifériás vér limfocitáiban (PBL) a diagnózis felállításakor egészséges kontrolloknál (4 EBV-szeronegatív, 19 szeropozitív), 16 fertőző mononukleózisban (IM) szenvedő gyermeknél és 15 CAEBV-fertőzött betegnél. A 19 egészséges EBV-szeropozitív gyermek közül 9-ben kimutatható volt az EBV-DNS (100-1000 kópia/2,5 × 105 PBL). Nagyobb mennyiségű EBV-genomot mutattak ki az EBV-betegségben szenvedő betegek PBL-jében.
EBV-DNS a perifériás vér limfocitáiban (PBL) a diagnózis felállításakor egészséges kontrollok (4 EBV-szeronegatív, 19 széropozitív), 16 fertőző mononukleózisban (IM) szenvedő gyermek és 15 CAEBV-fertőzött beteg esetében. A 19 egészséges EBV-szeropozitív gyermek közül 9-ben kimutatható volt az EBV-DNS (100-1000 kópia/2,5 × 105 PBL). Az EBV-betegségben szenvedő betegek PBL-jében nagyobb mennyiségű EBV-genomot mutattak ki.
A, EBV-terhelés és a betegség kezdetétől a vérvételig eltelt idő. A fertőző mononukleózis (IM) kezdetét követő 1 hónapon belül levett 12 vérminta nagy mennyiségű EBV-t tartalmazott (1000-100 000 kópia/2,5 × 105 sejt). Az IM kezdete után ⩾1 hónappal gyűjtött perifériás vérlimfociták (PBL) általában kevesebb vírust tartalmaztak. 4 IM beteget követtek nyomon a vírusterhelés vizsgálatára. Mind a 4 betegnél az EBV-DNS csökkent a betegség klinikai lefolyása során. B, Az EBV-terhelés időbeli változása 2 CAEBV-ben szenvedő beteg (UT, YK) PBL-jében. A PBL-ben folyamatosan nagy mennyiségű EBV-DNS-t mutattak ki.
A, EBV-terhelések és a betegség kezdetétől a vérvételig eltelt idő. A fertőző mononukleózis (IM) kezdetét követő 1 hónapon belül levett 12 vérminta nagy mennyiségű EBV-t tartalmazott (1000-100 000 kópia/2,5 × 105 sejt). Az IM kezdete után ⩾1 hónappal gyűjtött perifériás vérlimfociták (PBL) általában kevesebb vírust tartalmaztak. 4 IM beteget követtek nyomon a vírusterhelés vizsgálatára. Mind a 4 betegnél az EBV-DNS csökkent a betegség klinikai lefolyása során. B, Az EBV-terhelés időbeli változása 2 CAEBV-ben szenvedő beteg (UT, YK) PBL-jében. A PBL-ben következetesen nagy mennyiségű EBV-DNS-t mutattak ki.
A CAEBV-ben szenvedő gyermekek PBL-ében több EBV-DNS volt, mint az IM-ben szenvedő gyermekek mintáiban. Négy CAEBV-beteget követtek >16 hónapig (a 2B. ábra 2 beteg eredményeit szemlélteti). Két másik betegnél 2-3 év alatt nem változott a vírusterhelés (105 és 106 kópia/2,5 × 105 PBL). Mindegyik betegnél tartósan magas volt a vírusterhelés, ellentétben az IM esetében tapasztaltakkal. Amikor a klinikai manifesztációk és az EBV-terhelés közötti kapcsolatot vizsgáltuk, csak a láz korrelált a vírusterheléssel. Nem volt korreláció a hepatosplenomegáliával, lymphadenopathiával, exanthemával, szúnyogallergiával, májműködési zavarral, anaemiával, trombocitopeniával vagy a VCA, EA-DR és EBNA elleni szérum antitesttiterekkel.
Elbeszélgetés
Az EBV-DNS-t számszerűsítő PCR kimutatta, hogy a CAEBV-ben vagy IM-ben szenvedő gyermekek PBL-je magas vírusterhelésű volt, ami aktív EBV-replikációt jelez a limfocitákban. A vírusreplikáció CAEBV-ben aktívabbnak bizonyult, mint IM-ben; az IM csoportban a replikáció fokozatosan csökkent, míg a CAEBV-betegeknél az aktív replikáció évekig fennmaradt.
A mi PCR-rendszerünk a gp220-at kódoló EBV-specifikus szekvenciákat amplifikálja, amely a vírusban egyetlen példányban található gén, míg a korábbi vizsgálatok a BamHI-W régióban található belső ismétlődő hosszúságot célozták. Mivel a poliklonális EBV-szaporodásban ennek a régiónak az ismétlődési száma inkonstans, rendszerünk pontosabbnak tekinthető az EBV mennyiségi meghatározására, bár kevésbé érzékeny a kimutatásra. Az alacsony érzékenység hibáját a nested PCR alkalmazásával sikerült kiküszöbölni. Az érzékenység 100 kópia volt reakciónként, szemben a korábbi jelentésben szereplő 10 kópiával . Az EBV genomokat a PBL-ben a kivont DNS sorozatos hígításával számszerűsítettük. Az EBV DNS-t a kivont DNS sorozatos hígításával számszerűsítő rendszerünk reprodukálhatónak és megbízhatónak bizonyult.
Az IM-ben és CAEBV-ben szenvedő gyermekekből gyűjtött PBL nagyobb mennyiségű EBV genomot tartalmazott, mint az egészséges szeropozitív kontrollok PBL-je. Az utóbbiak 47%-a tartalmazott kimutatható EBV-DNS-t (100-1000/2,5 × 105 PBL). Az EBV-t 2 alanyban magasabb szinten mutatták ki, mint a korábbi vizsgálatokban (1-50/106 PBL) . Mivel gyermekeket vizsgáltunk, a primer fertőzést követő rövidebb időszakok hozzájárulhatnak a felnőtteken végzett korábbi vizsgálatokban tapasztaltnál magasabb EBV-terheléshez, emlékeztetve arra, hogy különösen gyermekeknél a pozitív PCR-eredmények tünetmentes látens EBV-fertőzést is tartalmaznak.
Az IM-ben szenvedő gyermekeknél nagy mennyiségű EBV volt. Az EBV-terhelés a betegség kezdetét követő egy hónapon belül tetőzött (1000-100 000 kópia/2,5 × 105 PBL), majd fokozatosan csökkent, de néhány hónappal (⩽8) a betegség kezdetét követően is magas maradt, összehasonlítva az egészséges kontrollok szintjével. Még akkor is, amikor a klinikai tünetek megszűntek, az EBV viszonylag magas szintű replikációja folytatódott a PBL-ben.
A CAEBV-ben szenvedő betegekben tartósan nagy mennyiségű EBV volt, ami arra utal, hogy az EBV krónikus, szabályozatlan, aktív replikációja a PBL-ben súlyos, rossz prognózissal járó betegséget eredményez. A meglepően aktív vírusreplikációhoz vezető tényezők és mechanizmusok továbbra is tisztázatlanok. A humorális és a celluláris immunitás gazdaszervezeti védelmi rendszereinek különböző heterogén hiányosságait írták le, amelyek lehetővé tehetik az aktív vírusreplikációt. A PBL magas vírusterhelését (>1300 000 EBV/105 PBL) mutatták ki EBV-asszociált poszttranszplantációs lymphoproliferatív betegségben (PTLD), amely a transzplantációt követő szövődmény, bár a vírusterhelés egy éven belül csökkent az immunszuppresszióból való felépüléssel párhuzamosan. A keringő EBV-terhelés mennyiségi különbsége korrelált az EBNA-antitest-szinttel PTLD-ben, de nem CAEBV-ben. Ezért az EBV viselkedését PTLD-ben a CAEBV-hez hasonlónak és attól eltérőnek is tekintették. A klinikai manifesztációkat tekintve a CAEBV hasonlónak tűnik az X-hez kötött limfoproliferatív (XLP) szindrómához , amelynek felelős génjét nemrégiben azonosították. Az XLP-szindrómától eltérően azonban a CAEBV nem örökletes betegség, és nők is érintettek lehetnek. A CAEBV további immunológiai elemzése szükséges a vírusaktivációra hajlamosító tényezők tisztázásához.
Acyclovirt, interferon-α-t és interleukin-2-t használtak a CAEBV kezelésére – nem kielégítő eredményekkel . Eredményeink arra utalnak, hogy az immunszupressziót kiváltó és a vírusaktivációt fokozó citotoxikus gyógyszereket körültekintően kell megválasztani, bár a klinikai jellemzők hasonlóak a hematológiai malignitásokéhoz. A PBL-ben tartósan magas EBV-terhelés a CAEBV lehetséges diagnosztikai kritériuma, és hasznos lehet a betegség aktivitásának monitorozásában, a betegség osztályozásában és a prognózis előrejelzésében.
Köszönet
Köszönjük George Klein (Mikrobiológiai és Tumorbiológiai Központ, Karolinska Intézet, Stockholm) munkáját a kézirat átnézéséért, valamint Sachi Takemoto és Ai Kitamura ügyes technikai segítségét.
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.