PARADIGMÁK A CD40-CD40L INTERAKCIÓK SZEREPE A BETEGSÉGEKBEN

Transzplantáció. A transzplantációs sebészet nem érhette volna el az elmúlt évtizedekben tapasztalt sikert a hatékony immunszuppresszív szerek kifejlesztése nélkül, amelyek minimalizálják a transzplantáció kilökődésének kockázatát. A CD40L elleni monoklonális antitestet (MAb) immunszuppresszív kezelésként számos állati transzplantációs modellben alkalmazták. Főemlősökben az anti-CD40L MAb adása késlelteti az allograft transzplantáció kilökődését, míg a CTLA4Ig-gel, a CTLA-4 sejtfelszíni molekula extracelluláris doménjéből és a humán IgG1 Fc régiójából álló, a CD28-B7 útvonalat blokkoló kiméra fehérjével való kombináció additív és szinergista hatást fejt ki. Ez a kombinált kezelés fenntartja a veseallograft túlélését főemlősökben és növeli a bőrgraft túlélését egerekben (53, 69). Az anti-CD40L MAb terápiára való áttérés 60 napos CsA-val történő hagyományos immunszuppresszió után hatékony kezelés volt egy veseallograft modellben majmoknál, annak ellenére, hogy a CsA köztudottan lefelé szabályozza a CD40L expresszióját a T-sejteken (7). Kimutatták, hogy a CD40L génexpresszió négyszeresére nő akut kilökődés esetén. Ez noninvazív módszerként szolgálhat az allograft funkció monitorozására, valamint a klasszikus immunszuppresszív szerekre, például a CsA-ra és a takrolimuszra adott biológiai válasz meghatározására, amelyekről ismert, hogy gátolják a CD40L indukcióját (54). Állati transzplantációs modellekben a kalcineurin-inhibitorok elnyomják a CD40L expresszióját a T-sejteken in vitro, de nem a nyirokszövetben, ami arra utal, hogy a CD40-CD40L útvonal működőképes marad az ilyen szerekkel való kezelés alatt, ami klinikai környezetben hozzájárulhat az allograft kilökődéséhez (63).

Atherosclerosis. Az ateroszklerózisról, a nyugati világ legelterjedtebb halálos kimenetelű betegségéről a jelenlegi felfogás szerint egy krónikus, degeneratív, gyulladásos betegségről van szó, amelyben az immunrendszernek feltételezhetően fontos szerepe van. A CD40 és a CD40L túlreprezentált a kísérletes és humán ateroszklerotikus elváltozásokban. A CD40 ligálása az ateróma-asszociált sejttípusokon, például az endotélsejteken, a simaizomsejteken és a makrofágokon az ateroszklerózis kialakulását elősegítő mediátorok, például citokinek, kemokinek, növekedési faktorok és metalloproteinázok fokozott expressziójához vezet. A CD40-CD40L kölcsönhatások anti-CD40L MAb-vel történő blokkolása egerekben az egér ateróma kialakulásának és progressziójának csökkenését eredményezi, ugyanakkor elősegíti az elváltozás biológiájában és szerkezetében bekövetkező olyan változásokat, amelyek fontosak lehetnek a plakk stabilizálásában a humán betegségben (52).

A vérlemezkék is kifejezik a CD40L-t, és feltételezhetően in vivo jelentősen hozzájárulnak a gyulladásos sejteknek a sérült endotheliumba történő toborzásához (5). A CD40L-t expresszáló aktivált T-sejtek az ateroszklerotikus érfalon belül találhatók, ami alátámasztja azt a hipotézist, hogy az aktivált CD4+ T-sejtek irányíthatják az ateroszklerotikus folyamatot (43).

Az 1. táblázat röviden ismerteti azokat a betegségeket, amelyekben a CD40-CD40L páros szerepet játszhat. Az alábbiakban röviden tárgyaljuk e kölcsönhatás szerepét a szisztémás lupus erythematosus (SLE), a rheumatoid arthritis (RA) és a polymyositis autoimmun betegségekben.

SLE. (i) CD40L expresszió humán SLE-ben (2. táblázat). Desai-Mehta és munkatársai arról számoltak be, hogy az aktív lupusos betegekből származó perifériás vér mononukleáris sejtjei (PBMC) 21-szeres növekedést mutatnak a CD40L+ CD4+ sejtek arányában az egészséges személyekhez képest. A PBMC anti-CD3 MAb-val történő további stimulálásakor a CD40L+ CD4+ sejtek aránya az egészséges személyeknél ötszörösére nőtt, de az aktív SLE-s betegeknél csak 1,4-szeresére. A CD40L+ T-sejtek aránya azonban még mindig magasabb maradt az aktív-SLE-s csoportban. A remisszióban lévő SLE-s betegek PBMC-je hasonlóan viselkedett, mint a kontrollcsoporté. Hasonló megfigyeléseket tettünk az aktív-SLE-s betegekből frissen izolált CD8+ T-sejtek CD40L-expressziójával kapcsolatban (22-szer magasabb expresszió, mint a kontrollcsoportban). A B-sejtek az aktív-SLE-s betegeknél a CD40L-t az aktivált T-sejteknél megfigyelt szintekhez hasonló mértékben túlreprezentálják. A normál humán B-sejtek nagyon alacsony szinten expresszálják a CD40L-t, és csak akkor, ha manipulálják őket, ellentétben az aktív-SLE B-sejtekkel, amelyek spontán módon expresszálják a CD40L-t (12).

A Koshy és munkatársai által publikált vizsgálatban az egészséges alanyoktól vagy a betegséget kontrolláló betegektől származó aktivált PBMC nagy intenzitású CD40L-expressziót mutatott, amely 48 órára fokozatosan csökkent a kiindulási értékek közelébe, míg a lupusos PBMC továbbra is szignifikánsan magasabb CD40L-szintet mutatott ebben az időpontban. Ebben a vizsgálatban nem találtak nyilvánvaló korrelációt a CD40L expresszió és a betegség aktivitása között (33).

Higuchi és munkatársai megerősítették ezeket az eredményeket mind az SLE, mind az egér lupus esetében, ami arra utal, hogy a lupus B-sejtek ektopikus CD40L-expressziója döntő szerepet játszhat az SLE kialakulásában. A B-sejteken CD40L-t expresszáló transzgenikus lupuszra hajlamos egerek spontán autoantitesteket termelnek, ráadásul ezen egerek felénél immunkomplex lerakódással járó glomerulonefritisz alakul ki (22). Devi és munkatársai szintén megerősítették a CD40L magas expresszióját a T- és B lupus sejteken. Pontosabban, az SLE-betegek T-sejtjeinek 45%-a expresszálja a CD40L-t, szemben az egészséges személyek vagy RA-betegek T-sejtjeinek mindössze 8-18%-ával. Sőt, a vizsgált 48 SLE-beteg 30%-ának a B-sejteken is fokozottan kifejeződött a CD40L (13). A fenti eredményekkel ellentétben azonban van egy beszámoló, amelyben nem találtak változást a CD40L expressziójában a lupusos limfocitákban. Ehelyett ezek a szerzők a CD86 magas expressziójáról számoltak be az SLE B-sejteken, amely szintén egy fontos kosztimulátor molekula (3). Egy másik tanulmány arról számolt be, hogy az aktív SLE-ben szenvedő betegek monocitái rendellenesen expresszálják a CD40L-t. Huszonhárom aktív SLE-s beteget vizsgáltak, és 16 egészséges egyénnel hasonlították össze. Az eredmények hétszeres növekedést mutattak az SLE-s betegekből származó CD40L-t expresszáló perifériás monociták gyakoriságában az egészséges személyekhez képest. A CD40L expresszióját mRNS- és fehérjeszinten is igazolták, és szignifikánsan korrelált a betegség aktivitásával (28).

A CD40L-t egy mátrix metalloproteináz hasítja le az aktivált T-sejtek sejtfelszínéről, felszabadítva az sCD40L-t, egy körülbelül 18-20 kDa méretű molekulát, amely homotrimereket alkot. Az sCD40L funkcionális szerepét vizsgáló jelentés arra a következtetésre jutott, hogy az sCD40L képes a B-sejtek aktiválódását és differenciálódását indukálni. A plazma sCD40L-szintje szignifikánsan magasabb volt az aktív SLE-s betegeknél, mint az egészséges donoroknál. Ezek a szintek korreláltak a SLEDAI-val értékelt betegségaktivitással és a keringő kettősszálú DNS-ellenes (dsDNS) autoantitest-titerrel. Feltételezték, hogy az aktív-SLE-s betegeknél talált magas sCD40L-szintek patogén szerepet játszhatnak a vasculitisben és az aktív lupusban előforduló nephritisben. A szerzők azt javasolták, hogy az sCD40L-szintek a jövőben az SLE-betegség fellángolásának prediktív markereként szolgálhatnak (27). Vakkalanka és munkatársai szintén szignifikánsan magasabb átlagos sCD40L-koncentrációt mutattak ki lupuszos betegeknél, mint a betegséggel kontrolláltaknál és az egészségeseknél. Pontosabban 66 SLE-s beteget vizsgáltak és hasonlítottak össze 30 betegségkontroll-beteggel és 23 egészséges személlyel. Az egészséges személyeknél az sCD40L szinte kimutathatatlan volt, míg 38 SLE-s betegnél az sCD40L szintje 2 ng/ml felett volt (az átlagos koncentráció 2,61 ± 2,15 ng/ml volt), és csak 7 betegségkontroll-betegnél volt 1 ng/ml feletti sCD40l-szint. A betegeket a klinikai manifesztációk alapján három csoportba osztották, súlyos, mérsékelt és enyhe csoportba. A súlyos SLE-s betegek sCD40L átlagkoncentrációja 3,93 ± 2,86 ng/ml volt, a mérsékelt SLE-s betegek sCD40L átlagkoncentrációja 2,81 ± 1,57 ng/ml, végül az enyhe betegségben szenvedők sCD40L átlagkoncentrációja 1,52 ± 1 volt.06 ng/ml, ami összefüggést jelez az sCD40L szintje és a betegség aktivitása között (62).

Míg a CD40L indukciója az aktivált normál T-sejteken CsA jelenlétében gátolt, érdekes, hogy ez a hatás nem érvényesül az SLE T-sejtekre. A CD40L expressziójának vizsgálata humán lupusban arra a következtetésre jutott, hogy a CsA nem gátolta az anti-CD3 MAb-aktivált lupus T-sejteken in vitro megfigyelt elhúzódó és fokozott CD40L-expressziót. A CsA-val szembeni rezisztencia független volt a betegség aktivitásától. A keringő lupus-monociták is kiemelkedő rezisztenciát mutatnak a CsA CD40L-expresszióra gyakorolt gátló hatásával szemben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CD40L indukcióját az SLE T-sejteken egy kalcium/kalcineurin-független útvonal szabályozhatja (29).

Nem világos, hogy miért magasabb a CD40L expressziója az SLE-s betegekben, és hogy ennek a túlterjedésnek van-e patogenetikai jelentősége. Azt javasolták, hogy az SLE T-limfociták, amikor TCR-befogadással aktiválódnak, a kiegyensúlyozott NFAT-AP-1 transzkripciós faktor profil helyett NFAT-domináns profilt részesítenek előnyben. Az intracelluláris mediátorok ezen panelje elősegíti bizonyos gének, köztük a CD40L gén transzkripcióját és mRNS-stabilitását. A CD40L korai expressziója az SLE T-sejteken a CsA-érzékeny NFAT útvonalat igényli, de az elhúzódó expresszió inkább egy specifikus MAP-kináztól, azaz az extracelluláris jel-szabályozott kináztól függ. Az extracelluláris jel-szabályozott kináz fokozott és tartós aktivitása a lupusos T-sejtekben hozzájárulhat a CD40L overexpressziójához az AP-1 transzkripciós faktor aktiválásán keresztül és valószínűleg a CD40L mRNS stabilizálásával (10, 68). A citoplazmatikus Ca2+-áramlás szupranormális az SLE-s betegek keringő T- és B-sejtjeiben, és felvetették, hogy ez a rendellenesség jelentheti a lupusban a CD40L kóros expressziójának molekuláris hátterét (38, 40, 64). Arra is van bizonyíték, hogy a TCR ζ lánc hiányossága, amelyet SLE-s betegeknél leírtak, részben felelős lehet a fent említett szupranormális Ca2+ válaszért (39, 61). Ezt az összefüggést erősíti az a közelmúltban megjelent jelentés, miszerint a TCR ζ lánc hiányának transzfekcionális korrekciója lupusos T-sejtekben a citoplazmatikus Ca2+-áramlás normalizálódásához vezet (48).

(ii) Az anti-CD40L MAb alkalmazása lupus modellekben és SLE-ben. A CD40/CD40L többszörös funkciója az immunválaszban vonzó célpontjává tette az autoimmun betegségek terápiás beavatkozásának. A CD40L elleni MAbokat kezdetben egér lupus modellekben tesztelték. Az új-zélandi fekete × új-zélandi fehér (NZB×NZW) F1 egerek folyamatos CD40L-ellenes MAb-infúzióval történő kezelése a betegség kezdetének átlagosan 4 hónapos késleltetését, az IgG anti-dsDNS autoantitestek szintjének csökkenését, az aktivált memóriafenotípust hordozó T-sejtek felhalmozódásának késleltetését, a B-sejtek számának csökkenését a lépben, valamint az Ig-osztályváltás és a szomatikus mutációk elnyomását eredményezte. Az IgG anti-dsDNS-antitestek szérumszintje 4-szer-tízszer alacsonyabb volt, mint a kezeletlen, korban hozzáillő kontrolloké. A kezelés abbahagyása után a kezelt egerek T-sejt-fenotípusa megkülönböztethetetlenné vált a kontrollokétól, a B-sejtek pedig teljesen aktivált fenotípust értek el az IgG anti-dsDNS-titerek emelkedésével, proteinuria és progresszív vesebetegség kialakulásával (65).

Egy másik vizsgálatban anti-CD40L antitest és CTLA4Ig kombinációs kezelését alkalmazták. Az NZB×NZW F1 prenephritikus egerek rövid távú kombinációs kezelése a vesediszfunkció késleltetett kialakulását eredményezte körülbelül 6 hónapig. A proteinuria kialakulása után a kezelés megismétlése a korábban kezelt egereknél remissziót idézett elő, de a korábban nem kezelt egereknél nem. Csökkent az IgG anti-dsDNS autoantitestek szintje, és az egerek lépében még 16-20 héttel az infúzió után is jelentősen megfogyatkoztak a B-sejtek. Feltételezték, hogy a CTLA4Ig és az anti-CD40L MAb kezelés szinergikusan blokkolhatja az antiapoptotikus jeleket, és ezáltal elősegítheti a B-sejtek apoptózisát a korai B-sejt-aktiváció során. Ez a kezelés nem okozott hosszú távú globális immunszuppressziót (66).

A kísérletes állatkísérletekben kapott ígéretes eredményeket SLE-ben nem sikerült megerősíteni. Humán lupusban a ciklofoszfamid továbbra is az “arany standard ” a nagyobb szervi érintettség kezelésében. A ciklofoszfamid egy alkiláló szer, amely az immunválasz nem specifikus gátlását és klinikailag jelentős immunszupressziót okoz. Jelentős mellékhatásai vannak, beleértve a hólyagrákot és a gonádok elégtelenségét, így új terápiás beavatkozásokra van szükség. A ciklofoszfamid adása a lupus nephritis, az SLE gyakori és félelmetes szövődményének, valamint a morbiditás és mortalitás egyik vezető okának bevett kezelése.

Az anti-CD40L MAb adásával kapcsolatban két tanulmányt publikáltak humán lupusban. Az elsőbe, egy 2. fázisú, kettős vak, placebokontrollos, multicentrikus vizsgálatba 85 enyhe vagy közepesen aktív SLE-ben szenvedő beteget vontak be, akik 16 héten keresztül 6 injekciót kaptak IDEC-1 (anti-CD40L MAb) vagy placebót. A hatékonyságot a 20. héten értékelték, elsősorban a SLEDAI segítségével. Az eredmények azt mutatták, hogy az IDEC-1 kezelés biztonságos és jól tolerálható volt, de a placebóhoz képest nem bizonyult hatásosnak (19, 26).

A második vizsgálatban BG9588 (anti-CD40L MAb) alkalmazásával biopsziával igazolt proliferatív lupus nephritisben szenvedő betegeket vizsgáltak. Huszonnyolc aktív proliferatív lupus nephritisben szenvedő beteget vontak be, akik az első három adagban kéthetente, majd további négy adagban havonta 20 mg BG9588/testsúlykilogrammot kaptak. Az eredmények a proteinuria 50%-os csökkenését mutatták (ahol volt) a vesefunkció romlása nélkül, a hematuria eltűnését és a szérum C3-koncentráció emelkedését. A dsDNS-ellenes autoantitest-titerek a terápiát követően csökkentek, átlagosan 38,8, 50,1 és 25,3%-kal a kezelést követő 1, 2, illetve 3 hónapban (4). Ezt a vizsgálatot tromboembóliás szövődmények miatt idő előtt befejezték. Pontosabban két esetben számoltak be szívinfarktusról. Az ezt a kezelési sémát megnehezítő trombotikus hatások fontos kérdéseket vetettek fel a jövőbeli, embereken végzett vizsgálatokkal kapcsolatban. Meg kell jegyezni, hogy a trombotikus eseményt elszenvedő betegek egyike sem rendelkezett kimutatható antifoszfolipid antitestekkel. A CD40-CD40L kölcsönhatás szerepe ezekben a trombotikus szövődményekben továbbra is tisztázatlan és hipotetikus.

Egy 5 lupus nephritisben szenvedő, anti-CD40L terápiában részesülő beteggel végzett vizsgálat kimutatta, hogy rövid kezelés hatására csökken az IgG anti-DNS antitesteket termelő B-sejtek száma. Ezek a változások a kezelés abbahagyása után több hónapig fennmaradtak (25). Egy hasonló vizsgálat négy aktív lupus nephritisben szenvedő, anti-CD40L-kezelésben (BG9588) részesülő betegnél kimutatta, hogy a B-sejt-differenciálódási markereknek tekintett CD38-, CD5- és CD27-expresszáló B-sejtek eltűntek a perifériáról az anti-CD40L-kezelés során. Ezek a változások az anti-dsDNS antitestek szintjének, a proteinuriának és az SLE betegségaktivitási indexének csökkenésével jártak együtt (20).

RA. (i) CD40L expresszió RA-ban (2. táblázat). Az RA egy gyakori autoimmun szisztémás reumás betegség, amelyet krónikus szövetdestruktív folyamat jellemez, amely egy lehetséges folyamatos antigénvezérelt immunválasznak tulajdonítható. Mivel az aktivált T-sejtek feltehetően kulcsszerepet játszanak, nem meglepő, hogy a CD40-CD40L kölcsönhatásokat RA kapcsán is tanulmányozták.

Berner és munkatársai vizsgálták a CD40L expresszióját RA-s betegek T-sejtjein. Hatvankét RA-s beteget és 20 egészséges személyt vizsgáltak. A CD40L erősen kifejeződött a T-sejtek >10%-án az RA-s betegek 29%-án, de az egészséges kontrollok T-sejtjeinek 0%-án. A >10% CD4+ CD40L+ T-sejtekkel rendelkező RA-s betegeknél aktívabb volt a betegség. Az ebbe a csoportba tartozó betegek 83%-ának emelkedett a C-reaktív fehérje szintje, 89%-uk reumatoid faktor (RF) pozitív volt, és egyikük sem felelt meg a teljes klinikai remisszióra vonatkozó American College of Rheumatology kritériumainak, ami erős korrelációra utal a betegség aktivitása és a CD40L expressziója között (2). A magas szintű CD40L-expresszió a limfociták fokozott és elhúzódó aktivációját tükrözheti, ami fokozott és elhúzódó gyulladásos aktivitást eredményez. A funkcionális CD40L magas szintű expresszióját RA-s betegek T-sejtjein MacDonald és munkatársai is kimutatták (42).

Egy másik vizsgálat a CD40-CD40L jelátvitel szerepével foglalkozott a RF-termelésben. Az egészséges immunrendszerben a nagy affinitású autoreaktív B-sejtek törlődnek. Egészséges egyénekben alacsony affinitású RF-termelő B-sejtek vannak a nyirokcsomókban, de a magas affinitású RF nem kimutatható. RA-ban a nagy affinitású RF-termelő B-sejtek a gyulladt synoviában halmozódnak fel. E vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az aktivált T-sejteken lévő CD40L és az RF-termelő B-sejteken lévő CD40 közötti kölcsönhatás nemcsak ezen autoreaktív B-sejtek túlélése, hanem az RF-szintézis szempontjából is döntő fontosságú. A nagy affinitású RF-szintézis in vivo indukciójához szükséges és elégséges két jelnek az IgG és a CD40-CD40L kölcsönhatást találtuk. A CD40-CD40L kölcsönhatás hiányában az RF B-sejtek törlődtek (35).

Cho és munkatársai a CD40-CD40L kölcsönhatás szerepét vizsgálták a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) termelésében. RA-ban a gyulladt synovia tumorszerű tulajdonságokkal rendelkezik. A rheumatoid pannus fennmaradása és terjeszkedése a neovaszkularizációtól függ, mivel a mononukleáris sejtek kiterjedt vándorlása a synoviába és a pannus túlburjánzása a gazdag érágy meglététől függ. A VEGF, egy heparinkötő dimer glikoprotein, az angiogenezis központi közvetítője, amely az endotélsejtek proliferációját és a kapillárisok permeabilitását indukálja. Kimutatták, hogy a CD40 ligálása a synovialis fibroblasztokon a CD40L által az aktivált T-sejteken a VEGF fokozott termelését eredményezte, amely tovább fokozódik IL-1, TNF-α és transzformáló növekedési faktor β jelenlétében (8). Az RA synoviocytákon lévő CD40-nek a CD40L által a synovián belüli aktivált T-sejteken történő ligálása jelentősen növeli a TNF-α termelését dózisfüggő módon (21). A TNF-α kulcsfontosságú citokin az RA patogenezisében. A TNF-α mellett az IL-10 termelése is fokozódik a CD40-CD40L kölcsönhatások révén (15). Az RA-s betegekből származó synovialis folyadék T-sejtjei magas CD40L-szintet expresszálnak az egészséges donorok perifériás véréből származó T-sejtekhez képest, és in vitro aktiválást követően a CD40L hosszan tartó, magas szintű expresszióját mutatják. Az eredmények azt mutatták, hogy az RA-betegekből származó synovialis folyadék T-sejtjeinek 8,71%-a CD40L+, szemben a kontrollcsoport 1,74%-ával (41). A CD40-CD40L kölcsönhatás lehetséges szerepe az RA patogenezisében vezetett az e tengely farmakológiai manipulációjára irányuló erőfeszítésekhez, mint terápiás megközelítésre az RA-s betegeknél.

(ii) Az anti-CD40L MAb alkalmazása az RA állatmodelljeiben. Az anti-CD40L MAb-val történő kezelés elnyomja a kollagén-indukált artritisz kialakulását, amely az RA egyik állatmodellje. Pontosabban, az ízületi gyulladás kialakulását blokkolták, és csökkent a gyulladásos sejtek beszivárgása a szubszinoviális szövetekbe, valamint a porcleválás (14). K/B×N transzgenikus egerekben, az Ig-mediált artritisz modelljében az anti-CD40L MAb kezelés jelentősen csökkentette az artritisz kialakulását, ha egy héttel a klinikailag nyilvánvaló betegség megjelenése előtt adták, de a kezelés sikertelen volt, ha már kialakult betegségben adták (36).

Dermatomyositis/polymyositis. Egy vizsgálatban, amelyben 9 polymyositisben és dermatomyositisben szenvedő beteget elemeztek, megfigyelték, hogy az izomba beszűrődő T-sejtek mind a 9 esetben CD40L+ voltak, ami a CD40-CD40L kölcsönhatások lehetséges szerepére utal a fenti klinikai entitásokban (58).