By Elizabeth Burke

Tuesday, August 9, 2016

A tudósok számos laboratóriumi technikát alkalmaznak az emberi betegségek genetikai okainak vizsgálatára. A kutatásokban gyakran használják a betegek sejtjeit vagy szövetmintáit, de annak megállapításához, hogy egy adott gén mutációja okozhatja-e a beteg tüneteit, gyakran van szükség kísérleti állatmodellekre.

Míg a múltban az egerek és a patkányok voltak az általános választások az emberi betegségek modellezésére, a zebrahalak használata egyre nagyobb népszerűségnek örvend. Meglepi ez Önt? Hadd magyarázzam el.

Mi is az a zebrahal?

A zebrahalak az apróhalak családjába tartozó trópusi édesvízi halak. A természetben India folyóiban és tavacskáiban találhatók, azonban ma már gyakran kaphatók a kisállat-kereskedésekben is. A “zebrahal” elnevezés a testük mindkét oldalán található vízszintes kék csíkokról származik.

A zebrahalak, amelyek a csíkjaik miatt kapták ezt a nevet, inkább nagy csoportokban, úgynevezett rajokban élnek.

Hogyan lehet egy emberi betegséget halakon modellezni?

Az emberek ugyan rendkívül különbözőnek tűnhetnek a zebrahalakhoz képest, valójában sokkal jobban hasonlítunk rájuk, mint gondolnánk. Valójában az emberi gének 70%-a megtalálható a zebrahalakban.

A zebrahalaknak ráadásul két szemük, szájuk, agyuk, gerincvelőjük, belük, hasnyálmirigyük, májuk, epevezetékeik, veséjük, nyelőcsövük, szívük, fülük, orruk, izmaik, vérük, csontjuk, porcuk és fogaik vannak. Az emberek és a zebrahalak között számos olyan gén és kritikus útvonal konzerválódik, amelyek szükségesek e tulajdonságok kialakulásához. Így elméletileg minden olyan betegségtípus, amely az embernél ezekben a testrészekben változásokat okoz, modellezhető lenne a zebrahalban.

Miért használjunk zebrahalat, ha használhatunk egeret is?

Míg az egerek evolúciós szempontból jobban hasonlítanak az emberhez, mivel emlősök, a zebrahalnak számos előnye van szőrös versenytársaikkal szemben.

A zebrahalak egyik fontos előnye, hogy a felnőtt állatok kicsik, és inkább nagy csoportokban, úgynevezett “rajokban” tartják őket. Ennek eredményeként sokkal kevesebb helyet igényelnek, és fenntartásuk olcsóbb, mint az egereké.

A NIH Zebrafish Core több százezer zebrahalat tart egy korszerű létesítményben.

Egy másik előny, hogy a kifejlett zebrahalak könnyen szaporodnak (körülbelül 10 naponta), és egyszerre akár 50-300 ikrát is képesek létrehozni. Ez nagyban különbözik az egerektől, mivel azok általában egy-tíz kölyökből álló almot hoznak létre, és életük során csak körülbelül három almot tudnak kihordani. A tudományos kísérleteket általában többször megismétlik annak érdekében, hogy bizonyítsák az eredmények pontosságát, ezért hasznos, ha az állat újra és újra nagyszámú utódot képes létrehozni.

A zebraembriókat is kívülről rakják le és termékenyítik meg, ami lehetővé teszi, hogy könnyen és sokféleképpen manipulálhatók legyenek. Szükség esetén in vitro megtermékenyítés is végezhető. Az egysejtű stádiumban megtermékenyített ikrákba könnyen be lehet injektálni DNS-t vagy RNS-t genetikai állományuk tartós módosítása céljából, hogy transzgenikus vagy knock-out zebrahal-vonalakat hozzanak létre. Egerekkel ilyen módon dolgozni sokkal bonyolultabb. Az egérembriók az anyában fejlődnek, és ahhoz, hogy hozzáférjenek és manipulálják őket, az anyát fel kellene áldozni. Ahhoz, hogy az embriókat megtermékenyítés vagy befecskendezés után életben lehessen tartani, szintén át kellene ültetni őket egy másik nőstény egérbe.

A zebrahal-lárva, a megtermékenyítés utáni három és harminc nap közötti fejlődési szakasz, körülbelül 3,5 és 8 milliméter közötti hosszúságúra nő.

A zebrahal-embriók ráadásul átlátszóak, ami lehetővé teszi a tudósoknak, hogy mikroszkóp alatt megfigyeljék a megtermékenyített ikrából teljesen kialakult bébihallá történő növekedést. Átlátszóságuk lehetővé teszi a fluoreszcensen jelölt szövetek láthatóvá tételét is a transzgenikus zebrahal-embriókban. Az egérembriók nem átlátszóak, és az anyában fejlődnek, így a zebrahalakéhoz hasonló élő embriófejlődés megfigyelése nem lehetséges.

A zebrahalakon azonban csak korlátozottan lehet vizsgálni a betegségek típusait. Az olyan gének által okozott emberi betegségekhez, amelyek a zebrahalakban nem léteznek, más állatmodellre van szükség. Ezenkívül a zebrahalak nem hasznos modelljei az olyan emberi betegségeknek, amelyek főként olyan szövettípusban vagy testrészben játszódnak le, amelyekkel a zebrahalak nem rendelkeznek (pl. prosztata, emlőmirigyek, tüdő).

Hogyan használják pontosan a zebrahalakat az emberi betegségek vizsgálatára?

Gyakran szekvenálják egy beteg DNS-ét, hogy megtalálják a mutációt egy génben, amely potenciálisan okozhatja a betegség tüneteit. Annak megállapítására, hogy az adott gén funkcióvesztése okozhatja-e a betegnél észlelt tüneteket, ugyanazt a gént mutálják vagy “kiütik” a zebrahalakban, majd a halakat hasonló tünetekre vizsgálják. Bár ez sokkal nehezebben kivitelezhető, a betegnél előforduló pontos mutációt be lehet vinni a zebrahalakba is – ezt nevezik “knock-in”-nek.

Ha a beteg egy vagy több tünete megfigyelhető a zebrahal knock-out vagy knock-in modellben, a zebrahalakat további vizsgálatokra lehet felhasználni annak megállapítására, hogy az adott gén mutációja miért okozza a betegséget. Például az izomrostok szerkezetét mikroszkóp alatt lehet vizsgálni rendellenességek szempontjából, ha a betegnek izombetegsége van. Vagy ha a betegnél a betegség tünetei a méhen belüli fejlődés során kezdődtek, a knock-out vagy knock-in zebrahal embriókat meg lehet vizsgálni olyan génexpressziós változásokra (a mutáció nélküli embriókhoz képest), amelyek rendellenes fejlődéshez vezethetnek. Egy neurológiai betegségben szenvedő beteg esetében a knock-out embriók neuronjait fluoreszcensen meg lehet jelölni, hogy lássák, hibásan alakulnak-e ki.

A zebrahal betegségmodellek felhasználása mellett az emberi betegségek jellemzésére a kutatók új gyógyszereket is azonosíthatnak és tesztelhetnek a modellezett betegségek kezelésére. A zebrahalak azon képessége, hogy minden egyes szaporodáskor sok embriót képesek létrehozni, különösen hasznossá teszi őket a nagy áteresztőképességű gyógyszerszűrésre.

Milyen példák vannak a zebrahalakban sikeresen modellezett emberi betegségekre?

A zebrahalakban a dystrophin gén knock-outjának előállítása bizonyítottan nagyon hasonlít az emberi betegség, a Duchenne izomdisztrófia súlyosságához és lefolyásához. A Duchenne-izomdisztrófiában szenvedő betegekről kiderült, hogy a dystrophin mutációit hordozzák, és gyermekkori izomgyengeséget mutatnak, amely fokozatosan súlyosbodik. Mind az emberben, mind a zebrahal modellben a dystrophin elvesztése fokozatosan nekrotikus izomrostokhoz vezet, amelyeket gyulladásos sejtek, fibrózis és abnormális méretű izomrostok váltanak fel.

Az ábra a vad típusú zebrahal-lárva (A, B, C) és a disztrófiás lárva (A’, B’, C’) izomzatának vizuális különbségeit mutatja. Forrás: Forrás: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3484855/

A humán melanómát is sikeresen modellezték zebrahalakban. A humán melanomákban leggyakrabban azonosított mutációt – egyetlen aminosav változást a BRAF génben – zebrahalban hozták létre knock-in modellként. Mivel a rákot több genetikai változás kombinációja okozza, ezt a knock-in zebrahal-vonalat más lehetséges rákkeltő mutációk szűrésére használták. Amikor a BRAF knock-in zebrahalhoz a SETDB1 gén egy másik, gyakran megfigyelt melanoma-mutációját adták hozzá, gyorsan melanoma alakult ki. Ezek az eredmények segítettek megállapítani, hogy a SETDB1 fontos gén a melanoma növekedésében.

Ezek a példák arra, hogy az emberek és a zebrahalak a látszólagos különbözőségünk ellenére is képesek ugyanazt a betegséget manifesztálni, könnyen érthetővé teszik, hogy a zebrahalak miért válnak elfogadott állatmodellé. Itt, az NIH Undiagnosed Diseases Programban a zebrahalak felhasználásával végzünk vizsgálatokat, amelyek egyike azon számos megközelítésnek, amelyekkel a megváltozott gének lehetséges érintettségét vizsgáljuk betegeink rendkívül ritka betegségeiben. Míg a múltban az egerek jelentették az uralkodó állati hidat a laboratórium és a betegágy között, a közelmúltban végzett vizsgálatok bebizonyították, hogy a zebrafish az egerek jól kezelhető alternatívájaként szolgálhat. A zebrahal mint új modellorganizmus bevezetésének időzítése nem is lehetne jobb, mivel az egérrel végzett vizsgálatok gyakran nem ültethetők át emberre. Bár egyetlen állat sem képes tökéletesen modellezni egy emberi betegséget, úgy vélem, hogy ezek a kis csíkos úszók nagy lehetőséget rejtenek magukban az orvosi kutatások jövőbeni előmozdítására.

Ha többet szeretne megtudni arról, hogy a zebrahal hogyan járul hozzá az orvosbiológiai tudományhoz és az emberi egészséghez, látogasson el a Trans-NIH Zebrafish Initiative weboldalára és a NICHD Zebrafish Core weboldalára.