Vizsgált gombák
Escovopsioides izolátumokat különböző levélvágó és nem levélvágó hangyafajok korábbi vizsgálatok során gyűjtött gombakertjeiből nyertük . Ez a gyűjtemény 20 izolátumot tartalmaz, amelyeket Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi és Trachymyrmex tucumanus gombákból nyertek, az Acromyrmex subterraneus subterraneusból nyert E. nivea típusfajon kívül (3. táblázat). Egy további izolátumot nyertek a Parauapebasban (Pará, Brazília) talált Apterostigma megacephala nem levélvágó hangya kolóniájából (3. táblázat). Valamennyi izolátum az Escovopsioides nemzetségre jellemző morfológiai jellemzőket mutatta: hialin kolóniák PDA-n, lageniform fialidákat tartalmazó terminális és interkaláris vezikulák, hosszú láncokban álló hialin konídiumok, aleurokonídiumok és klamidospóraszerű struktúrák .
Az izolátumokat konídiumszuszpenzió formájában – 80 °C-on (10%-os glicerinben) és 10 °C-on desztillált vízben tartják a Laboratory of Fungal Ecology and Systematics (LESF), Rio Claro, São Paulo állam, Brazília gyűjteményében. Az összes izolátumot állományokból élesztettük újjá úgy, hogy tartósított konídiumokat oltottunk PDA táptalajra, és 7 napig inkubáltuk 25 °C-on, sötétben. Minden vizsgált izolátumot monospórusos tenyészetként nyertünk.
Az Escovopsioides molekuláris jellemzése
A genomi DNS-t CTAB-módszerrel vontuk ki 2%-os malátaagaron (MA2%) 5 napon át, sötétben nevelt kultúrákból. A tef1 (primerek: EF6-20F és EF6A-1000R), LSU (primerek: CLA-F és CLA-R), valamint ITS (primerek: ITS5 és ITS4) gént kódoló géneket minden izolátum esetében amplifikáltuk. A tef1 esetében 1 μl hígított genomiális DNS-t (1:100) használtunk templátként az amplifikációhoz az illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR gyöngyök (GE Healthcare) segítségével a következő feltételek mellett: kezdeti denaturációs lépés 94 °C-on 2 percig, majd 15 ciklus 94 °C-on 30 másodpercig, a kezdeti lágyulási hőmérséklet 65 °C-on, amely érintési ciklusonként 1 °C-kal csökken, és végső hosszabbítás 72 °C-on 1 percig. Egy második PCR-lépést végeztünk: 94 °C-on 30 másodpercig, majd 35 ciklus 94 °C-on 30 másodpercig, 48 °C-on 30 másodpercig és egy végső hosszabbítási lépés 72 °C-on 1 percig. Az ITS esetében 2 μL hígított genomi DNS-t (1:100) használtunk templátként a PCR-hez, a Schoch et al. által leírt feltételek szerint: 94 °C 3 percig, majd 35 ciklus 94 °C-on 1 percig, 55 °C-on 1 percig és egy utolsó hosszabbítási lépés 72 °C-on 2 percig. Az LSU esetében 2 μL hígított genomiális DNS-t (1:100) használtunk a PCR-hez, az Augustin et al. által leírt feltételek szerint : 95 °C 2 percig, 40 ciklus: 30 s 95 °C-on, 60 s 62 °C-on, 90 s 72 °C-on és 5 perc hosszabbítás 72 °C-on. A PCR-termékeket GelRed™ (Biotium) festékkel festettük, és az 1%-os agaróz gélben végzett elektroforézist követően UV alatt vizualizáltuk.
Amplikonokat a Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) segítségével tisztítottuk a gyártó protokollját követve. A mintákat NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) készülékkel elemeztük, és 20 ng DNS-t szekvenáltunk a BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) segítségével a gyártó utasításait követve. Az Escovopsioides ITS régiójának magas GC-tartalma miatt 5% DMSO-t adtunk a szekvenálási reakciókhoz. Az elülső és fordított szekvenciákat ABI 3500 (Life Technologies) programban generáltuk, és a BioEdit v.7.1.3 programban kontigmákká állítottuk össze. A jelen tanulmányban generált szekvenciákat az NCBI-GenBankban helyeztük el (Additional file 1: S1 táblázat).
Filogenetikai elemzés
A jelen tanulmányban generált szekvenciákon kívül a típusfaj (E. nivea), valamint hat leírt Escovopsis faj és nyolc, a Hypocreales-hez tartozó gomba (Hypomyces, Trichoderma és Lecanicillium) szekvenciáit is az NCBI-GenBankból nyertük. Így az ebben a tanulmányban használt teljes adathalmaz 37 gomba szekvenciáit tartalmazta (Additional file 1: S1 táblázat).
A filogenetikai elemzéshez a szekvenciákat MAFFT programmal illesztettük egymáshoz. A tef1, az ITS és az LSU szekvenciáit a Winclada v.1.00.08 programban konkatenáltuk. A rekonstrukciós algoritmusként Bayes-féle következtetést alkalmaztunk. A tef1 és az ITS/LSU esetében a GTR + G és a GTR + I + G nukleotid szubsztitúciós modellt választottuk ki a jModeltest2 AIC segítségével, 95%-os konfidenciaintervallummal. Így az adathalmaz particionált független elemzéseit MrBayes-ben végeztük el, egyenként három fűzött lánccal és egy hideg lánccal. Az MCMC-mintavételezés minden elemzésben egymillió generációig történt. A fűtött és hideg láncok konvergenciája akkor következett be, amikor az osztási gyakoriságok standard eltérése 0,01 alatt volt; ekkor a generációk első 25%-át burn-in-ként elvetettük.
Kettős kultúrás kísérletek
In vitro vizsgálatokat végeztünk az Escovopsioides antagonista potenciáljának igazolására a levélvágó hangyák által termesztett gombával szemben. A 21 Escovopsioides izolátumból 13-at választottunk ki (3. táblázat) a következő kritériumok alapján: i) a tef1 génben talált bármilyen polimorfizmus; ii) különböző társult hangyafajok; iii) földrajzi elhelyezkedés (azaz különböző városok és gyűjtőhelyek). A kiválasztott izolátumok közül kettőt (LESF 596 és LESF 599) már értékelték a Varanda-Haifig és munkatársai által végzett vizsgálatban a gombafajtával való kölcsönhatásukat. Ezt a vizsgálatot azonban megismételtük, hogy további Escovopsioides izolátumokkal is összehasonlíthassuk.
A kettős kultúrkísérletekben az Atta sexdens rubropilosa hangyafaj által termesztett Leucoagaricus gongylophorus FF2006 gombát használtuk. Ezt a törzset agarlemezeken tartják fenn 24 naponkénti egymást követő transzferekkel 25 °C-on. A gongylidiumok termelődését minden egyes transzferciklusban ellenőrizzük. Ezt a gombát PDA táptalajon tenyésztették, és 14 napig 25 °C-on, sötétben inkubálták. Ezt követően a (8 mm átmérőjű) micéliumtöredékeket a peremtől 1,5 cm távolságra új, szintén PDA-t tartalmazó Petri-lemezekre (90 × 15 mm) helyeztük át. Ezeket a lemezeket 25 °C-on 14 napig inkubáltuk sötétben. Ezután a korábban PDA-n inkubált Escovopsioides micéliumdarabokat (8 mm átmérőjű) a mutualista gombától 3 cm távolságra beoltottuk. Az Escovopsioides és más gombák által okozott hatások összehasonlításához az Escovopsioides micélium növekedésére gyakorolt hatását az Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brazília) gombakertjeiből származó egyik Escovopsis sp. izolátumot (LESF 19) használtuk. Ezt az izolátumot a gombakertek kis darabjainak klóramfenikollal kiegészített PDA-ra történő beoltásával nyertük. A kontrolllemezeket ugyanezzel a mutualista gombával oltották be, azonban nem oltottak be Escovopsioides vagy Escovopsis gombákat. Minden lemezt 14 napig inkubáltunk 25 °C-on, sötétben. Az Escovopsioides, Escovopsis és a mutualista gomba minden egyes kombinációját tíz lemezen végeztük el. A kísérleti és kontroll lemezeket 0, 2, 3, 5, 7 és 10 napos időközönként szkenneltük egy HP Deskjet F2050 szkennerrel. A képeket a mutualista gomba kolónia növekedési területének (cm2 ) mérésére használtuk az ImageJ v. 1.38 .
A L. gongylophorus micélium növekedési területét a kettős kultúrás kísérletekben kétirányú vegyes ANOVA segítségével elemeztük, ahol a gomba izolátumok (Escovopsioides és Escovopsis) kontra kontroll volt a kísérleti alanyok közötti változó, az idő (napok) pedig a kísérleti alanyokon belüli változó, így figyelembe véve az idő ismétlődő méréseit a kezelésekben. Az adatokat a Shapiro-Wilk és a Levene-tesztek segítségével ellenőriztük a varianciák normalitására és homogenitására. E kritériumok megsértése miatt az adatokat szükség esetén logaritmus vagy négyzetgyök segítségével transzformáltuk. A különböző fonalas gombákkal végzett többszörös összehasonlításokat t-próbával végeztük Bonferroni korrekcióval.
Az izolátumok közötti összehasonlításhoz az Escovopsioides izolátumokkal érintkező L. gongylophorus micélium növekedési területét elosztottuk a kontroll 10. napon mért átlagos területével. Az adatokat a normalitás és a varianciák homogenitása szempontjából ellenőriztük. A 10. napon kapott területtel egyirányú ANOVA-t végeztünk az összes vizsgált gomba között, a különböző kezelések közötti összehasonlításokat pedig post-hoc Tukey-HSD teszttel végeztük. A statisztikai elemzéseket az R v. 2.12.1 programban végeztük.
Gombakert töredékein végzett biológiai vizsgálatok dolgozók hiányában
A Leucoagaricus gongylophorus-t attine hangyakolóniákban, gombakertekben tenyésztik. Annak megállapítására, hogy az Escovopsioides kifejlődhet-e a gombakertben a dolgozók esetleges védőhatása nélkül, bioteszteket végeztünk e szubsztrátum hangyáktól mentes töredékein. A gombakert darabjait egy érett és egészséges A. sexdens rubropilosa kolóniából nyertük, amelyet a Társas Rovarok Tanulmányozásának Központjában (UNESP, Rio Claro) tartanak fenn. A hangyáktól és a költéstől megfosztott 2 cm3 -es gombaültetvény-darabokat steril Petri-csészékbe helyeztük, amelyeknek a szélét megnedvesített vattával láttuk el (Elizondo-Wallace és mtsai. szerint). A kísérletek elvégzése előtt a tányérokat 1 napig 25 °C-on tartottuk, hogy megkeressük az esetlegesen a töredékekben maradt hangyákat.
Egy 10 ml 0,05%-os Tween 80 szuszpenziót készítettünk a 12 Escovopsioides (a LESF 591 izolátumot ebben a kísérletben nem használtuk) és egy Escovopsis izolátum mindegyike micéliumtömegével és konídiumaival, amelyeket a kettős tenyésztési kísérletekben használtunk. Ezt a szuszpenziót kétszer-háromszor szűrtük a Newmeyer-féle módszer szerint, hogy a konídiumokat elválasszuk a szuszpenzióban lévő hifatöredékektől. Ezután a szuszpenziót Neubauer-kamrában 105-2,105 konídium ml-1 -re hígítottuk. A konídiumszuszpenzió 100 μL-es aliquotjait mikropipetta segítségével a kerti töredék felszínére oltottuk. Ugyanekkora mennyiségű steril 0,05%-os Tween 80 oldatot adtunk a kert felületére a negatív kontrollban. A gombakertet tartalmazó Petri-csészéket 25 °C-on tartottuk 10 napig, mindegyik kezeléshez öt csészét, a megfelelő kontrollhoz pedig öt csészét használtunk. A beoltott gombák esetleges hifáinak fejlődését naponta megfigyeltük sztereomikroszkópon (EZ4, Leica). Az Escovopsioides konídiumképződését a gombakerteken úgy figyeltük meg, hogy a kerteken növekvő micéliumdarabokat vízbe helyeztük és mikroszkóp alatt (DM500, Leica) figyeltük meg.
A gombakertek növekedési és konídiumképződési adatait a következőképpen pontoztuk: nincs növekedés (0 pont), csak a sztereomikroszkópon megfigyelt növekedés (1 pont), makroszkopikus növekedés (2 pont) és konídiumképződés (3 pont) a megfigyelés 10 napja alatt (Additional file 1: S1 ábra). Konídiumképződést csak a gombák makroszkópos növekedése után figyeltünk meg a gombakerteken. Az egyes napokon kapott öt Petri-csésze pontszámok teljes összegét kaptuk meg, és a közvetlen összehasonlításhoz a maximálisan lehetséges összeg százalékában transzformáltuk.
Escovopsioides hatása a dolgozókkal rendelkező kertekre
A dolgozók fontos szerepet játszanak a kolóniák kórokozók és nemkívánatos mikrobák elleni védelmében a gombakertekben . Ezért kísérleteket végeztünk a dolgozók hatásának ellenőrzésére olyan gombakertekben, amelyeket ugyanazon gombák konídiumaival oltottunk be, amelyeket a biotesztekben használtunk a gombakertekben hangyamunkások hiányában (12 Escovopsioides izolátum és 1 Escovopsis izolátum).
A királynő-jogú hangyakolóniákat használó biotesztek kihívást jelentenek az ilyen típusú kísérletekhez szükséges nagyszámú kolónia miatt. Ezért a gombaizolátumok in vivo hatásainak felmérésére dolgozókat tartalmazó kertrészletekkel végeztünk bioteszteket. Bár ez a kísérleti elrendezés nem reprezentálja azt, ami a természetes kolóniákban előfordul, indikatív információkat mutatott a dolgozók védekező hatásáról a vizsgált gombákkal szemben. Ezt a biotesztet az Elizondo-Wallace és munkatársai által kidolgozott módszert követve adaptálták. A gombakertek kiszáradásának elkerülése érdekében műanyag edényeket használtak, amelyek alján egy apró gipszréteg volt. Az előző kísérletben használt kolóniából származó kb. 20 cm3 gombakertet helyeztünk a műanyag tartályokba. A kísérleti elrendezés összesen 84 konténerből állt, így a 13 gomba konídiumaival végzett kezelések és a kontroll egyenként hat konténerből álltak. Kiválasztottuk azokat a dolgozó hangyákat, amelyeknek a fejkapszula átmérője 1,0 és 1,6 mm között volt, majd minden konténerbe 50 ilyen dolgozót helyeztünk. Az 1,0 mm-nél kisebb munkásokat nem számoltuk, az 1,6 mm-nél nagyobb munkásokat pedig kizártuk. Ezt az eljárást azért alkalmaztuk, hogy az egyes kezelésekből származó hat konténer, valamint a kezelések közötti homogenitást biztosítsuk, mivel az 1,0 és 1,6 mm közötti intervallumban lévő dolgozók jelentős tisztítási aktivitással rendelkeznek. A konténer belső felületét teflon® bevonattal láttuk el, hogy megakadályozzuk a hangyák kiszabadulását.
A konténereket 25 °C-on inkubáltuk 3 napig a gombakertek stabilizálása érdekében. A konídiumszuszpenziókat a fent leírtak szerint nyertük. Összesen 1 ml konídiumszuszpenziót permeteztünk a gombakertek felületére permetezőgép segítségével. A negatív kontrollban lévő gombakerteket csak 1 mL steril 0,05%-os Tween 80 oldattal permeteztük be.
A kísérleteket a beoltás után 0, 5 és 10 nappal ellenőriztük a gombakertek egészségének ellenőrzése céljából. Ez a paraméter egy pontozási rendszer alapján történt, amelyben az egészséges kertek 0 pontot, a részben lebomlott kertek 1 pontot, a teljesen lebomlott (“fertőzött”) kertek pedig 2 pontot kaptak. A gombakertek darabjainak hangyák általi eltávolítása és a szemétlerakókba helyezése volt a kertek állapotromlásának fő jele, amelyet vizsgáltunk (lásd 1. kiegészítő fájl: S2. ábra). Az egyes kísérletek hat konténeréből a megfigyelés 3 napján kapott pontszámokat Friedman-teszt segítségével hasonlítottuk össze.
Az Escovopsioides izolátumok jelenlétének igazolására a gombakerteken a kezelést követő 0., 5. és 10. napon a kertekből eltávolított darabokat 150 μg ml- 1 klóramfenikollal kiegészített MA2%-on oltottuk be. A lemezeket 25 °C-on inkubáltuk 7 napig, sötétben. Az egyes kezelések hat konténerének mindegyikéhez öt, egy-egy kerti töredéket tartalmazó lemezt használtunk, összesen 30 lemezt kezelésenként. A pozitív növekedést mutató töredékeket megszámoltuk, és a beoltott gombák hosszú távú jelenlétét a gombakertekben a Fisher-féle Exact teszt segítségével vizsgáltuk. Ebben az elemzésben összehasonlítottuk a gombakonídiumokkal (Escovopsioides és Escovopsis) fertőzött szegélyek arányát a konídiumok nélküli kontrollhoz képest a kísérlet minden egyes napján. A beoltott gombákkal végzett különböző kezeléseket is összehasonlítottuk egymás között a kísérlet minden egyes napján.