HypaCas9 és Cas9-HF1 lassú hasítási sebességet mutatnak
Kinetikai elemzéseinket az enzim aktív helyének koncentrációjának mérésével kezdjük az egyes Cas9 variánsok23 esetében,24,25. Az enzim növekvő DNS-koncentrációval történő titrálása során képződött termék mennyiségének mérése 31 nM, 26 nM, 23 nM aktív hely koncentrációt mutatott az SpCas9, a HypaCas9 és a Cas9-HF1 esetében a 280 nm-en mért abszorbancia alapján 100 nM névleges koncentrációjú enzimminták esetében (Kiegészítő ábra 1a-d). Az Integrated DNA Technologies (IDT) által gyártott SpCas9 és HiFiCas925 aktív centrum koncentrációját is megmértük, és hasonló aktív enzimkoncentrációt tapasztaltunk (Kiegészítő 1e-f. ábra). Fontos megjegyezni, hogy a jel telítéséhez szükséges DNS-koncentráció minden esetben megegyezett a képződött termék koncentrációjával, ami kizárja azokat az aggályokat, hogy az enzim egy része DNS-t kötne, de nem reagálna. Minden további kísérletet az aktív enzimnek az aktív hely titrálás során meghatározott koncentrációjával állítottunk be.
Az SpCas9 és a módosított változatok célzott vagy célon kívüli DNS-szubsztrátjainak kinetikájának összehasonlításához először a célszál (HNH) hasításának időbeli lefolyását vizsgáltuk az egyes enzimek esetében (1. ábra és 2. kiegészítő ábra). Az adatokat vagy egy- vagy kétszeres exponenciális függvénnyel illesztettük az (1) egyenlet, illetve a (2) egyenlet segítségével.
ahol Y a hasadási termék koncentrációját, A1 az amplitúdót, λ1 pedig a megfigyelt bomlási sebességet (sajátértéket)17 jelenti.
ahol Y a hasadási termék koncentrációját, A1 az amplitúdót, λ1 pedig az első fázisban megfigyelt sebességet jelenti. A2 az amplitúdót és λ2 a második fázisban megfigyelt sebességet jelöli.
A SpCas9 által a célzott és a célon kívüli szubsztrátok hasítási bomlási sebességének összehasonlítása azt mutatja, hogy a 3 bp PAM-distális eltérés 13-szor lassítja az enzimet (1 s-1-ről 0,076 s-1-re). Mindkét nagy hűségű Cas9 változat drámaian csökkenti a célzott DNS-szubsztrátumok hasításának megfigyelt bomlási sebességét 21- és 35-szörösére az SpCas9-hez képest (0,028 s-1 a HypaCas9 és 0,047 s-1 a Cas9-HF1 esetében, szemben az SpCas9 1 s-1 értékével). Ezenkívül a HypaCas9 és a Cas9-HF1 tovább csökkenti a célon kívüli DNS-hasadás bomlási sebességét 8-290-szeresére (0,0033 s-1 és 0,00016 s-1 sebesség) a cél-DNS-sel kapcsolatos sebességükhöz képest. Ezek az adatok drámai változásokat mutatnak a módosított változatok által a cél-DNS-en és a célon kívüli DNS-sel végzett hasítási sebességekben. Ezek a mérések azonban önmagukban nem határozzák meg a specifitás változásait, amely a DNS-hasítás és a disszociáció kinetikai felosztásának függvénye, és magában foglalja az útvonal első irreverzibilis lépéséig vezető összes lépést17 , beleértve a reverzibilis DNS-kötést, az R-hurok kialakulását, a HNH-domén dokkolását és a DNS-hasítást.
A DNS-tekercselés nagyrészt változatlan a Cas9-változatoknál
Mivel korábbi munkánk az R-hurok kialakulását a célzott hasítás sebességkorlátozójaként azonosította, és mások később azt javasolták, hogy az R-hurok kialakulásának és visszatekercselésének sebessége diktálhatja az SpCas9 és a Cas9-HF116 enzimspecifikusságát, megvizsgáltuk, hogy a HypaCas9 hasonló kinetikát mutat-e. Az összes enzim R-hurok képződési sebességének közvetlen mérésére egy olyan stop-flow vizsgálatot használtunk, amely a tCo -16 nt-nél lévő fluoreszcenciájának mérésén alapul, amely egy fluoreszcens triciklikus citozin analóg, amelyet a dsDNS-ben a bázisok egymásra rakódása kiolt, így a duplex megnyitása a fluoreszcencia nagymértékű növekedését eredményezi. A tCo- és a 2-AP-jelölt bázisanalóg szubsztrátjainkat a -16, -9, illetve -1 nt pozícióban használó kontrollkísérleteink (3. kiegészítő ábra) azt mutatják, hogy egyik analóg sem befolyásolja a DNS-hasadás megfigyelt bomlási sebességét. A tCo és a 2AP kémiai szerkezete sokkal kevésbé terjedelmes, mint a nagyobb Cy3 és Cy5 jelöléseké, és kevésbé valószínű, hogy zavarja az enzimkinetikát (4. kiegészítő ábra). Mg2+ jelenlétében az SpCas9, a HypaCas9 és a Cas9-HF1 közel azonos bomlási sebességgel (~2 s-1) bontja a cél-DNS-szubsztrátot (2. ábra). Meglepő módon a célon kívüli DNS-szubsztrátumok R-hurok képződésének bomlási sebessége az összes Cas9 változat esetében szintén nagyjából változatlan volt (0,85 s-1 és 2,59 s-1 között). A DNS-tekercselés tehát nem sebességkorlátozó, és nem korrelál a nagy hűségű változatok esetében megfigyelt hasítási sebességgel, ellentétben az SpCas9-cel.
Az R-hurok kialakulásának bomlási sebességét a tCo-tól (a nem célszál -16-os pozíciója) a fluoreszcencia növekedésének figyelésével mértük az idő függvényében, miután 10 mM Mg2+ jelenlétében az enzimet (28 nM) és a DNS-t (10 nM) összekevertük. Az adatokat kettős exponenciális függvényhez illesztettük, hogy megkapjuk az ábrázolt bomlási sebességeket. a, b SpCas9 (28 nm) a célzott (a) és nem célzott (b) DNS-sel, c, d HypaCas9 a célzott (c) és nem célzott (d) DNS-sel. e, f Cas9-HF1 on-target (e) és off-target (f) DNS-sel.
A tCo -16 nt-nél való elhelyezkedése miatt valószínű, hogy méréseink a kitekeredési folyamat egy késői lépését tükrözik. Összehasonlításképpen az R-hurok kialakulásának bomlási sebességét a PAM-hoz közvetlenül közeli pozícióban (-1 nt pozíció) megjelölt tCo segítségével mértük. Miután a Cas9-RNS-t gyorsan összekevertük a cél-DNS-szubsztráttal, a fluoreszcencia jelentős növekedését figyeltük meg, ahogy a DNS kitekeri a tCo bázisanalógot. Az adatokat egy kettős exponenciálishoz illesztettük, hogy meghatározzuk a 10 s-1-es fő bomlási sebességet (3a-f ábra). Érdekes módon ezek az eredmények azt jelzik, hogy amint a PAM-helyet az enzim bekapcsolja, a DNS kezdeti kitekeredése gyorsabb, mint a -16 nt-nél megfigyelt. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a -16 nt-nél megfigyelt nettó lecsengési sebesség a teljes lecsengéshez vezető több gyors lecsengési lépés függvénye lehet. Mivel azonban a kinetikában nem figyeltünk meg késleltetést, úgy tűnik, hogy a gyorsabb, korábbi részleges kitekeredési lépések vezetnek a teljes kitekeredés végső, sebességkorlátozó lépéséhez, amelyet a -16 nt pozícióban mértünk. Bár további vizsgálatokra van szükség a kitekeredés korábbi szakaszaiban előforduló eltérések hatásainak vizsgálatához, a jelenlegi mérésünk a legjobb becslést adja az R-hurok kialakulásának nettó sebességéről. Az R-hurok kialakulásának ezzel a jelöléssel mért bomlási sebessége nem különbözik az SpCas9 és a nagy hűségű változatok esetében sem az összes vizsgált szubsztráton, így úgy tűnik, hogy a DNS-tekercselés sebessége nem változik a módosított Cas9 enzimek által.
Az R-hurok kialakulásának bomlási sebességét a tCo (a nem célszál -1. pozíciója) fluoreszcencia növekedésének figyelésével mértük az idő függvényében, miután 10 mM Mg2+ jelenlétében az enzimet (28 nM) és a DNS-t (10 nM) összekevertük. Az adatokat kettős exponenciális függvényhez illesztettük, hogy megkapjuk az ábrázolt bomlási sebességeket. a, b SpCas9 (28 nm) a célzott (a) és nem célzott (b) DNS-sel, c, d HypaCas9 a célzott (c) és nem célzott (d) DNS-sel. e, f Cas9-HF1 a célzott (e) és nem célzott (f) DNS-sel. g A HNH domén átrendeződésének karikatúrája. h A Cy3 és Cy5 párossal jelölt FRETSpCas9-et a C867, illetve C355 ponton használtuk a HNH-domén mozgásának mérésére a célszubsztrátok hasítása során.
Az R-hurok kialakulásának sebességét a célszálhoz való HNH-domén dokkolásban részt vevő lépésekkel korrelálandó, az enzim konformációváltozását stop-flow analízissel mértük egy olyan Cas9-en, amelyet Cy3-mal és Cy5-tel jelöltünk a korábban leírtak szerint18. Röviden, a Cas9 cisztein-light változatát Cy3-mal jelöltük a 355-ös aminosavnál és Cy5-tel a 867-es aminosavnál. A FRET hatékonysága megnő, amikor a HNH-domén átrendeződik a katalitikusan aktív állapotba (3g. ábra). Miután a FRET-párral jelölt Cas9-et gyorsan összekevertük egy tökéletesen illeszkedő cél-DNS-szel, a FRET-hatékonyság növekedését figyeltük meg, ami azt jelezte, hogy a HNH-domén átrendeződik katalitikusan aktív állapotba. A HNH dokkolás bomlási sebességét ~2,5 s-1-nek mértük (3h ábra), ami hasonló az egymolekulás FRET-mérésekhez. Meglepő módon az R-hurok kialakulásának (1,5 s-1) és a HNH-domén dokkolásának megfigyelt sebessége nagyon hasonló, ami arra utal, hogy ezek a lépések kinetikusan kapcsolódhatnak egymáshoz. A HNH-domén mozgásának kissé gyorsabb megfigyelt bomlási sebessége a fordított reakciónak tudható be, mivel a domén mozgása az R-hurok kialakulása után vagy azzal egy időben jön egyensúlyba.
A DNS kitekeredésének bomlási sebességét egymolekulás módszerekkel is mérték FRET-párral jelölt DNS-t használva, a Cy3 és Cy5 a célszál -6 nt, illetve a nem célszál -16 nt pozíciójában volt jelölve16. Ezért a FRET-páros DNS-szubsztrátokat is megvizsgáltuk, hogy megpróbáljuk a FRET-jelet a megfigyelt DNS-hasadási sebességgel korrelálni. Először az egymolekulás vizsgálatokban korábban használt, Cy3/Cy5 jelölés nélküli16 szubsztrátot teszteltük, amely két nukleotid különbséggel rendelkezik a mi szubsztrátunkhoz képest, pontosabban egy T szubsztitúcióval a -16 és -18 pozíciókban. A célszál (HNH) hasadásának bomlási sebessége hasonló a mi szubsztrátunkéhoz (0,7 s-1 vs. 1 s-1, Kiegészítő 5a. ábra), tehát a szekvencia-kontextusnak ezen a pozícióban nincs jelentős hatása. A hasítást Cy3/Cy5-cel jelölt DNS-sel is vizsgáltuk ezzel a másik szekvenciával, és hasonló bomlási sebességet mutatott, mint a mi szekvenciánk (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, Kiegészítő ábrák 5b és 6a). Később megvizsgáltuk a célszál (HNH) hasadásának időbeli lefolyását a Cy3/Cy5-jelölt DNS-nek a mi szekvenciánkkal az egyes enzimek esetében (6. kiegészítő ábra). Az SpCas9 esetében a Cy3/Cy5-cel jelölt DNS reakciója egyetlen exponenciális értéket követ, jelentősen csökkentett bomlási sebességgel (0,06 s-1 vs. 1 s-1), ami a DNS-hasítás megfigyelt bomlási sebességének ~17-szeres csökkenését mutatja a nem jelölt szubsztráthoz képest. A módosított HypaCas9 és Cas9-HF1 szintén csökkent DNS-hasadási sebességet mutatott (0,0046 s-1 és 0,0016 s-1), ami 5,9-szer, illetve 28,75-ször lassabb, mint az azonos körülmények között mért, nem jelölt szubsztrátok esetében. Egyértelmű, hogy a Cy3/Cy5 jelölések interferenciája megváltoztatja a nagy hűségű változatok hatását a DNS hasítási sebességre. Összességében a DNS terjedelmes Cy3 és Cy5 jelölésekkel történő jelölése drámai hatással volt az enzimre. Ezen okok miatt nem végeztünk további vizsgálatokat a FRET-párral jelölt DNS felhasználásával.
A Cas9 specificitását a kinetikus particionálás szabályozza
Mivel az enzim specificitása az első, nagyrészt irreverzibilis lépésig vezető összes lépés függvénye, a DNS hasítását megelőző összes eseményt figyelembe kell venni17. Az intrinsic hasítási sebesség méréséhez megkerültük az általában sebességkorlátozó R-hurok képződési lépést azáltal, hogy az SpCas9-et a célponton kívüli DNS-sel előinkubáltuk Mg2+ hiányában, hogy a kötődés és a konformációs változások egyensúlyba kerülhessenek az SpCas9.DNS komplex kialakulásához. Ezután 10 mM Mg2+ hozzáadásával elindítottuk a kémiai reakciót. Korábbi vizsgálatainkban az R-hurok kialakulása volt sebességkorlátozó a cél-DNS-szel reagáló SpCas9 esetében, és a belső hasadási bomlási sebesség gyorsabb volt, amikor az előinkubációs protokollal mértük. Itt, a célon kívüli DNS-sel a HNH és a RuvC hasadási sebességét 0,12 s-1, illetve 0,14 s-1 értékben mértük (7c., d. kiegészítő ábra és 8. kiegészítő ábra), ami sokkal lassabb, mint az R-hurok kialakulásának sebessége. Érdekes módon ezek az eredmények azt mutatják, hogy a SpCas9 off-céllal rendelkező enzim útjának sebességkorlátozó lépése a DNS hasítása, mivel az R-hurok kialakulásának általunk mért bomlási sebessége 0,85 s-1 volt (2b. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a megkülönböztetés legalábbis részben a sebességkorlátozó lépés azonosságának megváltozásán alapul a célponton és a célponton kívüli DNS összehasonlításakor.
Ezeket a kísérleteket megismételtük HypaCas9 és Cas9-HF1 célponton vagy célponton kívüli DNS-sel. Ezek az eredmények 0,035 s-1 és 0,0023 s-1 megfigyelt HNH hasítási sebességet határoztak meg a HypaCas9 számára on- és off-target szubsztrátokkal (7g, k kiegészítő ábra). A Cas9-HF1 megfigyelt hasítási sebességét on- és off-target szubsztrátokkal 0,038 s-1 és 0,00014 s-1 értékben mértük (7o. kiegészítő ábra, q). Ezek a megfigyelt hasadási sebességek valamivel gyorsabbak, mint a DNS és Mg2+ egyidejű hozzáadásával mértek, ami arra utal, hogy az R-hurok kialakulásától eltérő, de a DNS hasítását megelőző lépés lassíthatja a megfigyelt bomlási sebességet. Mindazonáltal ezek az eredmények azt mutatják, hogy a cél-DNS megfigyelt hasítási sebessége ~100-szorosára csökken mind a HypaCas9, mind a Cas9-HF1 esetében az SpCas9-hez képest. A célon kívüli DNS esetében a HypaCas9 vagy a Cas9-HF1 esetében a megfigyelt hasítási sebesség 50-, illetve 860-szorosára csökken az SpCas9-hez képest.
A megkülönböztetést nem kizárólag a DNS hasításának relatív sebessége határozza meg. Mivel az R-hurok kialakulása gyors, a megkülönböztetés inkább a DNS-felszabadulás és a DNS-hasítás sebessége közötti kinetikai felosztás függvénye17,26,27. A kinetikai megoszlás számszerűsítése érdekében az enzimet és a jelölt DNS-t Mg2+ hiányában inkubáltuk, ami lehetővé teszi az R-hurok kialakulásának egyensúlyba kerülését, de megakadályozza a katalízist15. Ezután Mg2+ -t adtunk a reakció beindításához, nagy mennyiségű azonos, nem jelölt cél-DNS jelenlétében, amely csapdaként szolgál. A DNS-csapda jelenlétében és hiányában végzett párhuzamos kísérletek összehasonlításával becslést kaptunk a disszociáció és a kötött DNS hasadásának frakcionális kinetikai megoszlására (4a. ábra). Amint az SpCas9 a cél-DNS-hez kötődött, gyorsan hasadt, és a DNS-csapdának alig volt hatása (4b. ábra). Ezzel szemben a célon kívüli DNS 33%-a disszociált az enzimről, míg a DNS ~67%-a kötődött a hasításhoz (4c. ábra és 9a. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az SpCas9 úgy diszkriminál a PAM-distális nem illeszkedő DNS-sel szemben, hogy csökkenti a hasítási sebességet, ami növeli a DNS azon hányadát, amely inkább felszabadul, mint hasad. A hatás azonban kicsi, így a disszociációs ráta lassabbnak tűnik, mint a hasítás.
a A DNS-csapda kísérlet vázlata. b, c A SpCas9 hasítása a célponton (Gong és mtsai.15 alapján.) (b) vagy célponton kívüli (c) DNS hasítása. d, e HypaCas9 hasítása célponton belüli (d) vagy célponton kívüli (e) DNS hasítása. f, g Cas9-HF1 hasítása célponton belüli (f) vagy célponton kívüli (g) DNS hasítása. Az enzimet (28 nM) és a jelölt DNS-t (10 nM) Mg2+ hiányában inkubáltuk, és a reakciót Mg2+ hozzáadásával indítottuk el, a nem jelölt DNS-csapda feleslegének jelenlétében vagy hiányában. A- és A◦ az amplitúdót ábrázolja csapdával (kitöltött körök), illetve csapda nélkül (nyitott körök). A százalékos arány az előzetesen kötött DNS-nek a hasításhoz továbbhaladásra elkötelezett hányadát jelzi a csapda nélküli reakcióhoz viszonyítva.
A következőkben a cél-DNS-hez kötött HypaCas9 és Cas9-HF1 kinetikai megoszlását vizsgáltuk (4d, f ábra, 9b, d kiegészítő ábra). A HypaCas9 és a Cas9-HF1 esetében kapott eredményeink azt mutatják, hogy a cél-DNS ~75%-a, illetve ~92%-a hasadt le a csapda jelenlétében. A hasított százalék kisebb, mint a vad típusú SpCas9 esetében, mivel a HypaCas9 (0,035 s-1) és a Cas9-HF1 (0,038 s-1) által a cél-DNS esetében megfigyelt belső hasítási bomlási sebesség 100-szor lassabb volt, mint az SpCas9 esetében (4,3 s-1). Ez a lassabb hasítási sebesség időt ad a cél-DNS egy kis hányadának (8-25%) a disszociációra, mielőtt az hasításra kerülne.
A disszociációt elősegítő kinetikai megosztás fokozódott, amikor a HypaCas9 és a Cas9-HF1 a célon kívüli DNS-sel reagált, mivel a hasítási sebesség tovább csökkent 0,0023 s-1-re, illetve 0,00014 s-1-re (4e, g ábra, 9c, e kiegészítő ábra). Ezek a sebességek 50-, illetve 860-szor lassabbak, mint a SpCas9 esetében a célponton kívüli szubsztráton. Ennek megfelelően a csapda DNS jelenlétében a HypaCas9 és a Cas9-HF1 csak ~24%-át, illetve ~10%-át kötötte meg a célon kívüli DNS-nek, hogy továbbhaladjon a hasításhoz. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a módosított nagy hűségű változatok a PAM-distális nem illeszkedő DNS ellen javított specificitást szereztek a jelentősen csökkent hasítási sebességen keresztül, ami megváltoztatja a kinetikai megoszlást, és a kötött szubsztrát felszabadulásának kedvez, nem pedig hasításának, mind az on-, mind az off-cél DNS esetében, de a hatás nagyobb az off-cél DNS esetében. A látszólagos disszociációs sebességállandók kiszámítása a (3. egyenlet segítségével azt mutatja, hogy a nagy hűségű változatok nem növelik a DNS-felszabadulás látszólagos sebességét (1. kiegészítő táblázat).
A megnövekedett diszkrimináció inkább teljes egészében a hasítás látszólagos sebességállandójának csökkenésének tulajdonítható.
A Cas9 enzimek kinetikájának eddigi leírásaiban a reakciók megfigyelt bomlási sebességeit az adatok exponenciális függvényekre való illesztése alapján becsültük, amelyek sajátértékeket adnak, amelyek általában több sebességállandó összetett függvényei17. A kinetika és a mechanizmus teljes megértése érdekében az egyes enzimekre és DNS-szubsztrátokra vonatkozó összes kísérletet globálisan illesztettük a sebességegyenletek numerikus integrálása alapján, egyetlen egységes modell segítségével (5. ábra és 10-14. kiegészítő ábra). A globális adatillesztés azt mutatja, hogy a minimális modellünk (5f. ábra, betét) figyelembe veszi az adatainkat, és az egyes sebességállandók jól definiáltak a bizalmi kontúrelemzés alapján, amely azt vizsgálja, hogy az egyes paramétereket milyen mértékben korlátozzák az adatok (6. ábra)17,28. Figyeljük meg különösen, hogy a modellünk figyelembe veszi az egyes kísérletekben megfigyelt kétfázisú nyomvonalakat anélkül, hogy heterogenitásra kellene hivatkoznunk, és az útvonal minden egyes lépésére, beleértve az R-hurok kialakulását, valamint a HNH és RuvC hasadási eseményeket is, saját sebességi állandókat ad. Bár valószínű, hogy további, fel nem oldott szerkezeti átrendeződések szükségesek a katalitikus maradékok összehangolásához a DNS hasításhoz, ezeket még nem oldottuk fel, mint kinetikailag különálló eseményeket. A jelenlegi modell egy minimális útvonalat képvisel, amely szükséges és elegendő az összes rendelkezésre álló adat figyelembevételéhez, és könnyen bővíthető, amint új információk állnak rendelkezésre az útvonal további lépéseinek meghatározásához.
a DNS és Mg2+ által kezdeményezett hasítás a HNH domén által. b DNS és Mg2+ által kezdeményezett hasítás a RuvC domén által. c R-hurok kialakulásának sebessége. d Mg2+ által kezdeményezett hasítás a HNH domén által. e Mg2+ által kezdeményezett hasítás a RuvC domén által. f DNS-csapda hatása a Cas9 hasításának kinetikai felosztására. Minden görbét a kinetikai modell szerinti globális illesztés alapján számoltunk az adatokra (betét), a sebességi állandók az 1. táblázatban láthatók. A hibabecslések a 6. ábrán látható bizalmi kontúrelemzésen alapultak. E a Cas9.gRNA, D a cél-DNS, ED a Cas9.gRNA.DNS, EDH az R-hurok képződés a célszál HNH-hoz való dokkolásával, EDHR és EDP1R az R-hurok képződés a nem célszál RuvC-hez való dokkolásával, EDHP2 a nem célszál RuvC hasítása, EDP1 a célszál HNH hasítása, EDP1P2 mindkét szál hasítása, Dtrap a felesleges, nem jelölt, tökéletesen illeszkedő DNS. EDtrap a Cas9.gRNA.DNAtrap.
A bizalmi kontúrok az 5. ábrán látható adatok illesztéséhez. A számozott sebességállandók a kinetikai modellünkben vannak meghatározva (5f. ábra, betét). A χ2 küszöbértéket (szaggatott vonal) 0,99-re állítottuk be az egyes sebességállandók felső és alsó határainak meghatározásához, a leírás szerint17,32. Mivel a kontúrok szimmetrikusak voltak a jól behatárolt paraméterekkel, az 1. táblázatban ± hibahatárokat közlünk. Ehhez az elemzéshez egy χ2 küszöbértéket számítottunk ki F-eloszlás segítségével, és azt használtuk az egyes paraméterek alsó és felső határértékeinek meghatározásához.
Az enzimspecificitás megértéséhez a sebességállandókat az összes kinetikailag releváns lépés összefüggésében kell értelmezni, amint azt a szabadenergia-profil (az egyenlet segítségével kiszámított) mutatja. (4) egyenlet alapján az 1. táblázatban szereplő sebességállandókból).
A transzmissziós együttható A = 0,001
Mivel a globális adatillesztés minden releváns lépéshez megadja a sebességállandókat (5. és 6. ábra), egy jóhiszemű szabadenergia-profilt állíthatunk össze (7b. ábra és 10-14. kiegészítő ábra). Az SpCas9, a HypaCas9 és a Cas9-HF1 szabadenergia-profilok összehasonlítása a sebességkorlátozó és a specificitást meghatározó lépések változását mutatja. Az enzimspecifikusságot a kcat/Km határozza meg, és a kiindulási állapothoz viszonyított legmagasabb általános gát adja, míg a maximális sebességet, a kcat-t, a megelőző állapothoz viszonyított legmagasabb helyi gát határozza meg, amelyet a megelőző gyors egyensúlyi lépések csillapítanak. Mivel az R-hurok kialakulásának sebességi állandói nem változnak jelentősen a különböző szubsztrátokkal és enzimváltozatokkal, a specificitást nagyrészt a Cas9 R-hurok kinetikai felosztása határozza meg, az EDH állapot a kinetikai modellünkben (5f. ábra, betét), amely vagy előre megy, ami irreverzibilis hasadást eredményez, vagy felszabadul a DNS újraegyesítésével és az enzimből való kilökődéssel. A nagy hűségű változatoknál megfigyelhető magasabb általános hasítási gátak növelik a kinetikai megoszlási valószínűséget a DNS disszociációjának javára (6c. ábra).
a A Cas9 enzim reakcióútjának karikatúraszerű ábrázolása. b Az SpCas9 célponton belüli hasításának szabadenergia-profiljai (szürke vonal) Gong et al. 15-től. és a célponton kívüli (piros vonal); a HypaCas9 hasítása egy célponton kívüli (kék vonal); és a Cas9-HF1 hasítása egy célponton kívüli (fekete vonal). Mindegyik profilt az átmeneti állapotelmélet segítségével számoltuk ki az egyes kísérletsorozatok globális illesztéséből származó sebesség- és egyensúlyi állandók felhasználásával (1. táblázat). Vegyük észre, hogy a DNS-hasítás magasabb gátja a megelőző fordított reakció alacsonyabb gátjához képest növeli a DNS-felszabadulás valószínűségét. c Összefoglaló oszlopdiagram a k2, k3 és a kinetikai megoszlás (P) számára.