Fungi examined

Les isolats d’Escovopsioides ont été obtenus à partir de jardins de champignons de différentes espèces de fourmis coupeuses de feuilles et non coupeuses de feuilles collectées dans des études antérieures . Cette collection comprend 20 isolats obtenus à partir de Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi et Trachymyrmex tucumanus, en plus de l’espèce type de E. nivea obtenue à partir de Acromyrmex subterraneus subterraneus (Tableau 3). De plus, un isolat supplémentaire a été obtenu à partir d’une colonie de fourmis non coupeuses de feuilles Apterostigma megacephala trouvée à Parauapebas, Pará, Brésil (Tableau 3). Tous les isolats présentaient les caractéristiques morphologiques décrites du genre Escovopsioides : colonies hyalines sur PDA, vésicules terminales et intercalaires portant des phialides lagéniformes, conidies hyalines en longues chaînes, aleuroconidies et structures de type chlamydospore .

Les isolats sont conservés sous forme de suspensions de conidies à – 80 °C (dans du glycérol 10%) et dans de l’eau distillée à 10 °C dans la collection du Laboratoire d’écologie et de systématique fongiques (LESF), Rio Claro, État de São Paulo, Brésil. Tous les isolats ont été relancés à partir de stocks en inoculant des conidies conservées sur un milieu PDA et en les incubant pendant 7 jours à 25 °C, dans l’obscurité. Tous les isolats examinés ont été obtenus en tant que cultures monosporiques.

Caractérisation moléculaire d’Escovopsioides

L’ADN génomique a été extrait par la méthode CTAB à partir de cultures cultivées sur de la gélose au malt à 2% (MA2%) pendant 5 jours, dans l’obscurités . Les gènes codant pour tef1 (amorces : EF6-20F et EF6A-1000R), LSU (amorces : CLA-F et CLA-R) ainsi que ITS (amorces : ITS5 et ITS4) ont été amplifiés pour tous les isolats. Pour tef1, 1 μL d’ADN génomique dilué (1:100) a été utilisé comme matrice pour l’amplification à l’aide de billes PCR illustra™ PureTaq Ready-To-Go (GE Healthcare) dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94 °C pendant 2 min, suivie de 15 cycles à 94 °C pendant 30 s et d’une température initiale de recuit à 65 °C diminuant de 1 °C par cycle de toucher et extension finale à 72 °C pendant 1 min. Une deuxième étape de PCR a été réalisée : 94 °C pendant 30 s, suivie de 35 cycles à 94 °C pendant 30 s, 48 °C pendant 30 s et d’une étape d’extension finale à 72 °C pendant 1 min. Pour l’ITS, 2 μL de l’ADN génomique dilué (1:100) ont été utilisés comme matrice pour la PCR, selon les conditions décrites dans Schoch et al. : 94 °C pendant 3 min, suivi de 35 cycles à 94 °C pendant 1 min, 55 °C pendant 1 min et une étape d’extension finale à 72 °C pendant 2 min. Pour LSU, 2 μL d’ADN génomique dilué (1:100) ont été utilisés pour la PCR, selon les conditions décrites dans Augustin et al. : 95 °C pendant 2 min, 40 cycles de 30 s à 95 °C, 60 s à 62 °C, 90 s à 72 °C et 5 min d’extension à 72 °C. Les produits de PCR ont été colorés avec GelRed™ (Biotium) et visualisés sous UV après électrophorèse dans un gel d’agarose à 1%.

Les amplicons ont été purifiés avec le kit de nettoyage de gel et de PCR Wizard® SV (Promega) selon le protocole du fabricant. Les échantillons ont été analysés au NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) et 20 ng d’ADN ont été séquencés à l’aide du kit de séquençage cyclique BigDye™ Terminator v. 3.1 (Thermo Fisher Scientific) en suivant les instructions du fabricant. En raison de la teneur élevée en GC dans la région ITS d’Escovopsioides, 5 % de DMSO ont été ajoutés aux réactions de séquençage. Les séquences avant et arrière ont été générées sur ABI 3500 (Life Technologies) et assemblées en contigs sur BioEdit v.7.1.3 . Les séquences générées dans la présente étude ont été déposées au NCBI-GenBank (fichier additionnel 1 : tableau S1).

Analyse phylogénétique

En plus des séquences générées dans cette étude, les séquences de l’espèce type (E. nivea) ainsi que de six espèces Escovopsis décrites et de huit champignons appartenant aux Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma et Lecanicillium) ont été extraites du NCBI-GenBank. Ainsi, l’ensemble des données utilisées dans cette étude comprenait les séquences de 37 champignons (fichier supplémentaire 1 : tableau S1).

Pour l’analyse phylogénétique, les séquences ont été alignées dans MAFFT . Les séquences de tef1, ITS et LSU ont été concaténées dans Winclada v.1.00.08. L’inférence bayésienne a été utilisée comme algorithme de reconstruction. Le modèle de substitution nucléotidique GTR + G et GTR + I + G a été sélectionné pour tef1 et ITS/LSU, respectivement, en utilisant l’AIC dans jModeltest2 avec un intervalle de confiance de 95%. Ainsi, des analyses indépendantes partitionnées de l’ensemble de données ont été effectuées dans MrBayes, chacune avec trois chaînes chauffées et une chaîne froide. L’échantillonnage MCMC dans chaque analyse a été effectué jusqu’à un million de générations. La convergence des chaînes chauffées et des chaînes froides s’est produite lorsque l’écart-type des fréquences fractionnées était inférieur à 0,01 ; ensuite, les premiers 25 % des générations ont été rejetés en tant que burn-in.

Expériences de double culture

Nous avons effectué des tests in vitro pour vérifier le potentiel antagoniste des Escovopsioides envers le champignon cultivé par les fourmis coupeuses de feuilles. Nous avons sélectionné 13 des 21 isolats d’Escovopsioides (Tableau 3), sur la base des critères suivants : i) tout polymorphisme trouvé dans le gène tef1 ; ii) différentes espèces de fourmis associées ; iii) emplacement géographique (c’est-à-dire différentes villes et sites de collecte). Deux des isolats sélectionnés (LESF 596 et LESF 599) ont déjà été évalués pour leurs interactions avec le cultivar fongique dans l’étude de Varanda-Haifig et al. . Cependant, nous avons reproduit ce test pour le comparer avec d’autres isolats d’Escovopsioides.

Le champignon Leucoagaricus gongylophorus FF2006 cultivé par l’espèce de fourmi Atta sexdens rubropilosa a été utilisé dans les expériences de double culture. Cette souche est maintenue sur des géloses par transferts successifs tous les 24 jours à 25 °C. La production de gongylidia par cette souche est vérifiée à chaque cycle de transfert. Ce champignon a été cultivé sur milieu PDA et incubé à 25 °C pendant 14 jours, à l’obscurité. Après cette période, des fragments mycéliens (8 mm de diamètre) ont été transférés dans de nouvelles boîtes de Pétri (90 × 15 mm) contenant également du PDA, à une distance de 1,5 cm du bord. Ces plaques ont été incubées à 25 °C pendant 14 jours, dans l’obscurité. Ensuite, des fragments de mycélium (8 mm de diamètre) d’Escovopsioides, préalablement incubés sur PDA, ont été inoculés à une distance de 3 cm du champignon mutualiste. Pour comparer les effets des Escovopsioides sur la croissance du mycélium du cultivar fongique avec les effets causés par d’autres champignons, nous avons utilisé un isolat d’Escovopsis sp. (LESF 19) provenant des jardins fongiques d’Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brésil). Cet isolat a été obtenu en inoculant de petits morceaux des jardins de champignons sur du PDA complété par du chloramphénicol. Des plaques témoins ont été inoculées avec le même champignon mutualiste, cependant, aucun Escovopsioides ou Escovopsis n’a été inoculé. Toutes les plaques ont été incubées pendant 14 jours à 25 °C, dans l’obscurité. Chaque combinaison d’Escovopsioides, d’Escovopsis et du champignon mutualiste a été réalisée sur dix plaques. Les plaques expérimentales et de contrôle ont été scannées à intervalles de 0, 2, 3, 5, 7, 10 jours sur un scanner HP Deskjet F2050. Les images ont été utilisées pour mesurer la zone de croissance de la colonie (cm2) du champignon mutualiste dans ImageJ v. 1.38 .

Les zones de croissance mycélienne de L. gongylophorus dans les expériences de double culture ont été analysées à l’aide d’une ANOVA mixte à deux voies, avec les isolats fongiques (Escovopsioides et Escovopsis) par rapport au contrôle comme variable inter-sujet, et le temps (jours) comme variable intra-sujet, considérant ainsi les mesures répétées du temps dans les traitements. Les données ont été vérifiées pour la normalité et l’homogénéité des variances, en utilisant les tests de Shapiro-Wilk et de Levene, respectivement. En raison des violations de ces critères, les données ont été transformées en utilisant le log ou la racine carrée lorsque cela était nécessaire. Les comparaisons multiples avec différents champignons filamenteux ont été réalisées à l’aide du test t avec correction de Bonferroni.

Pour la comparaison entre les isolats, la surface de croissance mycélienne de L. gongylophorus en contact avec les isolats d’Escovopsioides a été divisée par la surface moyenne de son témoin au jour 10. La normalité et l’homogénéité des variances des données ont été vérifiées. Une ANOVA à sens unique a été réalisée avec la surface obtenue au jour 10 entre tous les champignons testés, les comparaisons entre les différents traitements étant effectuées à l’aide du test post-hoc de Tukey-HSD. Les analyses statistiques ont été effectuées dans R v. 2.12.1 .

Tests biologiques sur des fragments de jardins de champignons en l’absence d’ouvriers

Leucoagaricus gongylophorus est cultivé dans les colonies de fourmis attardées dans les jardins de champignons. Pour déterminer si Escovopsioides peut se développer sur le jardin de champignons sans les éventuels effets protecteurs des ouvrières, nous avons effectué des tests biologiques en utilisant des fragments de ce substrat exempts de fourmis. Les fragments de champignonnière ont été obtenus à partir d’une colonie d’A. sexdens rubropilosa mature et saine maintenue au Centre d’études des insectes sociaux (UNESP, Rio Claro). Des fragments de jardin de champignons de 2 cm3 dépourvus de fourmis et de couvain ont été placés dans des boîtes de Pétri stériles avec du coton humide sur les bords (selon Elizondo-Wallace et al.). Avant de réaliser les expériences, les plaques ont été conservées pendant 1 jour à 25 °C pour rechercher les fourmis éventuellement restées dans les fragments.

Nous avons préparé une suspension de 10 mL de Tween 80 à 0,05 % avec la masse mycélienne et les conidies de chacun des 12 Escovopsioides (l’isolat LESF 591 n’a pas été utilisé dans cette expérience) et d’un isolat d’Escovopsis utilisés dans les expériences de double culture. Cette suspension a été filtrée deux à trois fois selon la méthode de Newmeyer pour séparer les conidies des fragments d’hyphes présents dans la suspension. Ensuite, la suspension a été diluée à 105 à 2,105 conidies mL-1déterminées dans une chambre de Neubauer. Des aliquotes de 100 μL de suspensions de conidies ont été inoculées sur la surface du fragment de jardin à l’aide d’une micropipette. La même quantité de solution stérile de Tween 80 à 0,05 % a été ajoutée sur la surface du jardin dans le contrôle négatif. Les boîtes de Pétri contenant le jardin de champignons ont été conservées à 25 °C pendant 10 jours maximum, cinq boîtes étant utilisées pour chaque traitement et cinq boîtes pour chaque contrôle respectif. Le développement éventuel des hyphes des champignons inoculés a été observé quotidiennement sur un stéréomicroscope (EZ4, Leica). La conidiation d’Escovopsioides sur les jardins de champignons a été observée en prenant des fragments de mycélium se développant sur les jardins et montés dans l’eau et observés au microscope (DM500, Leica).

Les données de croissance et de conidiation sur les jardins de champignons ont été notées comme : pas de croissance (score 0), croissance observée uniquement au stéréomicroscope (score 1), croissance macroscopique (score 2) et conidiation (score 3) sur 10 jours de suivi (fichier additionnel 1 : Figure S1). Nous avons observé la conidiation uniquement après la croissance macrocospique du champignon sur les jardins de champignons. La somme totale des scores de cinq boîtes de Pétri chaque jour a été obtenue et transformée en termes de pourcentage du total maximal possible pour des comparaisons directes.

Effets d’Escovopsioides sur les jardins avec des travailleurs

Les travailleurs antiques ont un rôle important dans la défense de la colonie contre les agents pathogènes et les microbes indésirables dans les jardins de champignons . Ainsi, nous avons réalisé des expériences pour vérifier l’influence des travailleurs dans les jardins de champignons inoculés avec des conidies des mêmes champignons utilisés dans les bioessais sur le jardin de champignons en l’absence de travailleurs de fourmis (12 isolats Escovopsioides et 1 isolat Escovopsis).

Les bioessais utilisant des colonies de fourmis queen-right sont un défi en raison du grand nombre de colonies que ce type d’expérience exigerait. Ainsi, nous avons réalisé des bioessais avec des fragments de jardins contenant des ouvriers pour évaluer les effets des isolats fongiques in vivo. Bien que ce montage expérimental ne représente pas ce qui se passe dans les colonies naturelles, il a montré des informations indicatives sur l’action défensive des ouvrières contre les champignons testés. Ce bio-essai a été adapté en suivant la méthode d’Elizondo-Wallace et al. . Des récipients en plastique avec une petite couche de plâtre dans le fond ont été utilisés pour éviter la dessiccation des jardins de champignons. Environ 20 cm3 de jardin de champignons provenant de la même colonie que celle utilisée dans l’expérience précédente ont été placés dans les récipients en plastique. Le dispositif expérimental comprenait un total de 84 récipients, de sorte que les traitements avec les conidies des 13 champignons et le contrôle avaient chacun six récipients. Nous avons sélectionné des fourmis ouvrières dont le diamètre de la capsule céphalique était compris entre 1,0 et 1,6 mm, puis nous avons placé 50 de ces ouvrières dans chaque récipient. Les ouvrières de moins de 1,0 mm n’ont pas été comptées, et celles de plus de 1,6 mm ont été exclues. Cette procédure a été adoptée pour permettre l’homogénéité entre les six conteneurs de chaque traitement ainsi qu’entre les traitements, car les ouvrières dans l’intervalle entre 1,0 et 1,6 mm ont une activité de nettoyage significative . La surface intérieure du récipient a été recouverte de Teflon® pour empêcher les fourmis de s’échapper.

Les récipients ont été incubés à 25 °C pendant 3 jours pour stabiliser les jardins de champignons. Les suspensions de conidies ont été obtenues comme décrit ci-dessus. Un total de 1 mL de suspension de conidies a été pulvérisé sur la surface des jardins de champignons à l’aide d’un pulvérisateur. Les jardins de champignons du contrôle négatif ont été pulvérisés avec seulement1 mL de solution stérile de Tween 80 à 0,05%.

Les expériences ont été suivies après 0, 5 et 10 jours d’inoculation pour vérifier la santé des jardins de champignons. Ce paramètre était basé sur un système de notation, dans lequel les jardins sains recevaient le score 0, les jardins partiellement dégradés le score 1 et les jardins complètement dégradés (« infectés ») le score 2. L’enlèvement par les fourmis des morceaux de jardins fongiques et leur affectation aux décharges d’ordures était le principal signe de détérioration des jardins que nous avons examiné (voir Fichier supplémentaire 1 : Figure S2). Les scores obtenus dans les six conteneurs de chaque expérience, sur les 3 jours d’observation, ont été comparés à l’aide du test de Friedman.

Pour vérifier la présence des isolats d’Escovopsioides sur les jardins de champignons les jours 0, 5 et 10 après le traitement, des fragments ont été retirés des jardins et inoculés sur du MA2% complété par 150 μg mL- 1 de chloramphénicol. Les plaques ont été incubées à 25 °C pendant 7 jours, dans l’obscurité. Cinq plaques avec un fragment de jardin ont été utilisées pour chacun des six conteneurs de chaque traitement, soit un total de 30 plaques par traitement. Les fragments présentant une croissance positive ont été comptés et la présence à long terme des champignons inoculés dans les jardins fongiques a été testée à l’aide du test exact de Fisher. Dans cette analyse, nous avons comparé la proportion de frangments infectés par des conidies de champignons (Escovopsioides et Escovopsis) par rapport au contrôle sans aucune conidie pour chaque jour d’expérience. Nous avons également comparé les différents traitements avec des champignons inoculés entre eux pour chaque jour de l’expérience.