Abstract

La détection et l’analyse de la réaction antigène-anticorps est l’une des techniques de détection les plus critiques dans les domaines de la médecine, de la biologie, de la science environnementale et de la sécurité alimentaire. Les méthodes traditionnelles et classiques de détection d’antigènes et d’anticorps rencontrent de nombreux problèmes, tels que le temps nécessaire, le coût élevé et la faible précision. Une nouvelle technique d’imagerie des microsphères immunitaires par la microlentille est utilisée pour tester les changements d’indice de réfraction avant et après la réaction antigène-anticorps. Elle peut rapidement effectuer une détermination qualitative et quantitative de la réaction antigène-anticorps sans marquage, prémodification, post-lavage et enzymes coûteux. Nous présentons et discutons ici son principe et ses avantages, la structure d’un instrument d’immuno-essai à microlentilles et son potentiel pour mesurer des échantillons cliniques. Il est prometteur d’être développé pour une application au diagnostic des maladies cliniques.

1. Introduction

Les techniques courantes disponibles de nos jours pour la détection des antigènes et des anticorps comprennent le dosage immunoenzymatique (ELISA), la résonance plasmonique de surface (SPR), le dosage radio-immunologique (RIA), le dosage immunochromatographique à l’or colloïdal (GICT), le dosage immunofluorescent indirect (IFA), le dosage immunitaire par chimioluminescence (CLIA) et le dosage immunologique turbidimétrique renforcé par des particules (PETIA). L’ELISA combine l’amplification de la réaction catalysée par une enzyme et la réaction spécifique de l’antigène et de l’anticorps avec une grande précision et un faible coût, mais ses procédures sont compliquées avec un contrôle rigoureux des conditions . La SPR a été développée dans les années 1990 pour détecter l’interaction entre les biomolécules et d’autres molécules. Elle ne nécessite aucun marquage et permet d’obtenir des résultats rapidement, mais son équipement est coûteux et nécessite un grand volume d’échantillons. La technique RIA présente les caractéristiques suivantes : haute sensibilité, fiabilité et faible volume d’échantillon requis. Elle est largement utilisée pour la détection de protéines, d’enzymes et d’autres molécules, mais le radionucléide est nocif pour la santé et altère également les activités biologiques des échantillons, ce qui entraîne des erreurs expérimentales. En tant que nouveau type de technique de dosage immunologique et l’une des méthodes les plus courantes pour la détection d’antigènes et d’anticorps, le GICT est facile, simple, rapide et peu coûteux, mais sa taille d’échantillon est limitée et sa sensibilité faible. Les techniques CLIA, IFA et PETIA sont également largement utilisées pour la détection d’antigènes et d’anticorps. Leurs avantages communs sont très précis, stables, faciles et rapides, mais avec un coût élevé et un grand volume d’échantillon .

Une technique d’imagerie de microlentilles immunitaires pour tester le changement d’indice de réfraction peut briser les limites des méthodes ci-dessus. Il est rapide, sensible et simple avec non pollution et faible coût pour la détection et devrait être largement appliqué aux institutions médicales primaires . Cette technique se compose d’une irradiation lumineuse parallèle, d’une caméra à haute résolution, d’un logiciel d’analyse intelligent, d’un autofocus et de systèmes de contrôle de la température avec une plaque de test d’échantillon à microlentilles multi-puits et peut réaliser une détection multipasse de l’antigène et de l’anticorps. Le système de caméra à haute résolution peut répondre aux exigences de l’imagerie microlens, et l’utilisation du contrôleur de température, de l’autofocus et des systèmes d’analyse intelligents automatiques peut réduire considérablement les erreurs dans les expériences pour une mesure précise.

2. Principe de l’immunoessai microlens

Microlens est une lentille cylindrique avec une extrémité de surface sphérique et l’autre extrémité est une surface plane. Il a un fort effet d’amplification et améliore considérablement la capacité d’imagerie du microscope optique traditionnel . Lorsqu’une microlentille d’un rayon de et d’un indice de réfraction (IR) de est immergée dans une solution de () et éclairée par une lumière plane, en raison de l’effet de réfraction, son image est ronde avec un anneau sombre sur son bord. La relation entre le rayon du point brillant de l’image et d’autres paramètres tels que , , , et la hauteur du cylindre de la microlentille est représentée comme suit : où est l’angle d’incidence de la lumière sur le sommet sphérique de la microlentille et . Sur la base de cette formule, les changements instantanés du milieu peuvent être déterminés en mesurant le rayon du point brillant dans l’image et le rayon de la microlentille. La réfraction optique s’effectuant à la vitesse de la lumière, toute variation instantanée de RI dans le milieu environnant d’une microlentille peut immédiatement induire une modification du rayon du point lumineux central. Par conséquent, la méthode peut surveiller la variation instantanée de RI/concentration avec une caméra à grande vitesse pour l’imagerie (figure 1).

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3. Structure et fonctions d’un instrument de dosage immunologique à microlentilles

Comme le montre la figure 2, une source de lumière parallèle, une imagerie à haute résolution, une analyse intelligente automatique, des systèmes de mise au point automatique et de contrôle de la température, et une plaque de test à microlentilles multipuits composent un instrument de dosage immunologique à microsphères . Lorsque la source de lumière parallèle émet une lumière parallèle vers la microlentille, le système d’imagerie autofocus à haute résolution obtient une image focalisée en quelques millisecondes. Ensuite, l’imagerie des microsphères immunitaires est analysée par le système logiciel d’analyse intelligent pour déduire les valeurs de et ainsi que la concentration d’antigène/anticorps. Le système de contrôle de la température a pour fonction d’ajuster les différentes températures requises pour les différentes réactions antigène-anticorps. L’ensemble du processus ne dure pas plus de 2 minutes.

Figure 2

Structure d’un instrument de dosage immunologique à microlentilles. Il comprend une irradiation lumineuse parallèle, un autofocus, une imagerie haute résolution, un logiciel d’analyse intelligent, des systèmes de contrôle de la température, une plaque d’essai à microlentilles multi-puits.

3.1. Système d’irradiation de lumière parallèle

LED comme source de lumière parallèle produit une zone d’éclairage parallèle cylindrique, qui est similaire à un condensateur original avec les avantages de faible coût, long cycle de vie, performance lumineuse parfaite, et petite échelle . Comme le montre la figure 3, la lumière parallèle réelle peut être reçue en raison de la réfraction de la lentille. Dans la zone d’irradiation de la LED, la lentille peut changer la direction et la distribution de la lumière en configurant la lentille pertinente de sorte que la lumière parallèle réelle soit obtenue (Figure 3).

Figure 3

Principe du système d’irradiation de lumière parallèle. La lentille 1 et la lentille 2 focalisent la lumière émise par la LED. Ensuite, la lumière focalisée passe par un tunnel optique et une ouverture pour être projetée vers la lentille 3. Enfin, la lumière parallèle réelle est acquise par la lentille.

3.2. Système d’imagerie autofocus à haute résolution

Ce système se compose d’une caméra numérique à haute vitesse et d’un système autofocus. Actuellement, la vitesse d’imagerie de certains appareils photo numériques commerciaux a dépassé les 10 000 images par seconde . Par conséquent, le système d’imagerie à haute résolution peut réaliser le suivi en temps réel sur les changements dynamiques de l’IR dans la solution. Une caméra CCD à hauts pixels joue un rôle important dans l’obtention d’une imagerie à haute résolution des microlentilles. Les noyaux du système autofocus se composent de l’identification des images, du traitement des images et des parties de contrôle. Les images recueillies par le système de caméra sont analysées, et l’évaluation de la clarté est présentée. Selon cette évaluation, le système est automatiquement conduit vers une zone ou une direction appropriée jusqu’à ce que la résolution des images acquises satisfasse l’exigence prédéfinie.

3.3. Système automatique intelligent de reconnaissance et d’analyse d’image

Le système automatique intelligent d’analyse effectue principalement la reconnaissance d’image et l’analyse des données sur l’imagerie des microlentilles de manière à surveiller la variation instantanée de dans son image et ainsi déduire le changement d’indice de réfraction de la solution d’échantillon pendant le processus de réaction antigène-anticorps. Sa précision est étroitement liée à la qualité de l’image, et des paramètres tels que le pixel, la taille du pixel et la résolution affectent directement la mesure de l’IR . Si la caméra numérique CCD avec ≥10 millions de pixels et une petite taille de pixel qui atteint moins de 3 nm et une microlentille avec un rayon de 600 μm sont exploités, le changement d’indice de réfraction est déterminé par les changements du rapport du point lumineux central et le rapport du rayon de l’anneau extérieur de sorte que le changement d’indice de réfraction mesuré peut atteindre 10-6 .

3.4. Système de contrôle de la température

Le système de contrôle de la température est une plaque de verre trempé transparent avec un film mince d’oxyde d’étain d’indium et contrôlé par une haute précision d’un contrôleur de température PID (proportionnel-intégral-dérivé). Il permet à la température de l’échantillon dans la plaque de test à microlentilles multipuits d’atteindre rapidement une valeur de consigne en 2 min et d’être maintenue dans une plage de variation de 0,1°C pour rendre efficace la réaction antigène-anticorps .

3.5. Plaque de test à microlentilles

Une plaque à microlentilles multi-puits est spécialement conçue pour un instrument d’immunoessai à microlentilles. Elle est fabriquée en matériau polyméthacrylate de méthyle (PMMA) et est généralement préparée sous forme de 2 ou 16 puits trapézoïdaux pour répondre à différentes exigences de détection. À l’intérieur de chaque puits, on trouve une microlentille d’un rayon de plusieurs centaines de microns à sa base. L’application de la plaque de microlentilles fournit une condition objective pour la détection multicanaux. Comme le diamètre du dessous du puits est juste d’environ 2 mm, plusieurs microlitres de solution d’échantillon sont suffisants pour noyer la microlentille pour la détection d’antigène-anticorps.

4. Application du système d’imagerie par microsphères immunitaires

4.1. Mesure de la réaction antigène-anticorps

Huang et ses collègues ont détecté différents types de réactions antigène-anticorps et ont découvert leurs caractéristiques régulières. Premièrement, l’indice de réfraction change avec le temps de réaction dans le processus de réaction antigène (Ag)-anticorps (Ab). Deuxièmement, la variation de l’indice de réfraction en fonction du temps de réaction a connu trois phases, à savoir une augmentation rapide, une stabilité relative et un déclin lent. La première phase est liée à la combinaison de l’Ag et de l’Ab, de sorte que l’IR augmente soudainement avec la combinaison rapide de l’Ag et de l’Ab pour former des complexes. Le maximum de l’IR se situe dans la deuxième phase. Troisièmement, la concentration de l’Ag ou de l’Ab a une grande influence sur l’IR. Ainsi, en obtenant le changement de l’IR en fonction de la concentration d’Ag ou d’Ab, leur contenu dans les échantillons testés peut être calculé par une courbe d’ajustement. Quatrièmement, différents anticorps, tels que l’Ab de capture et l’Ab de sondage, peuvent également influencer la variation de l’IR. En utilisant cette technique pour mesurer les réactions antigène-anticorps par plusieurs systèmes Ag-Ab, les relations entre la variation de l’indice de réfraction et les concentrations de plusieurs types de solutions antigène-anticorps (interféron-γ (IFN-γ) Ag-Ab, Ag-Ab de la phosphatase alcaline placentaire (PAP), Ag-Ab de la kallikréine 6 (KLK6), Ag-Ab de la gonadotrophine chorionique humaine (HCG), Ag-Ab de la troponine cardiaque (cTnI), Ag-Ab des protéines de liaison des acides gras (FABP) et Ag-Ab de la protéine C-réactive (CRP)) (Figure 4). Comme nous savons que l’association et la dissociation du complexe antigène-anticorps est un processus dynamique, en se basant sur la courbe de RI vs. temps et le calcul de la dérivée de avec le temps, on peut également obtenir des informations sur les constantes de vitesse d’association et de dissociation et (Figure 4(a)) et d’autres paramètres thermodynamiques en utilisant l’équation suivante :

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Figure 4

L’indice de réfraction change avec les réactions antigène-anticorps. (a) Relations entre l’indice de réfraction de la réaction antigène-anticorps IFN-γ ou PAP et son temps. (b) Relations entre et les concentrations d’antigènes KLK6 ou CRP ont été déterminées, respectivement, lorsque son Ab monoclonal ou son Ab polyclonal a été ajouté à l’antigène correspondant. (c) Les relations entre les concentrations d’antigènes HCG et cTnI ou FABP ont été analysées, respectivement, lorsque son Ab de capture ou Ab de sondage a été ajouté à l’antigène correspondant. Ag : antigène ; Ab : anticorps ; : changement d’indice de réfraction ; IFN-γ : interféron-γ ; PAP : phosphatase alcaline placentaire ; KLK6 : kallikréine 6 ; HCG : gonadotrophine chorionique humaine ; cTnI : troponine cardiaque ; FABP : protéines de liaison des acides gras ; CRP : protéine C-réactive.

4.2. Mesure des échantillons cliniques

La technique d’imagerie par microsphères immunitaires a ensuite été utilisée pour tester des échantillons cliniques. 36 échantillons cliniques ont été détectés par celle-ci pour les concentrations de CRP Ag. Son écart-type relatif est d’environ 2-10% par rapport à l’immunochromatographie, et le coefficient de corrélation entre les résultats acquis par les deux voies atteint 0,989 (figure 5). Il est bien connu que les échantillons de sérum hémolysés cliniquement peuvent avoir un impact important sur la précision des résultats obtenus par les méthodes traditionnelles. Au contraire, les images de la microlentille dans les échantillons hémolysés sont toujours claires grâce à cette technique. Les erreurs relatives entre les valeurs d’antigène détectées dans les échantillons avec hémolyse et ceux sans hémolyse ne sont que d’environ 2%, ce qui indique la moindre influence des échantillons de sérum hémolysé sur la précision du résultat .

Figure 5

Mesure de 36 échantillons cliniques pour l’antigène de la protéine C-réactive en utilisant l’imagerie par microlentille immunitaire en comparaison avec l’immunochromatographie.

5. Faisabilité de l’imagerie par micro-sphère immunitaire pour la détection des antigènes et des anticorps

La plupart des antigènes sont des protéines tandis que quelques-uns sont des polysaccharides, des acides nucléiques et d’autres substances, et tous les anticorps sont des protéines. Comme la protéine contient une grande quantité d’amido et de carboxyle, ces groupes polaires font que les particules colloïdales produisent une charge électrique due à l’action électrostatique, et les particules de même charge se repoussent les unes les autres. Dans le même temps, les groupes polaires qui sont fortement hydrophiles réagissent avec les molécules d’eau et forment une couche d’hydratation pour produire un colloïde hydrophile, garantissant que la protéine ne s’agglomère pas pour former un précipité, de sorte que les particules colloïdales sont uniformément dispersées dans une solution .

Lorsque l’antigène est combiné avec l’anticorps, la charge électrique des particules colloïdales diminue ou disparaît, et la couche d’hydratation disparaît également ou devient mince. La protéine passe du colloïde hydrophile au colloïde hydrophobe . Dans l’environnement de l’électrolyte, les particules colloïdales s’agglomèrent davantage pour former les complexes antigène-anticorps qui peuvent être réalisés par les yeux. Les indices de réfraction des colloïdes hydrophiles et hydrophobes sont remarquablement différents. Par conséquent, cette technique peut suivre les changements dynamiques de l’indice de réfraction pour déterminer s’il y a des réactions entre l’antigène et l’anticorps dans une solution. Une courbe standard peut être établie en fonction de la relation entre la concentration d’antigène et d’anticorps et leur temps de réaction. Le complexe devient plus grand avec le processus de réaction antigène-anticorps, et le changement de l’indice de réfraction devient également plus évident. En utilisant la courbe standard, il est facile de quantifier la concentration de l’anticorps ou de l’antigène détecté.

Il a été démontré qu’un anticorps complémentaire aux épitopes de différents antigènes induirait effectivement une augmentation similaire de l’IR dans la réaction Ag-Ab avec l’immunodosage par imagerie à microlentilles. Comme le montrent les figures 4(b) et 4(c), des mesures d’antigènes ont été effectuées en utilisant un Ab de capture et un Ab de sondage ou un Ab monoclonal et un Ab polyclonal pour un certain antigène. Les courbes montrent qu’il n’y a pas de différence significative entre les deux types d’anticorps en ce qui concerne l’induction de changements pendant la réaction Ag-Ab, ce qui indique que le dosage immunologique par imagerie microlentille peut utiliser différents types d’anticorps, soit l’Ab de capture ou de sondage et l’Ab monoclonal ou polyclonal pour la détection. Néanmoins, l’Ab monoclonal est préféré pour l’essai immunologique d’imagerie par microlentille, car il n’induit pas seulement une plus grande réaction par sa plus grande affinité avec l’antigène, mais il réduit également la possibilité de faux positifs de réaction croisée, de sorte que les antigènes peuvent être détectés à des concentrations plus faibles. Dans l’ensemble, la réaction croisée est théoriquement inévitable pour cette technique comme pour les autres moyens utilisés dans les essais immunologiques. En d’autres termes, la spécificité de l’imagerie par microlentilles immunologiques dépend entièrement de celle des anticorps sélectionnés contre l’antigène cible. Par conséquent, il est très important de sélectionner les anticorps appropriés et d’optimiser le système de réaction Ag-Ab.

6. Conclusions

Cette technique d’imagerie par microlentille immunitaire peut mesurer rapidement et précisément l’IR de différents échantillons et surveiller les changements en temps réel de l’IR dans le processus de réaction entre l’antigène et l’anticorps. L’IR se modifie en fonction des changements de la concentration de l’Ag ou de l’Ab. Ainsi, selon la variation de l’IR en fonction de la concentration d’Ag ou d’Ab, le contenu des échantillons peut être calculé qualitativement et quantitativement sans marquage, prémodification, post-lavage et enzymes coûteux. Par rapport aux méthodes de détection conventionnelles, les avantages de cette méthode sont la précision, la fiabilité, la rapidité (finalisation en quelques minutes) et la simplicité sans pollution. En outre, sa limite de détection est aussi basse que pg/ml, ce qui nécessite juste quelques μl suffisants pour effectuer la détection et elle est également adaptée aux échantillons cliniques hémolysés qui sont difficiles à détecter avec les méthodes traditionnelles. Qui plus est, il est non intrusif pour les échantillons. Le système d’irradiation lumineuse parallèle, le système de caméra haute résolution, le système d’analyse automatique intelligent, le système autofocus, le système de contrôle de la température et la carte de détection poreuse à microlentilles composent l’instrument d’immunodosage à microsphères. Il est petit et facile à transporter.

Il est bien connu que la réaction antigène-anticorps est grandement influencée par sa propre concentration, la température, le pH et la solution électrolytique. Pour cette raison, ces facteurs sont pris en considération dans le système d’imagerie à microlentilles pour garder les données stables en équilibrant leurs changements. Par exemple, ce système peut être optimisé en sélectionnant des matériaux appropriés pour une plaque de test qui offre un site de réaction antigène-anticorps et en rendant la plaque hydrophile pour éviter les interférences hydrophobes. La précision de détection peut encore être améliorée en ajustant la proportion antigène-anticorps, en sélectionnant un diluant approprié, en les modifiant avec des ions métalliques, et ainsi de suite.

La détection d’antigène et d’anticorps est relativement importante dans les domaines de l’investigation biomédicale, du diagnostic clinique, de l’analyse des médicaments, de la sécurité alimentaire et de la surveillance environnementale. Avec les préoccupations des gens sur la santé environnementale, la sécurité alimentaire et les soins de santé, le développement d’un instrument sensible avec un faible coût, une grande précision, une petite taille, une portabilité et une opération simple est devenu un besoin social urgent. Ainsi, cette technique d’imagerie microlentille immunitaire est prometteuse pour être largement appliquée à divers domaines et appropriée pour être particulièrement popularisée à la communauté et à la campagne.

Conflits d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Contributions des auteurs

Jiahui Liang et Xiaotian Ye ont contribué à parts égales à ce travail.

Reconnaissance

Nous sommes reconnaissants au programme de science et technologie de la ville de Guangzhou Synergistic Innovation Major Project (numéro de subvention : 201604020146) et à la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention : 81172824 et 30971465) pour leur soutien financier.