Study design

A kétkarú, kettős vak, randomizált vizsgálatban 60, 19-42 év közötti, a kanadai Vancouverben (BC) élő terhes nőt toborzunk. A résztvevőket randomizáljuk, hogy 16 héten keresztül naponta 0,6 mg/nap folsavat vagy (6S)-5-metil-tetrahidrofolsav egyenértékű dózisát (0,625 mg/nap) kapják (2. ábra). A 0,6 mg-os dózis megfelel a vezető kereskedelmi forgalomban kapható prenatális vitaminok (Materna®) szintjének, ami növeli eredményeink általánosíthatóságát. A 16 hetes beavatkozás az RBC-folsav becsült felezési idején alapult, és lehetővé kívánja tenni a hosszú távú folsavstátusz mérését az RBC-kben (12-16 hét után) . Minden résztvevő kap egy folsavat nem tartalmazó szülés előtti multivitamint is, hogy más tápanyagok (pl. vas) megfelelőségét biztosítsák a terhesség alatt. Az elsődleges kimeneti értékek, köztük a szérumfolsav, az RBC-folsav és a plazma UMFA mérésére a kiindulási és a végponton éhgyomri vénás vérmintákat vesznek; a feltáró mérések közé tartozik a plazma S-adenozil-metionin, S-adenozil-homocisztein, teljes homocisztein, teljes cisztein, metionin, B12-vitamin, piridoxal-5-foszfát, szabad kolin és betain. Az MTHFR (677 C > T, rs1801133, és 1298 A > C, rs1801131) és DHFR (rs1643649 és rs70991108) variánsok genotipizálását és teljes vérképet is meghatározzák. A nőknek lehetőségük lesz folytatni a vizsgálat szülés utáni (feltáró) szakaszát, ahol a záróvizsgálaton további kiegészítőket kapnak, amelyeket körülbelül 1 héttel a szülés utánig szedhetnek. A szülés utáni 5-7. napon a nők egy kis (3 ml-es) anyatejmintát és egy nem éhgyomri vénás vérmintát adnak. Az anyatejben értékelt eredmények közé tartoznak a folsav formái (UMFA, THF, 5-metil-THF, 5-formil-THF és 5,10-metil-THF) és a tej FBP. A szülés utáni vérmintában értékelt eredmények közé tartozik az RBC-folát és a plazma UMFA. A vizsgálati protokollt a 2013. évi standard protokollelemekkel összhangban dolgozták ki: Ajánlás a beavatkozási vizsgálatokhoz (SPIRIT) című iránymutatásoknak megfelelően (3. ábra). További részletekért lásd az 1. kiegészítő fájlt (SPIRIT ellenőrzőlista).

részvételi folyamatábra

Standard protokollelemek: Recommendation for Interventional Trials (SPIRIT) schedule of enrollment, interventions and assessments

A pilot vizsgálat elsődleges célja, hogy becsléseket nyerjen a szérumfolsav, az RBC-folsav és az UMFA változásáról a (6S)-5-metil-tetrahidrofolsavval és folsavval történő, 16 hetes terhesség alatti kiegészítést követően, egy megfelelő teljesítményű végleges vizsgálat tervezéséhez. A másodlagos cél a toborzási és részvételi arányok meghatározása a végleges vizsgálat tervezésének és megvalósíthatóságának elősegítése érdekében. A szülés utáni szakasz feltáró célkitűzései a következők: az összes anyatejfolsav folsavként való arányának számszerűsítése az egyes csoportokban, az anyai plazma UMFA és az anyatejfolsav közötti összefüggés értékelése a szülés után, valamint az RBC folsav koncentrációjának értékelése a szülést követően az egyes csoportokban.

Résztvevők, toborzás és tájékozott beleegyezés

Bevételi kritériumok: (1) terhes nő (egyágyas terhesség); (2) Vancouver körzetében élő; (3) ≤ 21 hetes terhesség a beleegyezés időpontjában; (4) 19-42 évesek; és (5) képesek tájékozott beleegyezést adni.

Kizárási kritériumok: (1) ismert, az anyai folsavstátuszt befolyásoló, már fennálló egészségügyi állapotok (malabszorpciós és gyulladásos bélbetegségek, aktív cöliákia, gyomor bypass műtét, atrófiás gasztritisz, epilepszia, előrehaladott májbetegség, vesedialízis, 1-es vagy 2-es típusú diabetes mellitus, sarlósejtes trait/anémia) ; (2) életmódbeli tényezők, amelyekről ismert, hogy befolyásolják az anyai folsavszintet (jelenlegi dohányzás, alkoholfogyasztás, szabadidős drogfogyasztás) ; (3) közepes vagy magas kockázat az NTD-vel fertőzött terhesség kialakulására (vonatkozik a nőkre vagy férfi partnerükre: más, folsavra érzékeny veleszületett rendellenesség személyes vagy családi kórtörténete (szülők vagy testvérek), személyes NTD kórtörténet vagy korábbi NTD-vel érintett terhesség) ; (4) olyan gyógyszerek, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a B-vitaminok anyagcseréjét (klóramfenikol, metotrexát, metformin, szulfaszalazin, fenobarbitál, fenitoin, primidon, triamteren, barbiturátok) ; (5) terhesség előtti testtömegindex (BMI) ≥ 30 kg/m2 ; vagy (6) allergia bármely vizsgálati kiegészítő összetevőjére.

Mintaméret

A mintaméretet az elsődleges cél alapján számították ki, hogy megbecsüljék az elsődleges kimenetelek (szérumfolsav, RBC-folsav és UMFA) változásának eloszlását (átlag ± szórás) a 16 hetes kiegészítést követően. Ennek eléréséhez 50 nőre lesz szükségünk (25 nő minden csoportban); a legalább n = 50-es mintát általában megfelelőnek ismerik el a klinikai kutatási kísérleti vizsgálatokhoz . A 20%-os inflációt hozzáadjuk a kieső résztvevők vagy a nyomon követés elvesztése miatt; így összesen 60 nőt (30 mindkét csoportban) fogunk toborozni.

Toborzás

A plakátokat a BC Women’s Hospitalban, orvosi és terhesgondozó klinikákon és terhes nőknek szóló kiskereskedelmi létesítményekben (pl. terhesgondozási órák, fitness stúdiók, kismamaruha-üzletek) fogják elhelyezni Vancouverben (BC, Kanada). A tanulmány részleteit megosztják a személyzettel és az egészségügyi szakemberekkel, beleértve az orvosokat, szülésznőket, ápolókat és adott esetben másokat. A közösségi médiában (Facebook és Instagram) hirdetéseket fognak használni, és a 19-42 év közötti terhes nőket célozzák meg Vancouver, BC környékén.

A tájékozott beleegyezés megszerzése és a jogosultság megerősítése

A részvétel iránt érdeklődő nők közvetlenül a kutatási koordinátorral (KMC) veszik fel a kapcsolatot. Ekkor ismertetik a vizsgálat részleteit, a jogosultságot és a tájékozott beleegyezést. A jogosult résztvevők, akik részt kívánnak venni a vizsgálatban, kapnak egy vizsgálati azonosítót, és megtervezik az alapvizsgálat időpontját. A résztvevőket arra utasítják, hogy az alapvizsgálatig folytassák a jelenlegi szülés előtti multivitamin-/folsav-kiegészítést. A vizsgálat fakultatív szülés utáni szakaszát a beleegyező nyilatkozatban ismertetik; azonban azok a résztvevők, akik úgy döntenek, hogy az elsődleges 16 hét után is folytatják a vizsgálatot, külön beleegyező nyilatkozatot kapnak aláírásra.

Tanulmánylátogatások

A tanulmánylátogatásokat Vancouverben, BC, Kanada, a University of British Columbia, Food, Nutrition and Health Building-ben és a BC Children and Women’s Hospital Clinical Research Evaluation Unit-ban fogják elősegíteni. Alapállapot (8-21 hetes terhesség): Mind a résztvevő, mind a kutatási koordinátor (KMC) aláírja a beleegyező nyilatkozatot; egy példányt beszkennelnek és e-mailben elküldenek a résztvevőnek a vizsgálati látogatást követően. A résztvevők kitöltik a kiindulási kérdőívet az orvosi és táplálkozási kórtörténet és a demográfiai adatok rögzítésére. A DFE-k kiszámításához egy validált étkezési gyakorisági kérdőívet használnak. A testsúlyt és a testmagasságot elektronikus mérleg és stadiométer segítségével mérik, és 0,1 kg, illetve 0,10 m pontossággal rögzítik. 12 ml, 3 órás éhgyomri vénás vérmintát vesznek. A résztvevők megkapják a vizsgálati kiegészítőket (folsav vagy (6S)-5-metil-tetrahidrofolsav), és kapnak egy kiegészítő naplót a napi bevitel rögzítésére. Félidő: 8 hét elteltével minden nővel felvesszük a kapcsolatot, hogy ellenőrizzük a megfelelőséget, foglalkozzunk az esetleges kérdésekkel vagy aggodalmakkal, és egy záróvizsgálatot ütemezzünk be. Végpont (24-37. terhességi hét): 12 ml-es, 3 órás éhgyomri vénás vérmintát vesznek, a súlyt a fent leírtak szerint mérik, és a résztvevők kitöltik a végponti kérdőívet, hogy megállapítsák az egészségi állapot vagy a gyógyszerhasználat változását a kiindulási érték óta. A résztvevők visszaküldik a táplálékkiegészítő naplójukat, és az összes megmaradt kapszulát megszámolják. Szülés utáni időszak: a végponti látogatáskor azok a résztvevők, akik szoptatást terveznek, és akiknek van működő háztartási fagyasztójuk, folytathatják a vizsgálat szülés utáni szakaszát. Miután a beleegyezést egy második beleegyező nyilatkozat segítségével megszerezték, a szülés után körülbelül 1 hétig szedendő étrend-kiegészítőket és egy új étrend-kiegészítő naplót kapnak. A résztvevőket kiképzik, hogyan gyűjtsenek otthonukban egy kis (3 ml-es) anyatejmintát a szülés utáni 5-7. napon, és minden szükséges felszerelést megkapnak (részletesebben az alábbi “Anyatejgyűjtés és feldolgozás” szakaszban ismertetjük). A résztvevők az anyatejmintát a fagyasztóban tárolják, és értesítik a kutatási koordinátort, amikor készen áll az átvételre. Az átvételre az értesítéstől számított 4 napon belül kerül sor, és ekkor 12 ml vénás vérmintát vesznek. A nőket arra fogják utasítani, hogy az anyatej- és a vérminta vétele előtt 2 órával vegyék be a folsav-kiegészítőt, hogy a plazma UMFA csúcsértékét (és az UMFA esetleges felvételét az anyatejbe; ennek a folyamatnak az időzítése azonban nem jól leírt) standardizálják.

Kutatási kiegészítők

A folsavat és a (6S)-5-metil-tetrahidrofolsavat a szülés előtti multivitaminoktól elkülönítve fogják biztosítani. Ezt a döntést azért hozták, mert néhány nő intoleranciáról számolt be a terhes multivitaminok fogyasztásakor; ez általában a magas vastartalom miatt van, és az első trimeszter után megszűnik . Átmeneti intolerancia esetén a résztvevők kihagyhatják vagy fél adagot vehetnek be a multivitaminból, miközben továbbra is a teljes adag folsavval egészítik ki a készítményt. A folsav és a prenatális multivitaminok ömlesztett összetevőit a Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) biztosította. Az ömlesztett (6S)-5-metil-tetrahidrofolsavat (Metafolin®) a Merck & Cie (Schaffhausen, Svájc) biztosította. Minden ömlesztett összetevőt a Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) állított össze növényi gélkapszulákba. A folsav és a (6S)-5-metil-tetrahidrofolsav kapszulák külseje megegyezik a kettős vakká tétel érdekében. A prenatális multivitamin ugyanazt a mikrotápanyag-készítményt tartalmazza, mint a WN Pharmaceuticals Ltd.® Prenatal (NPN 80025456), kivéve, hogy a folsavat eltávolították. A Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) elkészítette az összes vizsgált étrend-kiegészítő minőségi összefoglalóját, amelyet a Health Canada ellenőrzött, a folsav és a (6S)-5-metil-tetrahidrofolsav dózisának nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával történő megerősítésével. A Health Canada természetes és vény nélkül kapható egészségügyi termékekkel foglalkozó igazgatósága 2019. július 26-án engedélyt adott a klinikai vizsgálatok iránti kérelemre (Submission No. 244456).

Kettős elvakítás, randomizáció és a kiegészítő csomagok biztosítása

A Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) független kutatóasszisztense fogja a folsav- és (6S)-5-metil-tetrahidrofolsav-kiegészítőkhöz az elvakítási kódokat (A vagy B) hozzárendelni. A folsav-kiegészítők üvegeit “A” vagy “B” felirattal fogják ellátni, és jelezni fogják, hogy “a kapszulák vagy folsav vagy folsav”. Mind a résztvevők, mind az elsődleges kutatócsoport vakok lesznek a kiegészítőket illetően, amelyeket csak a végleges statisztikai elemzések befejezése után kódolnak le. A randomizálási sorrendet egy független statisztikus fogja számítógépen generálni, négyes blokkokat használva, amelyek mindegyike két résztvevőt tartalmaz kiegészítő csoportonként. Az elsődleges kutatócsoport vak lesz a randomizálási sorrendre. Az egyes résztvevők alapvizsgálatakor a kutatási koordinátor (KMC) csak az adott vizsgálati azonosítóhoz tartozó allokációt (A vagy B) oldja fel a vakon, hogy a kiosztott vizsgálati kiegészítőket átadhassa. Az induláskor a résztvevők egy kiegészítő csomagot kapnak, amely a 16 hetes beavatkozás összes kapszuláját tartalmazza; ha a résztvevők úgy döntenek, hogy folytatják a vizsgálat szülés utáni szakaszát, akkor a végponti látogatáson további kiegészítőket kapnak, amelyeket ~ 1 héttel a szülés utánig szedhetnek.

Kísérő gyógyszerek

A beiratkozás után a gyógyszerbevitelre vonatkozóan nem lesz korlátozás a beavatkozási időszak alatt; azonban minden gyógyszert be kell jelenteni. Az egyetlen kivétel a folsav/folsavtartalmú táplálékkiegészítők, amelyek a beavatkozási időszak alatt nem engedélyezettek.

Stratégiák az adherencia fokozására

A várandós nők általában nagyon motiváltak és általában érdekeltek a klinikai kutatási vizsgálatokban való részvételben . A kanadai Közegészségügyi Ügynökség felmérése szerint Brit Kolumbiában a nők 94%-a szed szülés előtti multivitaminokat a terhesség alatt . Ezért a résztvevők a beiratkozáskor valószínűleg hozzászoktak a napi pótláshoz. A kutatási koordinátor (KMC) minden résztvevővel kapcsolatba lép a félidőben (8 héttel az alapvizsgálat után), hogy bármilyen kérdéssel vagy problémával foglalkozzon. Ezenkívül a kiegészítő csomag lehetővé teszi a kiegészítők szervezett otthoni tárolását, a kiegészítő napló pedig napi emlékeztetőként szolgál majd a 16 hét alatt a betartás fokozása érdekében. Ezen okok miatt arra számítunk, hogy a vizsgálati protokollhoz való ragaszkodás magas (> 90%) lesz.

Vérminták gyűjtése és feldolgozása

Vénás vérmintákat (összesen 12 ml) veszünk egy 6 ml-es etiléndiamin-tetraecetsav

(EDTA) csőbe, egy 2 ml-es EDTA csőbe és egy 4 ml-es szérumcsőbe (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) a kiindulási, a végpont és a szülés utáni (ha alkalmazható) látogatáskor. A kiindulási és a záró vérvételre 3 órás koplalást követően kerül sor; ez az időkeret elegendő ahhoz, hogy csökkentse a közelmúltbeli folsavbevitel zavaró hatását a szérumkoncentrációra. A szülés utáni vérvétel (~ 1 héttel a szülés után) nem lesz koplalásos, mivel ez nem befolyásolja az RBC-folátot, és csökkenti a résztvevők terhelését. A vérvétel után a csöveket fénytől védve, a gyártó ajánlásainak megfelelően óvatosan megfordítva, hűtőtáskában helyezzük el, és a laboratóriumba szállítjuk azonnali feldolgozásra (a gyűjtéstől számított 2 órán belül).

A teljes vér hemolizátum elkészítéséhez a 6 ml-es EDTA-csőből teljes vért (0,3 ml) veszünk, és 3,0 ml 1%-os aszkorbinsavoldat hozzáadásával 1/11-re hígítjuk, majd 37 °C-on 30 percig inkubáljuk. Ezt követően a 6 ml-es EDTA-csövet 3000 rpm-en 15 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A plazmát összegyűjtjük, és (csak az alap- és végvonal minták esetében) a 6 ml-es EDTA-cső fennmaradó tartalmát feldolgozzuk a perifériás vér mononukleáris rétegsejtjeinek (PBMC) izolálásához a SepMate PBMC izolálási protokollal (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Kanada). A 2 ml-es EDTA-csövet a teljes vérképhez használják. A 4 ml-es szérumcsövet szobahőmérsékleten hagyjuk ~ 30 percig (amíg megalvad), majd 3000 rpm-en 15 percig 4 °C-on centrifugáljuk; a szérumot összegyűjtjük. Minden aliquotot -80 °C-on tárolunk a további elemzésig.

Az anyatej gyűjtése és feldolgozása

A nőket arra utasítjuk, hogy a szülés utáni 5-7. napon 13:00 és 14:50 között gyűjtsenek anyatejet (mivel az ebben az időben mért átlagos folátkoncentráció reprezentatívnak tűnik a 24 órás átlagos folátkoncentrációra nézve), 2-3 órával az utolsó teljes kifejezést követően. A résztvevők az anyatejet (kézzel vagy elektromos pumpával) teljes egészében a jobb mellből fejtik ki. Miután az anyatejet kinyomták, a nők utasítást kapnak arra, hogy óvatosan keverjék össze a tejet, majd steril sólyompipetta segítségével 0,5 ml-t töltsenek át két borostyánszínű kriovialba (mindegyik 0,005 g aszkorbinsavat tartalmaz 1%-os hígításhoz) és 1 ml-t két borostyánszínű kriovialba. A 0,5 és 1 ml-es szinteken minden kriovialitást egyértelműen meg kell jelölni. A nők az összes fiolát egy fagyasztódobozba helyezik, amelyet a fagyasztóban tárolnak legfeljebb 4 napig. A mintákat fagyasztva veszik ki, és a laboratóriumba szállítják, ahol -80 °C-on tárolják a további elemzésig.

Laboratóriumi elemzések

A szérumfolsav (nmol/L) és az RBC-folsav (nmol/L) elemzése mikrobiológiai módszerrel történik, a globális ajánlásnak megfelelően, a Molloy et.al által ismertetett mikrotiterlemezes módszerrel. Az RBC-folátot (nmol/L) a következő képlettel számítják ki :

Plazma biomarkerek, beleértve UMFA (nmol/L), S-adenozil-metionin (μmol/L), S-adenozil-homocisztein (μmol/L), az összes homocisztein (μmol/L), az összes cisztein (μmol/L), a metionin (μmol/L), a szabad kolin (μmol/L) és a betain (μmol/L) folyadékkromatográfiás tömegspektrometria segítségével kerül elemzésre. A B12-vitamint (pmol/L) immunanalizátorral elemzik. A piridoxal-5-foszfátot (nmol/L) folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriával elemzik. A génváltozatok genotipizálása TaqMan SNP genotipizáló tesztek segítségével történik. A teljes vérképet automatizált hematológiai analizátorral (Sysmex XNL-550) végzik. Az anyatej folát formáit (beleértve az UMFA, THF, 5-metil-THF, 5-formil-THF és 5,10-metenil-THF) folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriával számszerűsítik; a teljes folát e formák összegét jelenti. Az anyatej FBP-koncentrációját kompetitív kötődésű radioassay-eljárással mérik (Selhub és munkatársai által leírtak szerint).

A gyűjtendő adatok összefoglalása

Demográfiai, orvosi és táplálkozási adatok strukturált kérdőívek segítségével

A kiindulási adatok gyűjtése magában foglalja az életkort, az etnikai hovatartozást, a paritást, az iskolázottságot, a foglalkozást, a háztartás jövedelmét, az orvosi és gyógyszeres anamnézist, a terhesség előtti súlyt, az általános étrendet (beleértve a vegán, vegetáriánus, ketogén, gluténmentes élelmiszerek fogyasztását és a bármilyen okból kerülendő élelmiszereket/élelmiszercsoportokat) és a táplálékkiegészítők használatát. A végponti adatgyűjtés magában foglalja az általános egészségi állapotban vagy a gyógyszerhasználatban az alapvizsgálat óta bekövetkezett változásokat.

Anthropometria

A terhesség előtti BMI-t az önbevallás szerinti terhesség előtti testsúly és a mért testmagasság alapján számítják ki. A résztvevők mérései a kiindulási (testsúly és magasság) és a végponton (csak a testsúly) a terhességi súlygyarapodás kiszámításához a beavatkozási időszak alatt és a terhesség alatti teljes súlygyarapodás kiszámításához (az önbevallás szerinti terhesség előtti testsúly és a mért végponti testsúly felhasználásával).

Táplálkozás értékelése

A táplálékfolsavból és a kiegészítő folsavból származó teljes DFE-t (μg/nap) a Block Folic Acid/Dietary Folate Equivalents Screener (NutritionQuest, Berkeley, CA, USA), egy validált táplálkozási gyakorisági kérdőív segítségével számítják ki.

Szülés utáni adatok

A pótlás összes hetét, a terhességi heteket a szüléskor, az anyatejgyűjtési protokoll betartását, valamint a folsavpótlás időpontját az anyatej- és a szülés utáni vérvétel előtt rögzítik.

Megvonási kritériumok

A megvonási kritériumok közé tartozik a terhesség spontán vagy tervezett megszakítása, további folsav/folsavtartalmú táplálékkiegészítők használata, valamint a kiegészítőkkel/vizsgálati beavatkozással kapcsolatos (a minősített vizsgáló (CM) által meghatározott) nemkívánatos/súlyos nemkívánatos eseményt követően. A résztvevők bármikor visszaléphetnek, és további információkat nem gyűjtenek. A visszalépés okától függetlenül minden korábban gyűjtött adatot megőriznek az elemzéshez. Azoknak a résztvevőknek, akik a záróvizsgálat előtt szülnek, lehetőségük van a vizsgálat szülés utáni szakaszában folytatni a vizsgálatot, feltéve, hogy továbbra is napi rendszerességgel szedik a vizsgálati étrend-kiegészítőket.

Adatok kezelése és adatvédelem

Minden adatot és biológiai mintát az egyes résztvevők vizsgálati azonosítójával azonosítanak. A személyes azonosítókat tartalmazó adatokat egy titkosított, jelszóval védett számítógépen tárolják a BC Children’s Hospital Research Institute biztonságos szerverterében. A személyes azonosítóktól megtisztított adatokat megtisztítják, és a kutatási koordinátor (KMC) és egy független kutatási asszisztens a BC Children’s Hospital Research Institute által üzemeltetett REDCap (Research Electronic Data Capture) rendszerbe kettős bevitelt végez. A KMC, JAH és CDK hozzáféréssel rendelkezik a végleges adatkészlethez. A papíralapú dokumentumokat zárt iratszekrényben, a biológiai mintákat pedig a vezető kutató (CDK) laboratóriumában, a Brit Kolumbiai Egyetemen található zárt fagyasztóban tárolják. A résztvevőknek a végleges statisztikai elemzések befejezése után közölhetik a folsav-kiegészítő allokációjukat és a vér/anyatej (ha alkalmazható) folsav eredményeit (beleértve a DFE-ket, a szérum- és RBC-folsavszintet a kiindulási, a végponton és a szülés után, valamint az anyatej teljes folsavkoncentrációját).

Adatok és statisztikai elemzés

A résztvevők kiindulási adataira leíró statisztikákat fognak használni. A folyamatos változókat átlag ± standard eltérés (vagy medián és interkvartilis tartomány, ha nem normális eloszlásúak), a kategorikus változókat pedig csoportonkénti abszolút számok és százalékos értékek formájában közöljük. A kapszulák számát a résztvevők adherenciájának kiszámításához használják, a kiegészítő naplót pedig arra, hogy leíró betekintést nyújtson az adherencia akadályaiba. Az adatokat normális eloszlás szempontjából értékelik, és ha az adatok nem normális eloszlásúak, akkor transzformációt vagy egyenértékű nem parametrikus tesztek alkalmazását mérlegelik. A statisztikai elemzéseket a Stata (StataCorp, College Station, TX, USA) segítségével végzik. Minden elemzést kezdetben a kezelési szándék alapján végeznek el, a kezdeti csoportbeosztásnak megfelelően a kiindulási időpontban és a hiányzó adatok imputálása nélkül. A másodlagos per-protokoll elemzésekre azok bevonásával kerül sor, akik teljes mértékben befejezték a vizsgálatot és betartották a vizsgálati protokollt. Az érzékenységi elemzésekben szükség szerint többszörös imputációt alkalmazunk a hiányzó adatok korrekciójára.

Primer elemzések

Az elsődleges kimenetelek (szérumfolsav, RBC-folsav és plazma UMFA) átlagát ± standard eltérést számítjuk ki minden csoportban a kiindulási és a végponton, valamint a nőkön belüli változás átlagát ± standard eltérését ezekben a kimenetekben minden csoportban. Ezeket a becsléseket a végleges vizsgálat mintanagyságának kiszámításához fogják felhasználni.

Szekunder elemzések

Az elsődleges kimenetelek feltáró elemzéseit többszörös lineáris regressziós modell segítségével fogják elvégezni annak vizsgálatára, hogy a kiindulási értékek és a magyarázó változók (DFE-k, feltáró biomarkerek, terhességi hetek a kiegészítés megkezdésekor) figyelembevételével a változás a kiindulási és a végpont között különbözik-e a kezelési státusz szerint. Az UMFA ≥ 0,2 nmol/L (ami kimutatható koncentrációnak minősül) értékkel rendelkező nők arányát a kiindulási és a végponton az egyes csoportokban szintén kiszámítjuk. Másodlagos célkitűzésünk érdekében a vizsgálatban való általános részvételi arányt úgy becsüljük meg, hogy a beiratkozott nők teljes számát elosztjuk a részvétel iránt érdeklődő nők teljes számával. A heti toborzási arányt úgy becsüljük meg, hogy a beiratkozott nők teljes számát elosztjuk a toborzásukhoz szükséges hetek teljes számával. A résztvevők megtartási arányát úgy becsüljük meg, hogy a teljes vizsgálatot befejező nők számát elosztjuk a beiratkozott nők teljes számával. Minden egyes toborzási stratégia (beleértve a plakátokat, a közösségi médiát és a szájpropagandát) esetében értékelni kell a teljes elérést (csak a közösségi média), a megkereséseket, a beiratkozásokat és a költségeket. Az egyes stratégiák esetében a beiratkozás esélyét a megkeresés után esélyhányados segítségével értékelik. Ha rendelkezésre áll, a beiratkozás elmaradásának okait is rögzítjük.

Szülés utáni elemzések

Az anyatejben lévő folsav arányának (az anyatej folsavkoncentrációjának az összes anyatejfolsavforma összegével való osztása) és az anyai szülés utáni RBC-folsavnak az átlagát ± standard eltérését fogjuk kiszámítani. Lineáris regressziót használnak az anyatej folsavkoncentrációja és az anya szülés utáni plazma UMFA közötti kapcsolat becslésére. A szülés utáni eredményeket tovább elemzik többszörös lineáris regresszióval, a végponti értékek és a magyarázó változók (DFE-k, a pótlás összes hete, az anyatejgyűjtési protokoll betartása) figyelembevételével.

Biztonság

A folsav olyan dózisban biztosított, amely megfelel a terhes nőknek szóló kanadai ajánlásoknak (0,4-1,0 mg/nap); így alacsony kockázatúnak tekinthető. A (6S)-5-metil-tetrahidrofolsav kalciumsóját biztonságosnak ismerik el, és a kanadai prenatális multivitaminokban szerepel, és nincs megállapított tolerálható felső határérték (jelenleg nem ismert a károsodás kockázata). A randomizálásra a terhesség 8. és 21. hete között kerül sor (a neurális cső záródása után). Tekintettel e kísérleti vizsgálat alacsony kockázatára, nem tartották szükségesnek egy adatmegfigyelő bizottság összehívását. Minden biztonsági aggályt, és ha szükséges, a vizsgálat befejezéséről szóló döntést a vezető vizsgálatvezetők (CDK és JAH) és egy minősített vizsgálatvezető (CM) fogják kezelni, és jelenteni fogják a Kutatási Etikai Tanácsnak és az Egészségügyi Kanadának. A beavatkozási kódok elvakítását bármikor fel lehet oldani, ha azt a résztvevők biztonságának figyelemmel kísérése érdekében szükségesnek ítélik.