Abstract

L’infection chronique active du virus d’Epstein-Barr (CAEBV) est une maladie grave avec une activation inhabituelle de l’EBV qui persiste pendant des années, et sa pathogenèse est largement inconnue. Après la création d’un système de réaction en chaîne par polymérase précis et reproductible pour quantifier l’ADN de l’EBV, les charges virales dans les lymphocytes du sang périphérique (PBL) ont été déterminées chez 54 enfants : 15 atteints de CAEBV, 16 de mononucléose infectieuse (MI) et 23 enfants en bonne santé. Les enfants atteints de CAEBV et ceux atteints de MI avaient des charges virales élevées. Des charges plus faibles ont été détectées chez 47 % des donneurs sains séropositifs. Il y avait deux différences distinctes entre les enfants atteints de CAEBV et ceux atteints de MI : Les premiers présentaient une réplication virale plus importante (103-107 copies/PBL)2,5 × 105 PBL) que ceux atteints de MI, et la réplication virale déclinait chez les enfants atteints de MI alors que la réplication active persistait pendant des années chez les sujets atteints de CAEBV. La persistance de charges virales élevées est un critère de diagnostic possible pour le CAEBV. Les charges virales peuvent permettre la classification et le pronostic des infections à EBV.

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est un agent causal de la mononucléose infectieuse (MI) et de l’infection chronique active à EBV (CAEBV). La CAEBV est une maladie grave avec une activation inhabituelle de l’EBV qui peut être fatale avec une défaillance de plusieurs organes, et elle est associée à un lymphome malin sans immunosuppression préalable. Les symptômes cliniques du CAEBV et les anomalies sérologiques correspondant à une réplication active de l’EBV, telles qu’une élévation marquée des anticorps anti-EA-DR et l’absence d’anticorps antigène nucléaire d’Epstein-Barr (EBNA), persistent pendant des mois, voire des années. L’EBV se réplique dans les cellules NK, T et B.

Une fois l’infection établie, l’EBV réside généralement dans les lymphocytes B pendant toute la vie de l’hôte sans provoquer de symptômes cliniques (on parle d’infection latente). Pour clarifier l’état de la réplication de l’EBV chez les personnes atteintes du CAEBV, nous avons utilisé l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) semi-quantitative de l’ADN pour évaluer et comparer les charges virales dans les lymphocytes du sang périphérique (PBL) de trois groupes d’enfants : un groupe atteint du CAEBV, un groupe atteint de la MI et des témoins sains. Notre système de détection a été considéré comme précis et fiable pour la quantification de l’EBV car nous avons amplifié une région à copie unique de l’EBV. La plupart des études précédentes ciblaient la région BamHI-W pour laquelle la fréquence de réitération des répétitions en tandem est inconstante. Nous pensons que cette étude est la première et la plus grande étude à l’échelle des charges virales dans les PBL des enfants atteints de CAEBV.

Matériels et méthodes

Patients et témoins

Nous avons examiné 16 enfants atteints de MI (11 garçons, 5 filles ; âges, 0-8 ans), 15 atteints de CAEBV (11 garçons, 4 filles ; âges, 4-19 ans), 19 personnes séronégatives immunocompétentes en bonne santé (10 garçons, 9 filles ; âges, 1-19 ans) et 4 enfants séronégatifs en bonne santé (3 garçons, 1 fille ; âges, 1-10 ans). Tous les sujets atteints de MI présentaient des manifestations cliniques typiques (par exemple, fièvre, amygdalite, lymphadénopathie, hépatosplénomégalie, dysfonctionnement hépatique et lymphocytose atypique). Le diagnostic de la MI a été posé sur la base des résultats sérologiques de l’anticorps IgM contre l’antigène de la capside virale (ACV) ou de la séroconversion de l’IgG et/ou de l’EA de l’ACV et de l’anticorps EBNA négatif. Vingt-deux échantillons de sang ont été prélevés chez 16 enfants atteints de MI 8 jours à 8 mois après le début de la maladie (le symptôme initial était la fièvre chez tous les patients). Le CAEBV a été diagnostiqué selon les critères de Rickinson. Les enfants atteints de CAEBV avaient une fièvre intermittente ou persistante pendant >16 mois, avec une hépatosplénomégalie, une lymphadénopathie et/ou une éruption cutanée. Les résultats de laboratoire ont montré des taux élevés de transaminases, une anémie, une thrombocytopénie et/ou une hypergammaglobulinémie polyclonale. L’examen sérologique a révélé une élévation marquée des titres d’anticorps anti-VCA et anti-EA. L’infection par le virus de l’immunodéficience humaine et les maladies rhumatismales ont été exclues. Aucun sujet n’avait subi de transplantation ni de traitement anticancéreux.

Échantillons

Des échantillons de sang périphérique de 2 ml héparinés ont été prélevés. Les PBL ont été isolés par ficoll-hypaque et lysés avec 0,15 μg/μL de protéinase K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis) ; l’ADN a été extrait par précipitation phénol-chloroforme-éthanol. L’ADN extrait a été quantifié par spectrophotomètre, ajusté à 0,25 μg/μL d’ADN, et utilisé comme modèle de PCR.

Sensibilité de la PCR

L’ADN d’EBV provenait de trois sources : Raji, contenant 50 copies d’EBV par cellule ; Akata, contenant 20 copies par cellule ; et des fragments BamHI-L clonés, qui ont été mélangés à de l’ADN provenant de cellules de sang de cordon et utilisés comme standard positif. Pour déterminer la sensibilité du système PCR, des dilutions sérielles de 10 fois (10°-104 copies d’EBV) de l’ADN extrait ont été soumises à la PCR.

PCR

Une double PCR emboîtée a été conçue pour amplifier la région conservée codant pour la gp220 (dans le fragment BamHI-L) . La paire d’amorces extérieure amplifie un fragment de 302 pb, en utilisant les oligonucléotides 5′-GCGAACTGGTGGACATGA et 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA, correspondant aux positions 2870-3171 de B95-8 (GenBank M10593). La paire interne amplifie un fragment de 239 pb . La PCR a été réalisée dans une réaction de 50-μL contenant 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTP, 0,5 μM de chaque amorce, 2,5 U d’ADN polymérase Taq (Boehringer-Mannheim) et 4 μL d’ADN échantillon. Les produits amplifiés ont été passés sur de l’agarose à 2 % et colorés avec du bromure d’éthidium, et le transfert de Southern a été utilisé pour confirmer la spécificité en utilisant le fragment BamHI-L comme sonde . Chaque réaction PCR a été effectuée en triplicata et comprenait le contrôle négatif pour exclure toute contamination croisée. Pour confirmer la spécificité de la PCR, on a analysé l’ADN du virus de l’herpès simplex de types 1 et 2, du virus de la varicelle et du zona, du cytomégalovirus humain et des herpèsvirus-6 et -7. Aucune amplification spécifique n’a été notée.

Quantification du génome EBV

La quantité d’ADN EBV dans les PBL a été déterminée par des expériences de dilution limitante. Des dilutions sérielles de 10 fois (1-10-6μg) d’ADN génomique extrait de chaque échantillon d’ADN ont été soumises à la PCR nichée comme décrit ci-dessus, et la limite minimale du résultat positif a été convertie en charge virale (copies/2,5 × 105 cellules).

Résultats

La sensibilité du système PCR a été soigneusement déterminée par des dilutions de 10 fois des trois sources d’ADN EBV : Raji et Akata, contenant toutes deux un nombre constant de copies d’ADN EBV par cellule, et le fragment BamHI-L cloné. Raji contient 50 copies du génome EBV par cellule, et 1 μg d’ADN génomique provenant de cellules de Raji équivaut à celui extrait de 2,5 × 105 cellules, soit 1,25 × 107 copies d’ADN EBV. L’ADN de Raji a été dilué de façon appropriée et l’ADN contenant 10n copies (dilutions sérielles de 10°-104 copies du virus) a été soumis à une amplification. La limite minimale pour un résultat PCR positif a été examinée. Des examens répétés ont révélé que la sensibilité était de 100 copies par réaction avec une bonne reproductibilité. Les résultats étaient les mêmes en utilisant l’ADN d’Akata et avec l’expérience de dilution utilisant 10n copies de fragments BamHI-L mélangés avec 105μg, 102μg et aucun ADN de cellules de sang de cordon.

Tous les PBL des sujets atteints de MI et de CAEBV étaient positifs pour le génome EBV. Neuf (47 %) des 19 échantillons provenant de personnes saines séropositives pour l’EBV étaient positifs. Tous les PBL de personnes séronégatives étaient négatifs.

L’ADN de l’EBV dans les PBL a été quantifié et comparé pour les contrôles sains séropositifs à l’EBV, les enfants atteints de MI et les enfants atteints de CAEBV (figure 1). Chez les enfants sains séropositifs pour l’EBV, les charges virales étaient de 100 à 1000 copies par 2,5 × 105 PBL. Dans les PBL des enfants atteints de MI, les limites les plus basses des résultats positifs de la PCR allaient de 10° μg (2,5 × 105 PBL) à 10∼3μg (2,5 × 102/PBL)d’ADN génomique, ce qui indique que la charge virale était de 100-100 000 copies/2,5 × 105 PBL. Trois échantillons de sang prélevés dans le mois suivant le début de la maladie hébergeaient des charges plus élevées (1000-100 000 copies/2,5 × 105 PBL). Les PBL prélevés >11 mois après le début de la MI avaient tendance à contenir des quantités moindres de virus. Nous avons suivi les charges virales chez 4 patients IM (figure 2A). Chez tous les 4, les charges virales ont diminué au cours de l’évolution clinique mais étaient plus élevées (100-10 000 copies/2,5 × 105 PBL) que chez les hôtes sains séropositifs.

Les PBL des enfants atteints de CAEBV avaient plus d’ADN EBV que les échantillons des enfants atteints de MI. Quatre patients CAEBV ont été suivis pendant >16 mois (la figure 2B illustre les résultats pour 2 patients). Deux autres patients ont présenté des charges virales inchangées pendant 2 à 3 ans (105 et 106 copies/2,5 × 105 PBL, respectivement). Tous ces patients présentaient des charges virales élevées et persistantes, contrairement aux résultats obtenus avec la MI. Lorsque nous avons examiné la relation entre les manifestations cliniques et les charges EBV, seule la fièvre était corrélée à la charge virale. Il n’y avait pas de corrélation avec l’hépatosplénomégalie, la lymphadénopathie, l’exanthème, l’allergie aux moustiques, le dysfonctionnement hépatique, l’anémie, la thrombocytopénie ou les titres d’anticorps sériques contre l’ACV, l’EA-DR et l’EBNA.

Discussion

La PCR quantifiant l’ADN de l’EBV a démontré que les PBL des enfants atteints de CAEBV ou d’IM avaient des charges virales élevées, indiquant une réplication active de l’EBV dans les lymphocytes. La réplication virale a été considérée comme plus active dans le CAEBV que dans l’IM ; dans le groupe IM, la réplication a progressivement diminué, alors que la réplication active a persisté pendant des années chez les patients CAEBV.

Notre système PCR amplifie les séquences spécifiques de l’EBV codant pour la gp220, qui est un gène à copie unique dans un virus, alors que les études précédentes ciblaient la répétition interne longue située dans la région BamHI-W. Puisque dans la prolifération polyclonale de l’EBV, le nombre de répétitions de cette région est inconstant, notre système est considéré comme plus précis pour quantifier l’EBV, bien que moins sensible pour la détection. Le défaut de la faible sensibilité a été surmonté par l’utilisation de la PCR nichée. La sensibilité était de 100 copies par réaction, contre 10 copies dans le rapport précédent. Nous avons quantifié les génomes EBV dans les PBL par la dilution en série de l’ADN extrait. Notre système de quantification de l’ADN de l’EBV par dilutions en série de l’ADN extrait s’est avéré reproductible et fiable.

Les PBL recueillies auprès d’enfants atteints de MI et de CAEBV hébergeaient de plus grandes quantités du génome de l’EBV que les PBL des témoins séropositifs sains. Parmi ces derniers, 47 % avaient un ADN EBV détectable (100-1000/2,5 × 105 PBL). Chez deux sujets, l’EBV a été détecté à des niveaux plus élevés que dans les études précédentes (1-50/106 PBL). Puisque nous avons étudié des enfants, les périodes plus courtes après la primo-infection peuvent contribuer aux charges EBV plus élevées que celles observées dans les études précédentes sur les adultes, nous rappelant que, en particulier chez les enfants, les résultats positifs de la PCR incluent une infection EBV latente asymptomatique.

Les enfants atteints de MI avaient de grandes quantités d’EBV. Les charges d’EBV ont atteint un pic dans le mois suivant l’apparition des symptômes (1000-100 000 copies/2,5 × 105 PBL), puis ont progressivement diminué mais sont restées élevées plusieurs mois (⩽8) après l’apparition des symptômes, par rapport aux niveaux des témoins sains. Même lorsque les manifestations cliniques ont disparu, des niveaux relativement élevés de réplication de l’EBV ont continué dans les PBL.

Les patients atteints de CAEBV présentaient de manière persistante de grandes quantités d’EBV, ce qui suggère que la réplication active chronique non régulée de l’EBV dans les PBL entraîne une maladie grave avec un mauvais pronostic. Les facteurs et les mécanismes qui conduisent à la réplication virale étonnamment active restent peu clairs. Diverses déficiences hétérogènes dans les systèmes de défense de l’hôte de l’immunité humorale et cellulaire ont été décrites et pourraient permettre une réplication virale active. Une charge virale élevée dans les PBL (>1300 000 EBV/105 PBL) a été mise en évidence dans la maladie lymphoproliférative post-transplantation (PTLD) associée à l’EBV, une complication après les transplantations, bien que les charges virales aient diminué en un an parallèlement à la récupération de l’immunosuppression. Une différence quantitative dans la charge d’EBV circulant était corrélée avec le niveau d’anticorps EBNA dans la PTLD mais pas dans le CAEBV. Par conséquent, le comportement de l’EBV dans la PTLD a été considéré comme étant à la fois similaire et différent de celui de la CAEBV. Au vu des manifestations cliniques, le CAEBV semble similaire au syndrome lymphoprolifératif lié à l’X (XLP), dont le gène responsable a été récemment identifié. Cependant, contrairement au syndrome XLP, le CAEBV n’est pas une maladie héréditaire, et les femmes peuvent être touchées. Une analyse immunologique plus approfondie du CAEBV est nécessaire pour clarifier les facteurs de prédisposition à l’activation virale.

L’acyclovir, l’interféron-α et l’interleukine-2 ont été utilisés pour traiter le CAEBV – avec des résultats insatisfaisants . Nos résultats indiquent que les médicaments cytotoxiques qui induisent une immunosuppression et renforcent l’activation virale doivent être choisis avec soin, bien que les caractéristiques cliniques soient similaires à celles des hémopathies malignes. La persistance de charges EBV élevées dans les PBL est un critère de diagnostic possible pour le CAEBV et peut être utile pour surveiller l’activité de la maladie, pour classer la maladie et pour prédire le pronostic.

Remerciements

Nous remercions George Klein (Centre de microbiologie et de tumorbiologie, Institut Karolinska, Stockholm) pour la révision du manuscrit et Sachi Takemoto et Ai Kitamura pour une assistance technique habile.