Egyszerű kiegyensúlyozatlan transzlokációk és inverziók (A és C osztály): eredetmechanizmusok

A vizsgálat egyértelmű eredménye, hogy a 37 de novo kiegyensúlyozatlan transzlokáció közül 20-ban a duplikáció anyai eredetű (1. ábra, 1. online forrás: S2. táblázat). Mivel a szülői eredet vizsgálata hat esetben (7., 14., 23., 24., 33. és 35. eset) nem volt informatív vagy nem volt lehetséges, a teljesen informatív esetek 64,5%-át (20/31) teszik ki azok a de novo kiegyensúlyozatlan transzlokációk, ahol a duplikált régió anyai eredetű. Ezeket az adatokat azzal a megállapítással kombinálva, hogy nyolc ilyen esetben (1., 2., 9., 11., 15., 19., 28. és 32. eset) három allél (ábra. 1, Online Resource 1: S2. táblázat), két anyai és egy apai allél volt jelen legalább a duplikációs régió egy részében, a kialakuló forgatókönyv szerint nem kevesebb, mint 25%-ban (8 a 31-ből) a de novo kiegyensúlyozatlan transzlokációk előfordulásának elsődleges mozgatórugója az anyai meiotikus nem-diszjunkció, amelyet a szupernumeráris anyai kromoszóma részleges triszómia-mentése követ (1a. ábra). A duplikált régióban lévő három allél – két anyai és egy apai – jelenlétének legvalószínűbb magyarázata az anyai meiózis I. (mat-MI) nem-diszjunkció (1A.I. ábra). Alternatív megoldásként egy meiotikus rekombinációnak a transzlokációs törésponthoz közeli vagy annál a pontnál kellett megelőznie a nem-diszjunkciót az anyai meiózis II-ben (mat-MII). Ezzel szemben abban a 12 esetben (4-6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 és 37), ahol ugyanaz az anyai duplikált haplotípus volt, más mechanizmusok nem zárhatók ki (1b. ábra), bár ezek akár mat-MI nem-diszjunkcióból (1A.I. ábra), akár egy telomerikus kereszteződést követően, a telomerikus kereszteződések egyes nem-diszjunkciós kromoszómák esetében kimutatott preferenciális előfordulásának megfelelően (Oliver et al. 2014), vagy egy anyai MII (mat-MII) nem-diszjunkció (1A.II. ábra), amint arról számos triszómia-mentési esetben beszámoltak (áttekintés: Chantot-Bastaraud et al. 2017).

Az jól ismert, hogy a szupernumeráris kromoszóma anafázisban való lemaradása, majd egy mikronukleuszban való csapdába esése számos kromotripszis esemény alapját képezi (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). Ennek következtében az egyik leánysejtben a szupernumeráris kromoszóma eliminálódik, míg a másikban a mikronukleáris genomiális anyag összetörése, majd az összes vagy néhány töredék újbóli beágyazódása a főmagba az eredeti kromoszóma masszív átrendeződését eredményezheti, amely vagy megtartja anyagának nagy részét, bár új sorrendben átrendeződve, vagy elveszíti egyes részeit (ábra. 1a), az, hogy az eredeti számfeletti kromoszóma mely részei vesznek el és melyek maradnak meg, függhet a sztochasztikus eseményektől, attól, hogy a letört végek hajlamosak-e integrálódni egymással vagy a genom más részeivel, és/vagy a minimális szegmentális egyensúlytalanságok jelenlétében túlélni és szaporodni képes sejtek későbbi szelekciójától. Elméletileg a centrikus fragmentumok a gyűrűs kromoszómák kialakulásával járó cirkularizációjuk révén számfeletti markerkromoszómákként megmaradhatnak, így leküzdve a telomerikus szekvencia hiányát mindkét végén. A szupernumeráris interstitiális akcentrikus fragmentumok megőrzéséhez szükség van egy neocentroméra kialakulására is, vagy alternatívaként a fragmentum másik kromoszómával való befogására egy de novo inszerciós transzlokáció kialakulásával. Valóban, Kato és munkatársai (Kato et al. 2017) nemrégiben beszámoltak egy triszómikus zigótában jelen lévő szupernumeráris kromoszóma kromotripsziséből származó de novo intersticiális transzlokációról. Végül, az egyik végén telomerrel felszerelt szupernumeráris fragmentumok megőrzéséhez vagy telomer befogása szükséges, pl. egy transzlokálódott szupernumeráris markerkromoszóma, ahogy arról Vetro és munkatársai (2012) beszámoltak (2. és 3. eset), vagy annak befogása egy másik, a recipiens kromoszómával, amely elveszíti disztális részét, így egy 46 kromoszómás sejtet alkotva kiegyensúlyozatlan de novo transzlokációval, ahogy azt itt leírtuk. A 6. eset ugyanannak az anyai haplotípusnak a duplikációjával (1. ábra, 1. online forrás: S2. táblázat) valóban egy kromotripszis esemény bekövetkezését mutatja (1a. ábra), amint azt a két nem egybefüggő duplikált régió jelenléte mutatja, amelyeket ~ 1,3 Mb választ el egymástól, és amelyek közül az interstitialis invertált orientációjú (2. online forrás: S15. ábra). A kromotripszis eseményeket számos esetben megfigyelték de novo kiegyensúlyozatlan transzlokációkban (Weckselblatt és mtsai. 2015), és a legtöbbjük apai eredetű, és kétnál több kromoszómát érint (Marcozzi és mtsai. 2018). Ezzel szemben a mi 6. esetünkben a kiegyensúlyozatlan transzlokáció anyai eredetű és valóban de novo volt, összhangban a szülői metafázisok FISH-vizsgálataival. Ráadásul, legalábbis a nagy felbontású (1M) aCGH- és FISH-vizsgálatok alapján megítélve, csak két kromoszómát érintett, míg egy összetettebb átrendeződés kizárható volt. Ezért csábító a feltételezés, hogy a zigóta vagy a korai embrió a 8-as kromoszóma tekintetében triszomikus volt, vagy meiotikus, vagy posztzygotikus anyai nem-diszjunkció miatt. A szupernumeráris 8-as kromoszóma széttöredezését csak két nem összefüggő rész visszaszerzése követte, beleértve a telomerikus részt is, amelyet már visszavarrva a recipiens 18q szerzett meg (1a. ábra).

A de novo kiegyensúlyozatlan transzlokációk triszomikus zigótából kiinduló kialakulásának modellje a 24-es esetre is illik, bár semmilyen alátámasztó molekuláris vizsgálatot nem tudtunk végezni. A 9-es kromoszóma szempontjából triszomikus reziduális sejtvonal jelenléte azonban egy normál kariotípusú fő és egy kiegyensúlyozatlan t(14;9) transzlokációval rendelkező harmadik sejtvonallal együtt arra utal, hogy egy triszomikus zigótából kiindulva különböző sejtvonalak alakulhatnak ki, egyesek a szupernumeratív kromoszóma teljes elvesztésével, mások pedig egy részének (9p) elvesztésével és a maradék részének (a teljes 9q) egy másik kromoszómával való elfoglalásával. Ilyen típusú három sejtvonalas mozaikot ritkán dokumentáltak (Phillips és mtsai. 1997), de a prenatális diagnosztikában viszonylag gyakoriak az olyan mozaikok, amelyekben az egyik sejtvonal normális, a másik pedig de novo kiegyensúlyozatlan transzlokációval rendelkezik, és a legtöbb esetben megnövekedett anyai életkor mutatható ki (Kovaleva és Cotter 2017; Van Opstal és mtsai. 2018).

A megnövekedett anyai életkor független alátámasztása annak a hipotézisnek, hogy az anyai nem-diszjunkció a de novo kiegyensúlyozatlan transzlokációk fő kiváltó oka. Nyolc esetünkben (1., 2., 9., 11., 15., 19., 28. és 32. eset), ahol a duplikáció minden kétséget kizáróan anyai meiotikus nem-diszjunkcióhoz kapcsolódott (két különböző anyai allél a duplikációs régióban), valóban az anyai átlagéletkor növekedését dokumentáltuk (34,75 év, Online Resource 1: S1. táblázat), figyelembe véve, hogy Olaszországban 2016-ban az anyák átlagéletkora 31,8 év volt (ISTAT, https://www.istat.it/). Emelkedést (33,5 év) észleltek abban a 12 esetben is (4., 5., 6., 10., 12., 13., 17., 22., 26., 30., 34. és 37. eset), ahol ugyanazon anyai allél duplikálódott, ami összeegyeztethető az anyai nem-diszjunkcióval mint kezdeményező eseménnyel. Még azokban az esetekben is, ahol a duplikáció apai volt, az átlagos anyai életkor (32,6 év) növekedését mutatták ki, bár sokkal korlátozottabb mértékben, ami valószínűleg arra utal, hogy az anyai nem-diszjunkciótól eltérő mechanizmusok is szerepet játszhatnak e kiegyensúlyozatlan transzlokációk kialakulásában. Valóban, az SNP-táblázat segítségével elemzett négy esetben (3, 8, 29 és 36) nem volt jelen anyai hetero-izodiszómia a homológ kromoszómák nem-duplikált részén (Online Resource 1: S2. táblázat), ahogy azt egy olyan triszomikus zigóta esetében vártuk volna, amelyben a számfeletti apai kromoszóma kromotripszisen ment keresztül, és csak a telomerikus rész mentése történt meg. Így, figyelembe véve azt is, hogy az apai meiózisban a missegregációból származó triszómia gyakorisága elhanyagolható (Nagaoka et al. 2012), az apai eredetű triszomikus zigóta részleges triszomikus mentése által kiváltott kiegyensúlyozatlan transzlokációk előfordulása igen valószínűtlennek tűnik. Ehelyett más mechanizmusok, például egy öröklött vagy posztzygotikus kettősszálú apai törés, amelyet telomérbefogással kell javítani, sokkal valószínűbbnek tűnnek (1b. ábra). Valóban, a 25. eset, amely két, a vérben és a fibroblasztokban jelen lévő sejtvonal esetében mozaikos, egy terminális 2q delécióval és egy apai eredetű der(2)t(2q;14q) származékos kromoszómával (Online Resource 2:S9 ábra), illeszkedik ehhez a hipotézishez. Így a terminális deléció jelenlétében a korai embrió különböző sejtjeiben különböző időpontokban különböző javítási mechanizmusok léphetnek fel, ami végül mozaikos állapothoz vezet. Ebben a modellben a deletált kromoszóma kezdeményezi a transzlokációs eseményt, és recipiens kromoszómaként viselkedik, míg a duplikált a donor, és sérülésjavítóként működik (1b. ábra). Nem lehet azonban eldönteni, hogy a deléció valóban az első transzlokációhoz vezető esemény-e, vagy inkább másodlagos a dicentrikus kromoszóma kialakulásához képest (1BIII. és IV. ábra), amely aszimmetrikus szakadása következtében egy inv-duplikált del kromoszómát és egy egyszerűen deletáltat hoz létre, ez utóbbit aztán a telomér befogásával javítják (1b. ábra). Lehetséges, hogy a dicentrikus fennmaradása az első embrionális osztódásokon túl különböző méretű törést eredményez a különböző sejtekben, amelyet ismét vagy telomeráz vagy telomer-befogás javít.

Figyelemre méltó, hogy bármilyen mechanizmusról legyen is szó, nagy gyakorisággal észleltünk olyan eseteket, ahol mindkét egyensúlytalanság azonos szülői eredetű (1. ábra, Online Resource 1: S2 táblázat), annak ellenére, hogy a deléció és duplikáció biparentális eredete az esetek felében várható lenne, egy posztzygotikus végső esemény szerint. A két szülői kromoszómasorozat különálló kompartmentalizációjának kimutatása egérembriókban a 8-sejtes stádiumig (Du és mtsai. 2017) magyarázatot adhat erre. Mivel ez az időszak egybeesik a nagyon magas kromoszóma-instabilitással, (McCoy et al. 2017), csábító a feltételezés, hogy egy olyan mechanizmus, mint a telomerek befogása, amely egy korábbi strukturális rendellenesség stabilizálásához szükséges, az eredeti anomália ugyanazon szülői kromoszómakészletén történik. Ezzel szemben a további későbbi átrendeződések várhatóan véletlenszerűen történnek, mindkét szülői eredetű kromoszómát érintve, ami kiegyensúlyozatlan, biparentális eredetű transzlokált kromoszómához vezetne, ahogyan azt valóban öt esetben találtuk (10., 12., 27., 30. és 31. eset; 1. ábra, Online Resource 1: S2. táblázat).

A C osztályú átrendeződések esetében nem találtunk olyan sajátosságot a csomóponti töréspontoknál, amely tisztázhatná, hogy a törölt kromoszóma résszel ellentétes kromoszómaszakasz telomerbefogása általi stabilizációjuk más mechanizmusnak köszönhető-e, mint azokban az esetekben, amikor a telomerbefogás egy másik kromoszómától függ. Ezt az elemzést azonban csak két esetben lehetett elvégezni. Az a megállapítás, hogy az 5 esetből 4 esetben mind a deléció, mind a duplikáció apai eredetű volt, arra utal, hogy vagy eredeti delécióból, vagy egy dicentrikus kromoszóma töréséből származnak.

Komplex kiegyensúlyozatlan transzlokációk és inverziók (B és D osztály)

Általános egyetértés van abban, hogy ezek az átrendeződések egy köztes dicentrikus, annak aszimmetrikus törése után egy inv-dup del és egy egyszerűen deletált kromoszómát eredményeznek (1B.III. ábra). A stabilizáló telomer szekvencia megszerzése többféle módon történhet: telomeráz közvetítésével de novo TTAGGGG szekvenciák hozzáadása, egy másik kromoszóma disztális részének (Yu és Graf 2010) vagy ugyanazon kromoszóma ellentétes részének telomer befogása (Buysse et al. 2009; Fan és Siu et al. 2001), vagy akár egy gyűrűs kromoszóma kialakulása (Rossi et al. 2008). A két transzlokált inv-dup del(8p) eset, amelyet genotipizálni tudtunk (42. és 44. eset), a várakozásoknak megfelelően (Giglio és mtsai. 2001) a mat-MI-nél NAHR által keletkezett, amint azt a 8p duplikációs régióban két anyai és egy apai allél jelenléte mutatja (Online Resource 1: S2. táblázat). Ezt a visszatérő abnormális rekombinációt a 8p23-ban található, nagymértékben azonos szegmentális duplikációk közvetítik, amelyek egy normál és egy invertált 8-as kromoszómán belül helyezkednek el (Giglio és mtsai. 2001). A zigótában a keletkező dicentrikus kromoszóma valószínűleg különböző törési eseményeken megy keresztül a különböző sejtekben, ami valamikor mozaikos állapotot eredményez egy del(8p) és egy második inv-dup del(8p) sejtvonallal (Hand et al. 2010), vagy kivételes esetekben akár egy harmadikat is, ahol az inv-dup del(8p) egy másik kromoszóma disztális régiójával végződik (Pramparo 2004). Ezek a mozaikok gyakrabban mutathatók ki a prenatális diagnosztika során, míg a posztnatális életben az inv-dup del(8p) transzlokációval vagy anélkül rendelkező egyetlen sejtvonal a leggyakoribb lelet, legalábbis a vérben. Három transzlokált esetünkben (42., 43. és 44. eset) a telomereket 6q, 17p, illetve Xq adományozta, mind anyai eredetűek voltak, és az anyai 6, 17 és X kromoszómák azonos duplikációs haplotípusával, ahogy az egy posztzygotikusan bekövetkezett stabilizációs eseménynél várható. A fennmaradó három esetben (39., 40. és 45. eset), amelyek, mint az összes, a 8p-t nem érintő inv-dup del átrendeződés, nem rekurrensek, a transzlokált inv-dup apai eredetű volt, a duplikációs régió azonos apai alléljaival, míg a telomer befogását két esetben apai eredetű kromoszóma biztosította (39. és 49. eset, Online Resource 2: A harmadik esetben (45. eset), egy olyan magzat esetében, amelyben a t(inv-dup5p;3q) transzlokált kromoszóma mozaikos volt egy nem transzlokált inv-dup del(5p)-t tartalmazó sejtvonallal (Online Resource 2: S12 ábra). Figyelemre méltó, hogy az 5p duplikáció különböző méretű a két sejtvonalban (Online Resource 1: S1 táblázat), ami valóban azt mutatja, hogy az eredeti dicentrikus kromoszóma feltehetően már a zigótában vagy a nagyon korai embrióban jelen volt (ábra). 1b), különböző töréseken ment keresztül a különböző sejtekben, a hasadási stádiumú embrión túl.

Identikus duplikált allélokat jelentettek jóhiszeműen az összes, a 8p-t nem érintő inv-dup del átrendeződésben, ami ezen átrendeződések intrakromoszómális eredetére utal (Hermetz et al. 2014). Ennek megfelelően úgy tűnik, hogy ezek az inv-dup transzlokált átrendeződések egy kezdeti mitotikus esemény végeredményei, valószínűleg a korai embrióban (Voet 2011), mint például egy kettősszál-törés, amelyet az invertált homológ szekvenciák viszonylag közeli helyein intrasztrális párosodás követ, ami a dicentrikus kromoszóma létrejöttéhez vezet egy közbeiktatott normál kópiájú régióval (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Mint már említettük, az inv-dup del reciprok terméke, azaz egy deletált kromoszóma javítható és stabilizálható egy nem-homológ kromoszóma disztális részének vagy ugyanannak a kromoszómának az ellentétes karjának befogásával, ami egy egyszerű kiegyensúlyozatlan transzlokációt vagy inverziót eredményez, ahogyan azt az A és C osztályban felsorolt átrendeződések némelyikére javasoljuk (ábra). 1b).

Törésponti csomópontok

A törésponti transzlokációs csomópontok szekvenálását 26 esetben sikerült elvégezni (Online forrás 1: S1 táblázat, Online forrás 2: S1 ábra), bár 4 esetben a rejtélyes összetettség (4., 10., 28. és 51. eset) akadályozta a finom szekvenálást. Alternatív nem-homológ végcsatlakozás (alt-NHEJ) vagy mikrohomológia-mediált törés-indukált replikáció (MMBIR) jellemzőit, például mikrohomológiákat és sablonos vagy nem sablonos kis inszerciókat 16 esetben (3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 és 52 eset) észleltünk (Online forrás 2: S1 ábra). Figyelemre méltó, hogy bár a 18. és a 40. esetben az átrendeződés Alu-szekvenciákon belül történt, az 5 bp rövid templated insertion és a 4 bp mikrohomológia jelenléte azt mutatta, hogy az átrendeződés nem NAHR által közvetített mechanizmussal, hanem inkább alt-NHEJ vagy MMBIR révén valósult meg. Négy esetben (26., 29., 31. és 43. eset) kanonikus NHEJ (c-NHEJ, tompa végű csomópontok) fordult elő. A 2. és a 38. esetben a töréspont-összeköttetések, a homológ retrotranszpozon szélén voltak (Online Resource 2: S13 ábra). Ez a megállapítás arra utal, hogy az esetek egy kisebb részében a javítási mechanizmusokat, például a telomer befogását megkönnyítik ezek a szekvenciák. Bár Robberecht és munkatársai úgy találták, hogy a legtöbb de novo kiegyensúlyozatlan transzlokációjukat a LINE-ok, HERV-ek vagy szegmentális duplikációk közötti NAHR közvetítette (Robberecht et al. 2013, kizárhatjuk a NAHR eseményt legalább a 2. esetben, ahol a két duplikált anyai haplotípus jelenléte, amelyek közül az egyik transzlokálódott a recipiens kromoszómára, egyértelműen mat-MI nem-diszjunkcióra utal (1. ábra, Online Resource 1: S2 táblázat), így a transzlokációt nem lehet meiotikus eseménynek tulajdonítani. Valóban, LINE-1-mediált retrotranszpozíciós eseményeket mutattak ki a korai humán embrió szomatikus sejtjeiben, humán embrionális őssejtekben, és legalábbis egerekben elsősorban az embriogenezisben (áttekintésért Kazazian és Moran 2017), ami alátámasztja, hogy a mi esetünkben a transzlokáció kialakulása is posztsejgotikus esemény volt.

Ezek a jellemzők együttesen arra utalnak, hogy a donor kromoszóma és a recipiens kromoszóma, illetve ugyanazon kromoszóma ellentétes szakaszának összekapcsolódásáért javításon alapuló mechanizmusok (c-NHEJ és alt-NHEJ) és replikatív javítási mechanizmusok (MMBIR) felelősek (1. ábra).

Genotípus-fenotípus kapcsolat

Bár a genotípus-fenotípus korrelációk nagyméretű kiegyensúlyozatlan átrendeződések esetén, mint amilyenekről tanulmányunkban beszámoltunk, általában meglehetősen durvák, az általunk közölt adatok ebben az összefüggésben is további részleteket adnak hozzá.

Az erős bizonyíték arra, hogy egyes kiegyensúlyozatlan transzlokációk olyan zigótából származnak, amelyben egy számfeletti kromoszóma kromotripciós eseményen megy keresztül, arra utal, hogy a duplikációs régió, bár látszólag csak a kromotripciós kromoszóma disztális régiójából áll, tartalmazhat más részekből származó fragmentumokat is, ahogyan ez a mi 6. esetünk esetében is történt, és ahogyan azt Weckselblatt és munkatársai (2015) kimutatták. Ezekben az esetekben, ha a töredékdarabok mérete kisebb, mint az array CGH-val kimutatható, fennáll a veszélye annak, hogy az abnormális fenotípust csak a duplikáltnak vagy deletáltnak tűnő géneknek tulajdonítjuk, miközben a további megbetegedések a TAD-bontás által generált abnormális génexpressziónak tudhatók be (Fukami et al. 2017).

A részleges triszómia mentésből származó kiegyensúlyozatlan transzlokációkban továbbá, ha a kromotripszis az apai eredetű szupernumeráris kromoszómán történne, az ezt követő anyai hetero/izodiszómia a fennmaradó két kromoszómára további patogenitást generálhat (Niida et al. 2018) akár azáltal, hogy az anyában heterozigóta állapotban jelen lévő betegséget okozó variánsok homozigóta állapotba redukálódnak, akár az imprintált gének jelenléte miatt, amelyeket csak az apai allél fejez ki.

Végső gondolatként csábító az a feltételezés, hogy annak kiválasztása, hogy melyik telomert ragadják meg a megtört kromoszóma stabilizálásához, talán nem véletlenszerű, hanem az eredeti TAD-ok (Topologically Associated Domains) deregulációja befolyásolja, ami viszont kedvező szubsztrátumot teremt a specifikus kromoszómák közötti kapcsolatok és a térbeli 3D kromatin kompartmentalizáció számára (Dekker és Mirny et al. 2016).