HypaCas9 et Cas9-HF1 présentent des taux de clivage lents observés

Nous commençons nos analyses cinétiques en mesurant la concentration du site actif de l’enzyme pour chacune des variantes de Cas923,24,25. La mesure de la quantité de produit formé dans un titrage de l’enzyme avec des concentrations croissantes d’ADN a révélé des concentrations de site actif de 31 nM, 26 nM, 23 nM pour SpCas9, HypaCas9 et Cas9-HF1, respectivement, pour des échantillons d’enzyme avec une concentration nominale de 100 nM basée sur l’absorbance à 280 nm (figures supplémentaires 1a-d). Nous avons également mesuré les concentrations du site actif de SpCas9 et HiFiCas925 de Integrated DNA Technologies (IDT) et avons observé des concentrations similaires d’enzyme active (Fig. 1e-f). Il est important de noter que, dans chaque cas, la concentration d’ADN requise pour saturer le signal était égale à la concentration de produit formé, ce qui élimine les préoccupations concernant le fait qu’une partie de l’enzyme pourrait se lier à l’ADN mais ne pas réagir. Toutes les expériences ultérieures ont été mises en place en utilisant la concentration d’enzyme active déterminée lors du titrage du site actif.

Pour comparer la cinétique des substrats d’ADN sur ou hors cible de SpCas9 avec les variantes modifiées, nous avons d’abord examiné l’évolution temporelle du clivage du brin cible (HNH) pour chaque enzyme (Fig. 1 et Fig. 2 supplémentaire). Les données ont été ajustées avec une fonction exponentielle simple ou double en utilisant l’équation (1) ou l’équation (2), respectivement.

où Y représente la concentration du produit de clivage, A1 représente l’amplitude, et λ1 représente le taux de décroissance observé (valeur propre)17.

où Y représente la concentration du produit de clivage, A1 représente l’amplitude et λ1 représente le taux observé pour la première phase. A2 représente l’amplitude et λ2 représente le taux observé pour la seconde phase.

La comparaison des taux de décroissance de clivage observés des substrats on- et off-target par SpCas9 montre que le mismatch PAM-distal de 3 pb ralentit l’enzyme 13 fois (de 1 s-1 à 0,076 s-1). Les deux variantes de Cas9 haute fidélité diminuent considérablement le taux de décroissance observé pour le clivage des substrats d’ADN ciblés, de 21 à 35 fois par rapport à SpCas9 (0,028 s-1 pour HypaCas9 et 0,047 s-1 pour Cas9-HF1 contre 1 s-1 pour SpCas9). De plus, HypaCas9 et Cas9-HF1 réduisent encore les taux de décroissance du clivage de l’ADN hors cible de 8 à 290 fois (taux de 0,0033 s-1 et 0,00016 s-1, respectivement) par rapport à leurs taux respectifs avec l’ADN sur cible. Ces données démontrent des changements spectaculaires dans les taux de clivage observés par les variantes modifiées avec l’ADN cible et hors cible. Cependant, ces mesures seules ne définissent pas les changements de spécificité, qui est une fonction de la partition cinétique du clivage de l’ADN par rapport à la dissociation, englobant toutes les étapes menant à la première étape irréversible de la voie17, y compris la liaison réversible de l’ADN, la formation de la boucle R, la fixation du domaine HNH et le clivage de l’ADN.

Le déroulement de l’ADN est largement inchangé avec les variantes de Cas9

Puisque notre travail précédent a identifié la formation de la boucle R comme limitant la vitesse pour le clivage sur la cible et que d’autres ont suggéré par la suite que les taux de formation de la boucle R et de réenroulement peuvent dicter la spécificité de l’enzyme pour SpCas9 et Cas9-HF116, nous avons testé si HypaCas9 présenterait une cinétique similaire. Pour mesurer directement les taux de formation de la boucle R pour toutes les enzymes, nous avons utilisé un test à flux arrêté basé sur la mesure de la fluorescence du tCo à -16 nt, un analogue tricyclique fluorescent de la cytosine qui est éteint par l’empilement des bases dans l’ADNdb, de sorte que l’ouverture du duplex entraîne une forte augmentation de la fluorescence. Nos expériences de contrôle utilisant nos substrats analogues de base marqués au tCo et au 2-AP aux positions -16, -9 et -1 nt, respectivement (figure supplémentaire 3), montrent qu’aucun des analogues n’affecte le taux de décroissance observé pour le clivage de l’ADN. Les structures chimiques du tCo et du 2AP sont beaucoup moins volumineuses que celles des marqueurs Cy3 et Cy5 plus grands et moins susceptibles d’interférer avec la cinétique des enzymes (figure supplémentaire 4). En présence de Mg2+, SpCas9, HypaCas9 et Cas9-HF1 déroulent le substrat d’ADN ciblé avec des taux de décroissance presque identiques (~2 s-1) (Fig. 2). Étonnamment, le taux de décroissance de la formation de la boucle R pour les substrats d’ADN hors cible pour toutes les variantes de Cas9 était également largement inchangé (entre 0,85 s-1 et 2,59 s-1). Par conséquent, le déroulement de l’ADN ne limite pas le taux et n’est pas corrélé avec les taux de clivage observés pour les variants à haute fidélité, contrairement à SpCas9.

Les taux de décroissance de la formation de la boucle R ont été mesurés en suivant l’augmentation de la fluorescence à partir de tCo (position -16 dans le brin non cible) en fonction du temps après avoir mélangé l’enzyme (28 nM) avec l’ADN (10 nM) en présence de 10 mM Mg2+. Les données ont été ajustées à une fonction exponentielle double pour obtenir les taux de décroissance indiqués. a, b SpCas9 (28 nm) avec ADN sur cible (a) et hors cible (b), c, d HypaCas9 avec ADN sur cible (c) et hors cible (d). e, f Cas9-HF1 avec ADN sur cible (e) et hors cible (f).

Compte tenu de l’emplacement du tCo à -16 nt, il est probable que nos mesures reflètent une étape tardive dans le processus de déroulement. À titre de comparaison, nous avons mesuré le taux de décroissance pour la formation de la boucle R en utilisant le tCo marqué à une position immédiatement proximale du PAM (position -1 nt). Après avoir rapidement mélangé l’ARN de Cas9 avec le substrat d’ADN ciblé, nous avons observé une augmentation marquée de la fluorescence lorsque l’ADN déroule l’analogue de base tCo. Nous avons ajusté les données à une double exponentielle pour déterminer le taux de décroissance principal de 10 s-1 (Fig. 3a-f). De manière intrigante, ces résultats indiquent qu’une fois qu’un site PAM est engagé avec l’enzyme, le déroulement initial de l’ADN est plus rapide que celui observé à -16 nt. Ces données suggèrent que le taux de décroissance net du déroulement observé à -16 nt peut être une fonction de plusieurs étapes de déroulement rapide menant au déroulement complet. Cependant, étant donné qu’aucun retard n’a été observé dans la cinétique, il semble que les étapes de déroulement partiel plus rapides et plus précoces mènent à une étape finale limitant le taux de déroulement complet, mesurée à la position -16 nt. Bien que d’autres études soient nécessaires pour examiner les effets des mésappariements aux étapes antérieures du déroulement, notre mesure actuelle fournit la meilleure estimation du taux net de formation de la boucle R. Le taux de décroissance mesuré pour la formation de la boucle R en utilisant ce marqueur est indiscernable à la fois pour SpCas9 et les variantes à haute fidélité sur tous les substrats testés, de sorte que les taux de déroulement de l’ADN semblent être inchangés par les enzymes Cas9 modifiées.

Les taux de décroissance de la formation de la boucle R ont été mesurés en surveillant l’augmentation de la fluorescence à partir de tCo (position -1 dans le brin non ciblé) en fonction du temps après avoir mélangé l’enzyme (28 nM) avec l’ADN (10 nM) en présence de 10 mM Mg2+. Les données ont été ajustées à une fonction exponentielle double pour obtenir les taux de décroissance indiqués. a, b SpCas9 (28 nm) avec de l’ADN sur cible (a) et hors cible (b), c, d HypaCas9 avec de l’ADN sur cible (c) et hors cible (d). e, f Cas9-HF1 avec de l’ADN sur cible (e) et hors cible (f). g Cartoon du réarrangement du domaine HNH. h Le FRETSpCas9 marqué avec la paire Cy3 et Cy5 à C867 et C355, respectivement, a été utilisé pour mesurer le mouvement du domaine HNH pendant le clivage des substrats on-target.

Pour corréler les taux de formation de la boucle R avec les étapes impliquées dans l’amarrage du domaine HNH sur le brin cible, nous avons mesuré le changement conformationnel de l’enzyme en utilisant une analyse à flux arrêté sur une Cas9 qui a été marquée avec Cy3 et Cy5 comme décrit précédemment18. En bref, une version allégée en cystéine de Cas9 a été marquée avec Cy3 à l’acide aminé 355 et Cy5 à l’acide aminé 867. L’efficacité FRET augmente lorsque le domaine HNH se réarrange à l’état catalytiquement actif (Fig. 3g). Après avoir rapidement mélangé le Cas9 marqué par paires FRET avec un ADN cible parfaitement adapté, nous avons observé une augmentation de l’efficacité FRET, indiquant que le domaine HNH se réarrangeait pour atteindre un état catalytiquement actif. Nous avons mesuré que le taux de décroissance de l’amarrage du domaine HNH était de ~2,5 s-1 (Fig. 3h), ce qui est similaire aux mesures FRET de molécules uniques. Étonnamment, les taux observés de la formation de la boucle R (1,5 s-1) et de l’accostage du domaine HNH sont très similaires, ce qui indique que ces étapes peuvent être cinétiquement liées. Le taux de décroissance légèrement plus rapide observé pour le mouvement du domaine HNH pourrait être dû à la réaction inverse, car le mouvement du domaine arrive à l’équilibre après ou en même temps que la formation de la boucle R.

Les taux de décroissance du déroulement de l’ADN ont également été mesurés à l’aide de méthodes à molécule unique en utilisant un ADN marqué par une paire FRET, Cy3 et Cy5 ont été marqués sur la position -6 nt du brin cible et -16 nt sur le brin non cible, respectivement16. Par conséquent, nous avons également testé les substrats d’ADN appariés par FRET pour tenter de corréler le signal FRET avec les taux de clivage de l’ADN observés. Tout d’abord, nous avons testé le substrat précédemment utilisé dans les études de molécules uniques sans les marqueurs Cy3/Cy516, qui présente une différence de deux nucléotides avec notre substrat, plus précisément, une substitution T aux positions -16 et -18. Le taux de décroissance du clivage du brin cible (HNH) est similaire à celui de notre substrat (0,7 s-1 contre 1 s-1, figure supplémentaire 5a), le contexte de la séquence à cette position n’a donc pas d’effet significatif. Nous avons également testé le clivage avec de l’ADN marqué Cy3/Cy5 avec cette autre séquence, et il a montré un taux de décroissance similaire à celui de notre séquence (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, figures supplémentaires 5b et 6a). Ensuite, nous avons examiné l’évolution temporelle du clivage du brin cible (HNH) de l’ADN marqué au Cy3/Cy5 avec notre séquence pour chaque enzyme (figure supplémentaire 6). Avec SpCas9, la réaction de l’ADN marqué Cy3/Cy5 suit une exponentielle unique avec un taux de décroissance nettement réduit (0,06 s-1 vs 1 s-1), montrant une diminution d’environ 17 fois du taux de décroissance observé pour le clivage de l’ADN par rapport au substrat non marqué. Les protéines modifiées HypaCas9 et Cas9-HF1 ont également présenté des taux de clivage de l’ADN réduits de 0,0046 s-1 et 0,0016 s-1, respectivement, ce qui est 5,9 fois et 28,75 fois plus lent que les substrats non marqués mesurés dans des conditions identiques. Il est clair que l’interférence des marqueurs Cy3/Cy5 modifie l’effet des variantes à haute fidélité sur les taux de clivage de l’ADN. Dans l’ensemble, le marquage de l’ADN avec des marqueurs volumineux Cy3 et Cy5 a eu un impact considérable sur l’enzyme. Pour ces raisons, aucune autre étude n’a été réalisée en utilisant l’ADN marqué par une paire FRET.

La spécificité de Cas9 est régie par le partitionnement cinétique

Puisque la spécificité de l’enzyme est une fonction de toutes les étapes menant à la première étape largement irréversible, tous les événements précédant le clivage de l’ADN doivent être considérés17. Pour mesurer la vitesse de clivage intrinsèque, nous avons contourné l’étape de formation de la boucle R, qui limite normalement la vitesse, en pré-incubant SpCas9 avec de l’ADN hors cible en l’absence de Mg2+ pour permettre à la liaison et aux changements de conformation de s’équilibrer pour former un complexe SpCas9.ADN. Nous avons ensuite initié la réaction chimique par l’ajout de 10 mM de Mg2+. Dans nos études précédentes, la formation de la boucle R limitait la vitesse de réaction de SpCas9 avec l’ADN ciblé, et la vitesse de décroissance du clivage intrinsèque était plus rapide lorsqu’elle était mesurée à l’aide du protocole de préincubation. Ici, avec l’ADN hors cible, les taux de clivage du HNH et du RuvC ont été mesurés à 0,12 s-1 et 0,14 s-1, respectivement (figures supplémentaires 7c, d, et figure supplémentaire 8), ce qui est beaucoup plus lent que les taux de formation de la boucle R. De manière intrigante, ces résultats montrent que l’étape limitant la vitesse dans la voie enzymatique de SpCas9 avec un hors cible est le clivage de l’ADN puisque le taux de décroissance pour la formation de la boucle R que nous avons mesuré était de 0,85 s-1 (Fig. 2b). Ces données indiquent que la discrimination est basée, au moins en partie, sur un changement dans l’identité de l’étape limitant la vitesse en comparant l’ADN on- et off-target.

Nous avons répété ces expériences avec HypaCas9 et Cas9-HF1 avec de l’ADN on- ou off-target. Ces résultats définissent des taux observés pour le clivage HNH de 0,035 s-1 et 0,0023 s-1 pour HypaCas9 avec des substrats on- et off-target, respectivement (Supplementary Fig. 7g, k). Les taux de clivage observés de Cas9-HF1 pour les substrats on- et off-target ont été mesurés à 0,038 s-1 et 0,00014 s-1, respectivement (Supplementary Fig. 7o, q). Ces taux de clivage observés sont un peu plus rapides que ceux mesurés avec l’ajout simultané d’ADN et de Mg2+, ce qui indique qu’une étape autre que la formation de la boucle R mais précédant le clivage de l’ADN peut ralentir le taux de décroissance observé. Néanmoins, ces résultats montrent que les taux de clivage observés pour l’ADN ciblé sont réduits d’environ 100 fois pour HypaCas9 et Cas9-HF1 par rapport à SpCas9. Pour l’ADN hors cible, les taux de clivage observés sont réduits de 50- ou 860-fois pour HypaCas9 ou Cas9-HF1, respectivement, par rapport à SpCas9.

La discrimination n’est pas définie uniquement par les taux relatifs de clivage de l’ADN. Plutôt, parce que la formation de R-loop est rapide, la discrimination est une fonction de la partition cinétique entre les taux de libération de l’ADN par rapport au clivage17,26,27. Afin de quantifier la répartition cinétique, nous avons incubé l’enzyme et l’ADN marqué en l’absence de Mg2+, ce qui permet à la formation de la boucle R d’atteindre l’équilibre, mais empêche la catalyse15. Nous avons ensuite ajouté du Mg2+ pour initier la réaction en présence d’un grand excès d’ADN cible identique et non marqué pour servir de piège. La comparaison entre les expériences parallèles réalisées en présence et en l’absence du piège à ADN permet d’estimer le partage cinétique fractionnel pour la dissociation par rapport au clivage de l’ADN lié (Fig. 4a). Une fois SpCas9 lié à l’ADN ciblé, il a été clivé rapidement et le piège à ADN a eu peu d’effet (Fig. 4b). En revanche, 33 % de l’ADN hors cible s’est dissocié de l’enzyme, tandis que 67 % de l’ADN était engagé dans le clivage (Fig. 4c et Fig. 9a supplémentaire). Ces résultats montrent que SpCas9 discrimine l’ADN mal apparié PAM-distal en diminuant le taux de clivage, ce qui augmente la fraction d’ADN qui est libérée plutôt que clivée. Cependant, l’effet est faible, de sorte que le taux de dissociation semble être plus lent que le clivage.

a Schéma de l’expérience de piège à ADN. b, c Clivage par SpCas9 de l’ADN sur la cible (d’après Gong et al.15) (b) ou hors cible (c). d, e Clivage par HypaCas9 de l’ADN sur cible (d) ou hors cible (e). f, g Clivage par Cas9-HF1 de l’ADN sur cible (f) ou hors cible (g). L’enzyme (28 nM) et l’ADN marqué (10 nM) ont été incubés en l’absence de Mg2+ et la réaction a été initiée par l’ajout de Mg2+ en présence ou en l’absence d’un excès de piège à ADN non marqué. A- et A◦ représentent l’amplitude avec (cercles remplis) et sans piège (cercles ouverts), respectivement. Le pourcentage indique la fraction d’ADN pré-lié engagée à aller de l’avant pour le clivage par rapport à la réaction en l’absence de piège.

Puis, nous avons examiné le partitionnement cinétique pour HypaCas9 et Cas9-HF1 liés à l’ADN on-target (Fig. 4d, f, Fig. 9b, d supplémentaires). Nos résultats avec HypaCas9 et Cas9-HF1 montrent que ~75% et ~92% de l’ADN on-target a été clivé en présence du piège, respectivement. Le pourcentage de clivage est inférieur à celui de la protéine SpCas9 de type sauvage, car la vitesse de décomposition intrinsèque observée pour l’ADN ciblé par HypaCas9 (0,035 s-1) et Cas9-HF1 (0,038 s-1) était 100 fois plus lente que celle de SpCas9 (4,3 s-1). Ce taux de clivage plus lent donne le temps à une petite fraction (8 à 25 %) de l’ADN sur cible de se dissocier avant d’être clivé.

Le partitionnement cinétique pour favoriser la dissociation a été renforcé lorsque HypaCas9 et Cas9-HF1 réagissent avec l’ADN hors cible car les taux de clivage ont été encore réduits à 0,0023 s-1 et 0,00014 s-1, respectivement (figure 4e, g, figure supplémentaire 9c, e). Ces taux sont 50 à 860 fois plus lents, respectivement, que ceux de SpCas9 sur un substrat hors cible. Par conséquent, seuls ~24 % et ~10 % de l’ADN hors cible lié ont été engagés à aller de l’avant pour le clivage par HypaCas9 et Cas9-HF1, respectivement, en présence d’ADN piège. L’ensemble de ces résultats montre que les variants haute-fidélité développés ont acquis une meilleure spécificité contre l’ADN mal apparié PAM-distal grâce à un taux de clivage nettement réduit, ce qui modifie le partage cinétique pour favoriser la libération plutôt que le clivage du substrat lié pour l’ADN cible et hors cible, mais l’effet est plus important pour l’ADN hors cible. Le calcul des constantes de vitesse de dissociation apparente à l’aide de l’équation (3) montre que les variantes de haute fidélité n’augmentent pas la vitesse apparente de libération de l’ADN (tableau supplémentaire 1).

Par contre, la discrimination accrue est entièrement attribuée aux diminutions de la constante de vitesse apparente pour le clivage.

Dans nos descriptions de la cinétique des enzymes Cas9 jusqu’à présent, les taux de décroissance observés des réactions ont été estimés sur la base de l’ajustement des données aux fonctions exponentielles, qui donnent des valeurs propres qui sont généralement des fonctions complexes de plusieurs constantes de vitesse17. Afin de comprendre pleinement la cinétique et le mécanisme, toutes les expériences pour chaque enzyme et substrat d’ADN ont été ajustées globalement sur la base de l’intégration numérique des équations de taux à l’aide d’un seul modèle unifié (figure 5 et figures supplémentaires 10-14). L’ajustement global des données montre que notre modèle minimal (Fig. 5f, encart) tient compte de nos données et que chacune des constantes de vitesse est bien définie d’après l’analyse des contours de confiance testant la mesure dans laquelle chaque paramètre est contraint par les données (Fig. 6)17,28. Il faut noter en particulier que notre modèle tient compte des traces biphasiques observées dans certaines expériences sans avoir à invoquer l’hétérogénéité, et qu’il fournit des constantes de vitesse intrinsèques pour chaque étape de la voie, y compris la formation de la boucle R et les événements de clivage du HNH et du RuvC. Bien qu’il soit probable que d’autres réarrangements structurels non résolus soient nécessaires pour l’alignement des résidus catalytiques pour le clivage de l’ADN, ceux-ci n’ont pas encore été résolus comme des événements cinétiquement distincts. Le modèle actuel représente une voie minimale nécessaire et suffisante pour rendre compte de toutes les données disponibles, et peut être facilement étendu à mesure que de nouvelles informations deviennent disponibles pour définir des étapes supplémentaires dans la voie.

a Clivage initié par l’ADN et le Mg2+ par le domaine HNH. b Clivage initié par l’ADN et le Mg2+ par le domaine RuvC. c Taux de formation de la boucle R. d Clivage initié par le Mg2+ par le domaine HNH. e Clivage initié par le Mg2+ par le domaine RuvC. f Effet du piège à ADN sur la partition cinétique du clivage de Cas9. Toutes les courbes ont été calculées sur la base de l’ajustement global aux données selon le modèle cinétique (encadré), avec les constantes de vitesse indiquées dans le tableau 1. Les estimations d’erreur ont été basées sur l’analyse des contours de confiance, comme le montre la figure 6. E est Cas9.gRNA, D est l’ADN cible, ED est Cas9.gRNA.ADN, EDH est la formation d’une boucle R avec fixation du brin cible à HNH, EDHR et EDP1R sont la formation d’une boucle R avec fixation du brin non cible à RuvC, EDHP2 est le clivage par RuvC du brin non cible, EDP1 est le clivage par HNH du brin cible, EDP1P2 est le clivage des deux brins, Dtrap est un excès d’ADN non marqué, parfaitement apparié. EDtrap est Cas9.gRNA.DNAtrap.

Les contours de confiance sont montrés pour l’ajustement des données de la Fig. 5. Les constantes de vitesse numérotées sont définies dans notre modèle cinétique (Fig. 5f, encart). Le seuil de χ2 (ligne pointillée) a été fixé à 0,99 pour définir les limites supérieure et inférieure de chaque constante de vitesse, comme décrit17,32. Comme les contours étaient symétriques avec des paramètres bien contraints, nous rapportons les limites d’erreur ± dans le tableau 1. Pour cette analyse, un seuil de χ2 a été calculé en utilisant une distribution F et a été utilisé pour définir les limites inférieures et supérieures pour chaque paramètre.

Pour comprendre la spécificité d’une enzyme, les constantes de vitesse doivent être interprétées dans le contexte de toutes les étapes cinétiquement pertinentes, comme illustré dans le profil d’énergie libre (calculé en utilisant l’équation. (4) à partir des constantes de vitesse du tableau 1).

Le coefficient de transmission A = 0,001

Parce que l’ajustement global des données fournit les constantes de vitesse pour chaque étape pertinente (figures 5 et 6), nous pouvons construire un profil d’énergie libre de bonne foi (figure 7b, et figures supplémentaires 10-14). Les profils d’énergie libre comparant SpCas9, HypaCas9 et Cas9-HF1 montrent un changement dans les étapes limitant la vitesse et déterminant la spécificité. La spécificité de l’enzyme est définie par kcat/Km et est donnée par la barrière globale la plus élevée par rapport à l’état de départ, tandis que la vitesse maximale, kcat, est définie par la barrière locale la plus élevée par rapport à l’état précédent, atténuée par toute étape d’équilibre rapide précédente. Étant donné que les constantes de vitesse pour la formation de la boucle R ne changent pas de manière significative avec différents substrats et variantes de l’enzyme, la spécificité est régie en grande partie par la partition cinétique de la boucle R de Cas9, l’état EDH dans notre modèle cinétique (Fig. 5f, encart), soit pour aller de l’avant, ce qui entraîne un clivage irréversible, soit pour se libérer via le ré-annexion de l’ADN et l’éjection de l’enzyme. Les barrières globales plus élevées pour le clivage observées avec les variantes de haute fidélité augmentent la probabilité de partitionnement cinétique pour favoriser la dissociation de l’ADN (Fig. 6c).

a Représentation cartoon de la voie de réaction des enzymes Cas9. b Profils d’énergie libre pour le clivage SpCas9 d’une cible (ligne grise) de Gong et al.15 et hors cible (ligne rouge), respectivement ; le clivage HypaCas9 d’une cible hors cible (ligne bleue) ; et le clivage Cas9-HF1 d’une cible hors cible (ligne noire). Chaque profil a été calculé à l’aide de la théorie de l’état de transition en utilisant les constantes de vitesse et d’équilibre qui ont été dérivées de l’ajustement global de chaque série d’expériences (tableau 1). Notez que les barrières plus élevées pour le clivage de l’ADN par rapport à la barrière plus faible pour la réaction inverse précédente augmentent la probabilité de libération de l’ADN. c Graphique à barres récapitulatif pour k2, k3 et le partage cinétique (P).

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