Le test du lysat d’amébocyte de Limulus (LAL) est une méthode de détection et de quantification des endotoxines bactériennes largement utilisée par l’industrie pharmaceutique et biotechnologique. Le principe biochimique du test est basé sur la réaction de coagulation de l’hémolymphe du Limulus polyphemus, communément appelé limule de l’Atlantique, en présence d’antigènes à surface microbienne, tels que les lipopolysaccharides ou les endotoxines bactériennes.

L’entreprise « Wako Chemicals » fait partie des entreprises qui fabriquent des réactifs LAL au niveau international grâce à sa formule unique d’un réactif LAL spécifique aux endotoxines bactériennes sans interférence des bêta-glucanes dans les échantillons, grâce à l’ajout de Curdlan carboximéthylé (CMC) coliophilisé avec le LAL. Sous la marque PYROSTAR™, cette société distributrice de réactifs de recherche fabrique et commercialise des réactifs et accessoires LAL conformes à toutes les normes, réglementations et standards de qualité établis par la FDA des USA.

Nous allons maintenant parler des différents réactifs et accessoires avec lesquels Wako contribue à l’étude des endotoxines bactériennes :

Premièrement, nous avons le kit Limulus PS Simple Test, qui permet la détection et la quantification des endotoxines sans l’interférence d’autres substances coexistantes avec l’utilisation d’un adsorbant d’affinité pour les endotoxines appelé Pyrosep™. Avec cette méthode, nous pouvons mesurer l’endotoxine dans un échantillon lipophile à condition qu’il puisse être dissous dans l’éthanol, comme les vitamines liposolubles, les huiles et les graisses, les albumines, etc. qui ne peuvent normalement pas être mesurées avec un test de Limulus conventionnel. En outre, aucun réactif LAL n’est gaspillé car il est appliqué individuellement dans les flacons du test simple et peut être utilisé dans la quantité exacte requise pour la mesure.

La série PYROSTAR™ ES-F est une formulation unique contenant du Curdlan carboximéthylé (CMC) coliophilisé avec LAL dans le but d’éliminer l’interférence avec les β-glucanes. Le tampon ES développé par Wako contient des concentrations élevées de CMC, se transformant en un réactif LAL spécifique des endotoxines. Ce réactif est conçu pour être utilisé à la fois pour la détection qualitative des endotoxines par la méthode du caillot de gel et pour leur détection quantitative par les méthodes turbidimétriques cinétiques (KTA). Un instrument photométrique appelé Toxinometer®, développé par Wako Pure Chemical Industries, Ltd, est utilisé pour mesurer la vitesse de changement de turbidité. Les kits PYROSTAR™ ES-F sont disponibles avec et sans l’endotoxine de contrôle standard (SCE) : un réactif lyophilisé raffiné à partir d’E.coli et utilisé pour confirmer la sensibilité du réactif LAL, valider les méthodes de test du produit et préparer les contrôles d’inhibition.

Pour soutenir ces réactifs, Wako développe également une solution d’extraction des endotoxines capable d’extraire les endotoxines des surfaces où elles ne peuvent pas être extraites avec de l’eau ou du sel. Son utilisation est recommandée pour les échantillons d’endotoxines sur les équipements et dispositifs qui pourraient être en contact avec des liquides contenant du sang ou des protéines.

Le Toxinometer® ET-6000 est un lecteur d’incubation cinétique informatisé qui peut intégrer 3 méthodes de test : gel-clot, KTA et KCA (test cinétique chromogène). Cet équipement nous permet d’obtenir des résultats de gel-clot et de KTA à partir du même échantillon. Il mesure simultanément jusqu’à 16 échantillons avec un risque de contamination beaucoup plus faible que la microplaque et permet d’archiver les courbes standard. Toximaster® QC7 est le logiciel qui fournit toutes les fonctions de traitement des données et de préparation des rapports pour le test LAL avec le Toxinometer® ET-6000.

De plus, parmi les accessoires des catalogues LAL de Wako, nous voyons également des tubes à essai avec et sans couvercle en aluminium. Ces tubes sont produits sans endotoxines, en verre borosilicate et conçus pour la méthode du gel-coagulant. L’épaisseur du verre peut être spécifiquement calibrée sur le Toxinomètre pour une intensité lumineuse et une transmittance stables.

Un autre réactif LAL commercialisé par Wako est le kit KY Color Limulus. Ce réactif a été conçu pour la méthode KCA et peut être utilisé à la fois dans le lecteur cinétique et dans un lecteur de microplaques. Il comprend un kit de test multiple et un kit de test simple, chacun conçu pour une analyse colorimétrique basée sur le temps, utilisant un substrat synthétique qui génère une couleur jaune et qui peut détecter spécifiquement l’endotoxine avec une grande sensibilité.

Bibliographie:

1) Iwanaga, S. Principe biochimique du test de Limulus pour la détection des endotoxines bactériennes. Comptes rendus de l’Académie japonaise, série B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Directive sur la validation du test du lysat d’amébocyte de Limulus en tant que test d’endotoxine du produit final des médicaments parentéraux, des produits biologiques et des dispositifs médicaux humains et animaux. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, décembre (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura : Extrait 110 (1992), 6e réunion annuelle de la Société japonaise pour les alternatives à l’expérimentation animale.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura : Extrait 44 (1994), 21e réunion annuelle de la Société des agents antibactériens et antifongiques.

5) Tsuchiya, M. ; Oishi, H. ; Takaoka, A. ; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discrimination entre l’endotoxine et le (1-3) beta-D-glucan en utilisant un essai cinétique turbidimétrique avec le lysat d’amébocyte de Limulus. Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). 2523. (1990).

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