- Abstract
- 1. Bevezetés
- 2. A mikrolencsés immunvizsgálat elve
- 3. A mikroszemcsés immunvizsgálati eszköz felépítése és funkciói
- 3.1. Párhuzamos fénysugárzó rendszer
- 3.2. A párhuzamos fényt a lencse veszi fel. Nagy felbontású autofókuszos képalkotó rendszer
- 3.3. Automatikus intelligens képfelismerő és elemző rendszer
- 3,4. Hőmérséklet-szabályozó rendszer
- 3.5. Mikrolencse tesztlemez
- 4. Az immunmikrogömb képalkotó rendszer alkalmazása
- 4.1. Az immunmikrogömb képalkotó rendszer 4.1. A mikrogömb-lemez alkalmazása. Az antigén-antitest reakció mérése
- 4.2. Az alábbi táblázatban szereplő adatok a következők. Klinikai minták mérése
- 5 . Az immunmikroszférás képalkotás megvalósíthatósága antigén és antitest kimutatására
- 6. Következtetések
- Érdekütközések
- A szerzők hozzájárulása
- Köszönet
- Köszönet
Abstract
Az antigén-antitest reakció kimutatása és elemzése az egyik legkritikusabb kimutatási technika az orvostudomány, a biológia, a környezettudomány és az élelmiszer-biztonság területén. Az antigén és az antitest kimutatásának hagyományos és klasszikus módszerei számos problémával találkoznak, például időigényes, magas költségű és alacsony pontosságú. Egy újszerű immunmikroszféra képalkotó technikát használunk a mikrolencsékkel a törésmutató változásainak vizsgálatára az antigén-antitest reakció előtt és után. Az antigén-antitest reakció minőségi és mennyiségi meghatározását gyorsan el tudja végezni címkézés, előmódosítás, utómosás és drága enzimek nélkül. Itt bemutatjuk és megvitatjuk az elvét és előnyeit, a mikrolencsés immunoassay műszer felépítését és a klinikai minták mérésében rejlő lehetőségeket. Ígéretesnek ígérkezik a klinikai betegségek diagnosztikájában való alkalmazására.
1. Bevezetés
Az antigén és az antitestek kimutatására manapság rendelkezésre álló általános technikák közé tartozik az enzimhez kötött immunszorbens próba (ELISA), a felületi plazmon rezonancia (SPR), a radioimmun próba (RIA), a kolloid arany immunkromatográfiás próba (GICT), az indirekt immunfluoreszcens próba (IFA), a kemilumineszcens immunpróba (CLIA) és a részecskékkel megerősített turbidimetrikus immunpróba (PETIA). Az ELISA egyesíti az enzimkatalizált reakció erősítését, valamint az antigén és az antitest specifikus reakcióját nagy pontossággal és alacsony költséggel, de eljárásai bonyolultak, szigorú feltétel-ellenőrzéssel . Az SPR-t az 1990-es években fejlesztették ki a biomolekulák és más molekulák közötti kölcsönhatás kimutatására, és nem igényel jelölést, és gyorsan megkapja az eredményt, de berendezése drága és nagy mintamennyiséget igényel . Az RIA jellemzői a nagy érzékenység, a megbízhatóság és az alacsony mintatérfogatigény. Széles körben használják a fehérjék, enzimek és más molekulák kimutatására, de a radionuklid káros az egészségre, és megváltoztatja a minták biológiai aktivitását is, ami kísérleti hibához vezet . Az új típusú immunvizsgálati technikaként és az antigén és az antitest kimutatásának egyik leggyakoribb módszereként a GICT könnyű, egyszerű és gyors, alacsony költséggel, de mintamérete korlátozott, alacsony érzékenységgel . A CLIA, az IFA és a PETIA szintén széles körben használatos az antigén és az antitest kimutatására. Közös előnyük a nagy pontosság, a stabilitás, az egyszerűség és a gyorsaság, de magas költséggel és nagy mintatérfogattal járnak .
A törésmutató változásának vizsgálatára szolgáló immunmikrolencsés képalkotó technika áttörheti a fenti módszerek korlátait. Gyors, érzékeny és egyszerű, nem szennyezéssel és alacsony költséggel detektálható, és várhatóan széles körben alkalmazzák az elsődleges egészségügyi intézményekben . Ez a technika párhuzamos fénybesugárzásból, nagy felbontású kamerából, intelligens elemzőszoftverből, autofókuszból és hőmérséklet-szabályozó rendszerekből áll egy többlyukú mikrolencsés mintatesztelő lemezzel, és képes az antigén és az antitest többmenetes kimutatására. A nagy felbontású kamerarendszer megfelel a mikrolencsés képalkotás követelményeinek, és a hőmérséklet-szabályozó, az autofókusz és az automatikus intelligens elemzőrendszerek használata nagymértékben csökkentheti a kísérletek hibáit a pontos mérés érdekében.
2. A mikrolencsés immunvizsgálat elve
A mikrolencse egy hengeres lencse, amelynek egyik vége gömbfelület, a másik vége pedig sík felület. Erős erősítő hatással rendelkezik, és jelentősen javítja a hagyományos optikai mikroszkóp képalkotó képességét . Ha egy mikrolencsét, amelynek sugara és törésmutatója (RI) a () oldatba merítjük és síkfénnyel megvilágítjuk, a fénytörés hatására a képe kerek lesz, a szélén sötét gyűrűvel . A képen lévő fényes folt sugara és más paraméterek, mint például , , , és a mikrolencse hengermagassága közötti összefüggés a következőképpen jelenik meg :ahol a fény beesési szöge a mikrolencse gömb alakú tetejére és . E képlet alapján a közeg pillanatnyi változása meghatározható a fényes folt sugarának mérésével a képalkotásban és a mikrolencse sugarának mérésével. Mivel az optikai fénytörés fénysebességgel történik, a mikrolencsét körülvevő közeg bármely pillanatnyi RI-változása azonnal előidézheti a központi fényes folt sugarának változását. Ezért a módszer a pillanatnyi RI/koncentráció-változást a képalkotáshoz használt nagysebességű kamerával képes nyomon követni (1. ábra).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3. A mikroszemcsés immunvizsgálati eszköz felépítése és funkciói
Amint az a 2. ábrán látható, párhuzamos fényforrás, nagy felbontású képalkotás, automatikus intelligens elemzés, autofókusz és hőmérsékletszabályozó rendszerek, valamint egy több lyukú mikroszemcsés tesztlemez alkotja a mikroszemcsés immunvizsgálati eszközt . Amikor a párhuzamos fényforrás párhuzamos fényt bocsát ki a mikrolencsére, a nagy felbontású autofókuszos képalkotó rendszer milliszekundumokon belül fókuszált képet készít. Ezután az immunmikrogömb-képet az intelligens elemző szoftverrendszer elemzi az és értékek, valamint az antigén/antitest koncentrációjának levonása érdekében. A hőmérséklet-szabályozó rendszer feladata a különböző antigén-antitest reakciókhoz szükséges különböző hőmérsékletek beállítása. Az egész folyamat legfeljebb 2 percet vesz igénybe.
3.1. Párhuzamos fénysugárzó rendszer
LED mint párhuzamos fényforrás egy hengeres párhuzamos megvilágítási területet hoz létre, amely hasonló egy eredeti kondenzátorhoz, amelynek előnyei az alacsony költség, a hosszú élettartam, a tökéletes fényteljesítmény és a kis méretarány . Amint a 3. ábrán látható, a lencse fénytörése miatt tényleges párhuzamos fényt lehet kapni. A LED besugárzási területén a lencse a megfelelő lencse konfigurálásával megváltoztathatja a fény irányát és eloszlását úgy, hogy a tényleges párhuzamos fényt kapjuk (3. ábra).
3.2. A párhuzamos fényt a lencse veszi fel. Nagy felbontású autofókuszos képalkotó rendszer
Ez a rendszer egy nagy sebességű digitális kamerából és egy autofókuszos rendszerből áll. Jelenleg egyes kereskedelmi forgalomban kapható digitális fényképezőgépek képalkotási sebessége meghaladja a 10 000 képkockát másodpercenként . Ezért a nagy felbontású képalkotó rendszer képes az oldatban lévő RI dinamikus változásainak valós idejű megfigyelésére. A nagy pixelszámú CCD-kamera fontos szerepet játszik a nagy felbontású mikrolencsés képalkotás elérésében. Az autofókusz rendszer magjai képazonosító, képfeldolgozó és vezérlő részekből állnak. A kamerarendszer által gyűjtött képeket elemzik, és a tisztasági értékelést mutatják be. Ennek az értékelésnek megfelelően a rendszert automatikusan egy megfelelő területre vagy irányba irányítják, amíg a megszerzett képek felbontása nem felel meg az előre beállított követelménynek.
3.3. Automatikus intelligens képfelismerő és elemző rendszer
Az automatikus intelligens elemző rendszer elsősorban képfelismerést és adatelemzést végez a mikrolencse képalkotásán, hogy figyelemmel kísérje annak képében a pillanatnyi változást, és ezáltal következtessen a mintaoldat törésmutatójának változására az antigén-antitest reakció során. A pontossága szorosan összefügg a képminőséggel, és az olyan paraméterek, mint a pixel, a pixelméret és a felbontás közvetlenül befolyásolják a RI mérését. Ha a ≥10 millió pixeles CCD digitális kamerát és a 3 nm-nél kisebb pixelméretet elérő kis pixelméretet, valamint a 600 μm sugarú mikrolencsét használják ki, a törésmutató-változást a középső fényes folt arányának és a külső gyűrű sugarának arányának változásával határozzák meg, így a mért törésmutató-változás elérheti a 10-6 .
3,4. Hőmérséklet-szabályozó rendszer
A hőmérséklet-szabályozó rendszer egy átlátszó, edzett üveglap, vékony indium-ón-oxid filmmel, amelyet egy nagy pontosságú PID (arányos-integrál-derivált) hőmérséklet-szabályozó vezérel. Ez lehetővé teszi, hogy a minta hőmérséklete a többlyukú mikrolencsés tesztlemezben 2 perc alatt gyorsan elérje a beállított értéket, és 0,1°C-os változási tartományon belül maradjon, hogy az antigén-antitest reakció hatékony legyen .
3.5. Mikrolencse tesztlemez
A több lyukú mikrolencse tesztlemezt kifejezetten mikrolencse immunoassay műszerhez tervezték. Polimetil-metakrilát (PMMA) anyagból készül, és általában 2 vagy 16 trapéz alakú mélyedésként készül a különböző kimutatási követelmények kielégítésére. Minden egyes mélyedés belsejében egy több száz mikron sugarú mikrolencse található az alján. A mikrolencsés lemez alkalmazása objektív feltételt biztosít a többcsatornás detektáláshoz. Mivel a kút aljának átmérője mindössze kb. 2 mm, több mikroliter mintaoldat elegendő ahhoz, hogy a mikrolencse megfulladjon az antigén-antitest kimutatáshoz.
4. Az immunmikrogömb képalkotó rendszer alkalmazása
4.1. Az immunmikrogömb képalkotó rendszer
4.1. A mikrogömb-lemez alkalmazása. Az antigén-antitest reakció mérése
Huang és munkatársai különböző típusú antigén-antitest reakciókat detektáltak és megállapították azok szabályos jellemzőit. Először is, a törésmutató az antigén (Ag)-antitest (Ab) reakció során a reakcióidővel változott. Másodszor, az RI reakcióidővel való változásának három fázisa volt, beleértve a gyorsan növekvő, a viszonylag stabil és a lassan csökkenő időszakokat. Az első szakasz az Ag és az Ab kombinációjához kapcsolódott, így az RI hirtelen megnőtt az Ag és az Ab gyors kombinációjával, hogy komplexeket képezzenek. Az RI maximuma a második fázisban van. Harmadszor, az Ag vagy az Ab koncentrációja nagy hatással volt az RI-re. Így az RI változásának az Ag vagy Ab koncentráció függvényében történő meghatározásával a vizsgált mintákban lévő tartalmuk a görbe illesztésével kiszámítható. Negyedszer, a különböző antitestek, mint például a capture Ab és a probing Ab, szintén befolyásolnák a RI változását. Ezt a technikát az antigén-antitest reakciók mérésére több Ag-Ab rendszerrel alkalmazva a törésmutató-változás és többféle antigén-antitest oldat koncentrációja közötti összefüggéseket (interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, placenta alkalikus foszfatáz (PAP) Ag-Ab, kallikrein 6 (KLK6) Ag-Ab, humán koriongonadotropin (HCG) Ag-Ab, kardiális troponin (cTnI) Ag-Ab, zsírsavkötő fehérjék (FABP) Ag-Ab és C-reaktív protein (CRP) Ag-Ab oldatok között (4. ábra). Mivel tudjuk, hogy az antigén-antitest komplex asszociációja és disszociációja dinamikus folyamat, az RI vs. idővel való deriváltjának kiszámítása alapján a következő egyenlet segítségével információt kaphatunk az asszociációs és disszociációs sebességi állandókról és (4. ábra (a)) és más termodinamikai paraméterekről is:
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4.2. Az alábbi táblázatban szereplő adatok a következők. Klinikai minták mérése
Az immunmikroszférás képalkotó technikát a továbbiakban klinikai minták vizsgálatára használtuk. Ezzel 36 klinikai mintában detektálták a CRP Ag koncentrációját. A relatív standard eltérése az immunkromatográfiához képest körülbelül 2-10%, és a két módszerrel kapott eredmények közötti korrelációs együttható eléri a 0,989-et (5. ábra). Jól ismert, hogy a klinikailag hemolizált szérumminták nagymértékben befolyásolhatják a hagyományos módszerekkel kimutatott eredmények pontosságát. Ezzel szemben a hemolizált mintákban a mikrolencsék képei még mindig tiszták ezzel a technikával. A hemolizált és a nem hemolizált mintákban kimutatott antigénértékek közötti relatív hiba mindössze 2%, ami azt jelzi, hogy a hemolizált szérumminták kevésbé befolyásolják az eredmények pontosságát.
5 . Az immunmikroszférás képalkotás megvalósíthatósága antigén és antitest kimutatására
A legtöbb antigén fehérje, míg néhány poliszacharid, nukleinsav és egyéb anyag, az antitestek pedig mind fehérjék. Mivel a fehérje nagy mennyiségű amidót és karboxilt tartalmaz, ezek a poláris csoportok miatt a kolloid részecskék az elektrosztatikus hatás miatt elektromos töltést hoznak létre, és az azonos töltésű részecskék taszították egymást. Ugyanakkor az erősen hidrofil poláris csoportok reakcióba lépnek a vízmolekulákkal, és hidratációs réteget képeznek, hogy hidrofil kolloidot hozzanak létre, biztosítva, hogy a fehérje ne agglomerálódjon csapadékot képezve, így a kolloid részecskék egyenletesen eloszlanak az oldatban .
Amikor az antigént antitesttel kombinálják, a kolloid részecskék elektromos töltése csökken vagy eltűnik, és a hidratációs réteg is eltűnik vagy vékony lesz. A fehérje hidrofilből hidrofób kolloiddá változik . Az elektrolit környezetében a kolloid részecskék tovább agglomerálódnak, hogy antigén-antitest komplexeket képezzenek, amelyek a szemmel felismerhetők . A hidrofil és hidrofób kolloid törésmutatói jelentősen különböznek egymástól. Ezért ez a technika képes nyomon követni a törésmutató dinamikus változásait annak megítélésére, hogy előfordulnak-e antigén és antitest reakciók az oldatban. Az antigén- és antitest-koncentráció és a reakcióidő közötti kapcsolat alapján standard görbét lehet felállítani. Az antigén-antitest reakció folyamatával a komplex egyre nagyobb lesz, és a törésmutató változása is szembetűnőbbé válik. A standard görbe segítségével könnyen számszerűsíthető a detektált antitest vagy antigén koncentrációja.
Bebizonyosodott, hogy a különböző antigének epitópjaihoz komplementer antitest valóban hasonló RI-növekedést idéz elő az Ag-Ab reakcióban a mikrolencsés képalkotó immunoassay-vel. Amint a 4(b) és a 4(c) ábrán látható, az antigén méréseket egy adott antigén esetében befogadó Ab és szondázó Ab vagy monoklonális Ab és poliklonális Ab használatával végeztük el. A görbékből látható, hogy a kétféle antitest között nem volt jelentős különbség az Ag-Ab reakció során bekövetkező változás előidézésében, ami azt jelzi, hogy a mikrolencsés képalkotó immunoassay különböző típusú antitesteket használhat, akár befogó vagy szondázó Ab-t, akár monoklonális vagy poliklonális Ab-t a kimutatáshoz. Mindazonáltal a monoklonális Ab-t előnyben részesítik a mikrolencsés képalkotó immunoassay-hoz, mivel nem csak nagyobb reakciót indukál az antigénhez való nagyobb affinitása révén, hanem csökkenti a keresztreakció hamis pozitív lehetőségét is, így az antigének alacsonyabb koncentrációban is kimutathatók. Összességében a keresztreakció elméletileg elkerülhetetlen ennél a technikánál, mint az immunpróba más eszközeinél. Más szóval, az immunmikrolencsés képalkotás specificitása teljes mértékben a célantigén ellen kiválasztott antitestek specifitásától függ. Ezért nagyon fontos a megfelelő antitestek kiszűrése és az Ag-Ab reakciórendszer optimalizálása.
6. Következtetések
Ez az immunmikrolencsés képalkotó technika gyorsan és pontosan mérheti a különböző minták RI-jét, és nyomon követheti a RI valós idejű változásait az antigén és az antitest reakciója során. Az RI az Ag vagy Ab koncentrációjának változásával változik. Így az Ag- vagy Ab-koncentráció függvényében bekövetkező RI-változás alapján a minták tartalma minőségileg és mennyiségileg kiszámítható, címkézés, előmódosítás, utómosás és drága enzimek nélkül. A hagyományos kimutatási módszerekkel összehasonlítva a módszer előnyei a következők: pontos, megbízható, gyors (néhány percen belül elkészül) és egyszerű, környezetszennyezés nélküli. Emellett a kimutatási határ olyan alacsony, mint a pg/ml, ami csak néhány μl elegendő a kimutatás elvégzéséhez, és olyan hemolizált klinikai minták esetében is alkalmas, amelyek a hagyományos módszerekkel nehezen kimutathatók. Ráadásul a mintákat nem érinti. A párhuzamos fénybesugárzó rendszer, a nagy felbontású kamerarendszer, az automatikus intelligens elemző rendszer, az autofókusz rendszer, a hőmérséklet-szabályozó rendszer és a mikrolencsés porózus detektáló tábla alkotja a mikrogömbös immunoassay műszert. Kicsi és könnyen hordozható.
Tudott, hogy az antigén-antitest reakciót nagymértékben befolyásolja a saját koncentrációja, a hőmérséklet, a pH és az elektrolitoldat. Emiatt ezeket a tényezőket figyelembe veszik a mikrolencsés képalkotó rendszerben, hogy változásuk kiegyensúlyozásával stabilan tartsák az adatokat. Ez a rendszer optimalizálható például az antigén-antitest reakcióhelyet kínáló tesztlemez megfelelő anyagainak kiválasztásával, valamint a lemez hidrofíliássá tételével a hidrofób interferencia elkerülése érdekében. A detektálási pontosság tovább javítható az antigén-antitest arány beállításával, megfelelő hígítószer szűrésével, fémionokkal való módosításával és így tovább.
Az antigén és az antitest kimutatása viszonylag jelentős az orvosbiológiai vizsgálatok, a klinikai diagnózis, a gyógyszeranalízis, az élelmiszerbiztonság és a környezeti monitorozás területén. Az emberek környezeti egészséggel, élelmiszerbiztonsággal és egészségügyi ellátással kapcsolatos aggodalmaival az alacsony költségű, nagy pontosságú, kis méretű, hordozható és egyszerű működésű érzékeny műszer kifejlesztése sürgető társadalmi szükségletté vált. Így ez az immunmikrolencsés képalkotó technika ígéretes arra, hogy széles körben alkalmazzák különböző területeken, és alkalmas arra, hogy különösen népszerűsítsék a közösségben és a vidéken.
Érdekütközések
A szerzők kijelentik, hogy nincs érdekellentét a cikk közzétételével kapcsolatban.
A szerzők hozzájárulása
Jiahui Liang és Xiaotian Ye egyenlő mértékben járultak hozzá a munkához.
Köszönet
Hálásak vagyunk a Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (támogatási szám: 201604020146) és a National Natural Science Foundation of China (támogatási számok: 81172824 és 30971465) finanszírozási támogatásáért.
Köszönet
Köszönjük a Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (támogatási szám: 201604020146) és a National Natural Science Foundation of China (támogatási számok: 81172824 és 30971465) támogatását.